一种人工催芽方法及白芨育苗方法

摘要

本发明提供了一种人工催芽方法，步骤包括：(1)将种子接种于培养基中培养，所述培养基包含质量百分比为0.1‑2.0％的刺槐豆胶；(2)将解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus)YUPP‑1接种于培养基上，降解培养基；并提供了该方法在白芨育苗中的应用，步骤包括：在经过上述方法催芽后，在地面上铺基质，再在厢面上撒白芨共生菌即得苗床，将白芨芽播种至苗床上培养育苗。该人工催芽方法解决了种苗根部携带的固体培养基无法洗净的问题，显著提高苗的成活率；将该人工催芽方法用于白芨并进一步进行规模化快速育苗，使成活率提高至95％以上，移栽大田无死苗现象及缓苗期，可提前4‑6个月左右成苗，操作简单、适合规模化生产，对兰科药用植物的人工大规模种植具有重要的指导意义。

权利要求

1.一种人工催芽方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)将白芨种子接种于培养基中培养，所述培养基包含质量百分比为0.1-2.0％的刺槐豆胶；

(2)将解木聚糖类芽孢杆菌接种于培养基上，降解培养基，所述解木聚糖类芽孢杆菌的保藏号为CCTCC  NO:M  209014，命名为解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus)YUPP-1。

2.如权利要求1所述的人工催芽方法，其特征在于：步骤(1)所述培养基为1/2MS培养基中添加土豆泥、活性炭、琼脂、NAA、6-BA及刺槐豆胶，使土豆泥的浓度为10-100g/L，活性炭的浓度为0.1-2g/L，琼脂的质量百分比为0.1-1％，NAA的浓度为1.0-1.2mg/L，6-BA的浓度为0.5-1.0mg/L，刺槐豆胶的质量百分比为0.1-2.0％。

3.如权利要求2所述的人工催芽方法，其特征在于：步骤(1)所述培养基的pH值为5.5-

6.0。

4.一种应用了权利要求1所述的人工催芽方法的白芨育苗方法，其特征在于：包括以下步骤：a采用权利要求1所述的人工催芽方法对白芨进行催芽；

b在地面上铺基质，再在厢面上撒白芨共生菌即得苗床，将白芨芽播种至苗床上培养育苗；所述白芨共生菌的获得方法包括如下步骤：将消毒的白芨块茎在培养基上于23-27℃下培养3-5天，将菌丝定殖于白芨块茎内，选取不会导致白芨无菌苗死亡的菌丝，即为白芨共生菌。

5.如权利要求4所述的应用了人工催芽方法的白芨育苗方法，其特征在于：步骤b所述培养基的配制方法包括：将白芨块茎在水中煮20-30min后过滤得到滤液，向将PDA培养基中添加所得滤液、琼脂，使滤液质量百分比为0.1-0.3％，琼脂质量百分比为1.0-1.4％，灭菌后冷却到40-50℃，在培养基中添加卡拉霉素和氨苄青霉素，使其终浓度分别为20-30μg/mL和95-105μg/mL，混匀，凝固。

6.如权利要求5所述的应用了人工催芽方法的白芨育苗方法，其特征在于：步骤b所述在厢面上撒白芨共生菌为使每克基质中菌含量达108-109个孢子。

7.如权利要求5所述的应用了人工催芽方法的白芨育苗方法，其特征在于：步骤b所述消毒的方法包括如下步骤：将白芨块茎洗净后浸泡于酒精中漂洗，将白芨切块后转入4％的次氯酸钠溶液中，消毒8-15min后用无菌水漂洗。

8.如权利要求4所述的应用了人工催芽方法的白芨育苗方法，其特征在于：步骤b所述基质中氮含量为1.0-2.0g/kg，磷含量为0.5-2.0g/kg，钾含量为0.5-2.0g/kg，有机质质量百分比为40-70％。

说明书

一种人工催芽方法及白芨育苗方法

技术领域

[0001] 本发明属于农业科技技术领域，特别是涉及一种人工催芽方法及白芨育苗方法。

背景技术

[0002] 白芨，即Bletilla sfriata(Thunb.)Reiehb.f.，为陆生型兰科植物，其主要药用部分为干燥的白芨块茎，主含白芨胶，其含量高达50％。首先，白芨胶对皮肤无毒无刺激作用，是绿色安全产品；其次，白芨胶具有止血补肺、生肌止痛等功效，用于治疗内外伤出血，疮疡肿毒，促进皮肤修复具有奇效，是云南白药、葵花胃康灵、创口贴等药物的主要原料；再者，白芨胶还具有清除体内自由基、延缓皮肤衰老的功效，在化妆品行业具有广泛用途；最后，白芨胶具有很高的粘稠特性，可做为增稠剂、悬浮剂、助乳化剂等作用，在食品行业具有广泛的用途。全国每年需求白芨干品约2000-3000吨，而每年现实供应量仅有300吨左右，缺口巨大，导致白芨价格年年攀升，现在白芨干品接近800元/kg。

[0003] 白芨及其它兰科植物的种子构造简单,成熟时为原胚阶段,非常细小且无胚乳，多数种子无萌发所需的营养贮存组织,自然状态下很难萌芽成苗，只有当白芨种子落在阴暗、潮湿且含有共生菌环境才能顺利萌芽成苗。随着白芨价格高企，野生资源逐渐被采挖而接近枯竭，这反过来又助长了白芨价格的进一步攀升。目前白芨种植业面临的最大难关在于种苗严重短缺。

[0004] 白芨的自然繁殖是以分株繁殖为主，种植两年生的假鳞茎只能长1个新的假鳞茎，第三年增长2个，第四年再增长4个，其繁殖周期长，繁殖效率低，很难满足大量栽培的需要。同时由于连续分芽繁殖3代后，第1代的母球茎就很难再萌芽，这给以传统分株的育苗方式带来较大困难，实际生产中有些母球茎不能萌芽生长。

[0005] 通过组培方式以白芨种子为基础育出的无菌苗是目前能大量供白芨苗的主 要方式。但组培无菌苗最大难关在于种苗根部携带的琼脂固体培养基无法洗干净，导致人工驯化过程中受病菌感染的死亡率很高，白芨苗的成活率低，难以满足白芨产业发展的需要。因此，加强白芨高质量种苗的培育至关重要。

[0006] 也有实验做直播育苗的，但直播苗的条件要求相当苛刻，需要共生菌接种，以及合适的温度、湿度和pH值。直播苗缺陷在于萌芽率低于10％，且萌芽所需时间长，约需3-4个月才能萌芽分化出芽，长成5-10cm的苗需要1年半时间。

发明内容

[0007] 有鉴于此，本发明提供了一种人工催芽方法及白芨育苗方法，该人工催芽方法解决了种苗根部携带的固体培养基无法洗净的问题，且育苗方法的成活率高，育苗时间短。

[0008] 本发明第一方面提供了一种人工催芽方法，包括以下步骤：

[0009] (1)将种子接种于培养基中培养，所述培养基包含质量百分比为0.1-2.0％的刺槐豆胶；

[0010] (2)将解木聚糖类芽孢杆菌接种于培养基上，降解培养基，所述解木聚糖类芽孢杆菌于2009年1月8日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 209014，命名为解木聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1。

[0011] 解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1的菌学特性：

[0012] 革兰氏染色阳性或阴性，杆状，大小为0.3-0.8×3-5μm，适宜生长温度为20-30℃，兼性厌氧，产椭圆形芽孢，芽孢端生。盐离子浓度高于1％不利于其生长繁殖。其在肉汤固体培养基表面菌落污白色，表面湿润光滑。

[0013] 本发明第二方面提供了应用了上述人工催芽方法的白芨育苗方法，包括以下步骤：

[0014] (1)采用上述人工催芽方法对白芨进行催芽；

[0015] (2)在地面上铺基质，再在厢面上撒白芨共生菌即得苗床，将白芨芽播种至苗床上培养育苗；所述白芨共生菌的获得方法包括如下步骤：将消毒的白芨块茎在培养基上于23-27℃下培养3-5天，将菌丝定殖于白芨块茎内，选取不会导致白芨无菌苗死亡的菌丝，即为白芨共生菌。

[0016] 本发明的有益效果是：本发明提供的人工催芽方法通过在催芽的培养基中添加刺槐豆胶，并在催芽完成后添加解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1使该特殊培养基可以完全液化，解决了种苗根部携带的固体培养基无法洗净的问题，显著提高苗的成活率；将该人工催芽方法用于白芨并进一步进行规模化快速育苗，克服了组培方式育苗的移栽成活率不高的缺陷，使成活率由50％以下提高至95％以上，效果明显，移栽大田无死苗现象及缓苗期，同时明显缩短直播苗的育苗时间，可提前4-6个月左右成苗，且操作简单、适合规模化生产、降低了育苗成本、提高了育苗速度与效率，对兰科药用植物的人工大规模种植具有重要的指导意义。

具体实施方式

[0017] 本发明第一方面提供了一种人工催芽方法，包括以下步骤：

[0018] (1)将种子接种于培养基中培养，所述培养基包含质量百分比为0.1-2.0％的刺槐豆胶；

[0019] (2)将解木聚糖类芽孢杆菌接种于培养基上，降解培养基，所述解木聚糖类芽孢杆菌于2009年1月8日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 209014，命名为解木聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1。

[0020] 通过在催芽的培养基中添加适量的刺槐豆胶，并在催芽完成后添加解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1使该特殊培养基可以完全液化，解决了种苗根部携带的固体培养基无法洗净的问题，显著提高苗的成活率。

[0021] 优选的，步骤(1)所述培养基为1/2MS培养基中添加土豆泥、活性炭、琼脂、NAA、6-BA及刺槐豆胶，使土豆泥的浓度为10-100g/L，活性炭的浓度为0.1-2g/L，琼脂的质量百分比为0.1-1％，NAA的浓度为1.0-1.2mg/L，6-BA的浓 度为0.5-1.0mg/L，刺槐豆胶的质量百分比为0.1-2.0％。该培养基配方提供种子萌发所需的营养物质，在该培养基下进行催芽处理的种子在萌发率及幼苗生长状态上表现最佳。

[0022] 进一步优选的，步骤(1)所述培养基的pH值为5.5-6.0。该pH值下有利于种子萌发。

[0023] 优选的，步骤(1)所述种子为兰科植物种子。

[0024] 本发明第二方面提供了应用了上述人工催芽方法的白芨育苗方法，包括以下步骤：

[0025] (1)采用上述人工催芽方法对白芨进行催芽；

[0026] (2)在地面上铺基质，再在厢面上撒白芨共生菌即得苗床，将白芨芽播种至苗床上培养育苗；所述白芨共生菌的获得方法包括如下步骤：将消毒的白芨块茎在培养基上于23-27℃下培养3-5天，将菌丝定殖于白芨块茎内，选取不会导致白芨无菌苗死亡的菌丝，即为白芨共生菌。

[0027] 优选的，步骤(2)所述培养基的配制方法包括：将白芨块茎在水中煮透后过滤得到滤液，向将PDA培养基中添加所得滤液、琼脂，使滤液质量百分比为0.1-0.3％，琼脂质量百分比为1.0-1.4％，灭菌后冷却到40-50℃时，在培养基中添加卡拉霉素和氨苄青霉素，使其终浓度分别为20-30μg/mL和95-105μg/mL，混匀，凝固。采用该配方的培养为具有选择性的培养基，可以避免杂菌的生长，利于得到较纯的菌丝。

[0028] 进一步优选的，步骤(2)所述在厢面上撒白芨共生菌为使每克基质中菌含量达108-109个孢子。

[0029] 进一步优选的，步骤(2)所述消毒的方法包括如下步骤：将白芨块茎洗净后浸泡于酒精中漂洗，将白芨切块后转入4％的次氯酸钠溶液中，消毒8-15min后用无菌水漂洗。

[0030] 优选的，步骤(2)所述基质中氮含量为1.0-2.0g/kg，磷含量为0.5-2.0g/kg， 钾含量为0.5-2.0g/kg，有机质质量百分比为40-70％。

[0031] 下面将结合实施例对本发明提供的一种人工催芽方法及白芨育苗方法予以进一步说明。

[0032] 实施例1

[0033] 地点选在湖北省钟祥市官庄湖农场内完成本实施例，该农场位于北纬30°左右，海拔约为200m，地势相对平坦，建有标准化的可控温室3000m2，内铺设苗床16行，每行苗床宽2m，长70m，温室东西向和上面均需用6针密度的遮阳网遮阳，遮光率达到90-95％。

[0034] 将白芨种子在实验室内进行人工催芽，具体步骤包括：

[0035] (1)白芨种子的贮藏与消毒：白芨果荚在10-11月采收后，用塑料薄膜袋封装密闭，贮藏于4℃冰箱，该种方法可使白芨种子能存活6-9个月。白芨果荚消毒过程应在超净工作台上完成，先用自来水冲洗干净，然后用无菌滤纸将果荚表面残留的水吸干，然后浸泡于75％酒精中漂洗2-3min进行表面消毒，再将果荚转入4％的次氯酸钠溶液中切开，获取白芨种子，去除果荚壳，消毒10min后，在超净工作台上将白芨种子转移至灭菌的50mL离心管中，盖上盖，待平衡后于8000rpm离心5min，在超净工作台上倾弃8％的次氯酸钠溶液；在离心管中再加入75％酒精30mL，用灭菌枪头吹打匀白芨种子，消毒2min，8000rpm离心5min，在超净工作台上倾弃上清，再用灭菌去离子水依上述方法漂洗3次，倾弃上清最后留下白芨种子，即为消毒好的白芨种子。

[0036] (2)配制适合催芽的培养基：1/2MS培养基中添加土豆泥、活性炭、琼脂、NAA、6-BA及刺槐豆胶，使土豆泥的浓度为100g/L，活性炭的浓度为0.5g/L，琼脂的质量百分比为0.1％，NAA的浓度为1.0mg/L，6-BA的浓度为0.5mg/L，刺槐豆胶的质量百分比为0.5％。

[0037] 所述1/2MS培养基指大量元素和钙盐含量减半的MS培养基。本实施例采用的1/2MS培养基配制方法如下：取大量元素母液25ml，钙盐母液25ml，微量元素母液10ml，维生素母液10ml，铁盐母液5ml，加肌醇0.1g，蔗糖或白砂糖20—30g，蒸馏水定容至1L。

[0038] 其中，大量元素母液配制方法为：NH4NO316.5g；MgSO4·7H2O 3.7g；KH2PO4 1.7g；KNO319g，加水溶解，定容至500ml；

[0039] 钙盐母液配制方法为：CaCl23.32g，加水溶解，定容至500ml；

[0040] 微量元素母液配制方法为：KI 0.0415g；Na2MoO4·2H2O 0.0125g；H3BO30.31g；CuSO4·5H2O 0.00125g；MnSO4·H2O 0.845g；CoCl2·6H2O 0.00125g；ZnSO4·7H2O 0.43g，加水溶解，定容至500ml；

[0041] 铁盐母液配制方法为：EDTA二钠3.725g，加100ml水加热溶解，FeSO4·7H2O 2.785g，加100ml水溶解后两者混匀，加水配成500ml；

[0042] 维生素母液配制方法为：盐酸吡哆醇(VB6)0.025g；盐酸硫胺素(VB1)0.025g；烟酸0.025g，甘氨酸0.1g，加水溶解，定容至500ml。

[0043] (3)白芨种子的催芽：对消毒后的白芨种子加入一定量无菌水，按1个果荚20mL无菌水的比例兑水，用灭菌的钢勺搅匀种子，然后每瓶放入2勺种子液于催芽固体培养基表面，大约500-1000粒种子，轻摇培养基至种子均匀分布于培养基表面；用黑色塑料袋罩住，在25-28℃下暗培养10天，使含种胚细胞吸收营养膨胀萌芽，种子变绿。然后改用模拟自然的交替光照条件，即白天利用日光灯管使光照强度达到1500lx外加自然散射光，夜晚保持黑暗，经过30天左右，白芨苗分化出1-2叶。

[0044] 完成催芽后，进一步进行白芨育苗，具体步骤包括：

[0045] (1)培养基液化与取苗：首先，过夜活化降解刺槐豆胶的菌株——解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1，按1％接种量接种培养20h后，然后按5％接种量接种于白芨种子催芽的培养基上，浓度约为1×108cfu/mL，静置培养24h，刺槐豆胶被分解后固体培养基液化，用水将分化出1-2片叶子的白芨芽冲倒到纱布上，洗去多余的养分，即为可播种的白芨芽。

[0046] (2)苗床制备：将地面整平，然后在上面铺基质营养土，所述基质的N、P、k、有机质含量分别为：1.5g/kg、1.5g/kg、1.0g/kg、50％，基质厢面宽1.5-2m，高10-15cm，长度可根据地块决定。在苗床铺白芨芽前，厢面上需再撒上一层白芨共生菌，与干燥基质混合均匀，使菌含量达到1×108孢子/g，然后撒于厢面上，然后以水雾状喷头将厢面整个喷透。

[0047] 所述白芨共生菌按以下步骤得到：

[0048] 首先，将白芨块茎消毒，具体方法包括：将白芨块茎洗净，然后在超净工作台上，将其浸泡于75％酒精中漂洗10min，将白芨转入4％的次氯酸钠溶液中切成0.5cm(长)×0.5cm(宽)×0.3cm(高)的小块，消毒10min后，用无菌水漂洗3次，再用无菌滤纸将白芨块表面残留的水吸干，即为消毒好的的白芨内生真菌分离材料。

[0049] 然后，制备平板培养基，具体方法包括：将白芨块茎在等质量的水中煮透，过滤得到滤液，向将PDA培养基中添加所得滤液、琼脂，使滤液质量百分比为0.2％，琼脂质量百分比为1.2％，灭菌后冷却到45℃时，在培养基中添加卡拉霉素和氨苄青霉素，使其终浓度分别为25μg/mL和100μg/mL，混匀，倒平板待平板凝固后备用。

[0050] 所述PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000Ml。

[0051] 最后，进行接种，具体方法包括：将消毒的白芨块贴到上述平板培养基表面，25℃下培养4天，纯化长出的菌丝，选择最先萌发生长，前端生长整齐，不带红、黄绿等明显杂菌的菌丝，然后将菌丝接种到白芨无菌苗上，能顺利定殖于白芨块茎内且不会导致白芨苗死亡的菌丝即为所需白芨共生菌。

[0052] 采用以上方法筛选得到的白芨共生菌均对白芨生长均具有促进作用，经鉴定，本实施中得到的白芨共生菌为丝核菌属与非致病性镰刀菌各50％。

[0053] (3)苗床铺苗：在铺苗前一天，用水将苗床喷透，铺苗时，用水将洗净的白芨苗稀释，然后用瓢泼浇到苗床上，大致种芽播种密度为500-1000颗/平米。在1个月以内每天用喷头喷雾1小时使厢面保持湿润，空气中湿度保持在80％以上，每次喷雾后地面不可有明显积水，温棚内温度控制在18℃-28℃之间。

[0054] (4)苗床水分管理：在苗床铺苗后，要每天喷水，将苗床湿透，但不可有明显积水；棚内温度控制在18℃-28℃；在15天内保持苗床湿度达到100％，待苗定植站立后，可适当减少水分喷雾的次数，这时，可保持厢面湿度在80-90％即可。

[0055] 苗床营养管理：在白芨芽定植后，每间隔10天，用尿素质量百分比1％、磷酸二氢钾质量百分比0.5％、白糖质量百分比0.5％的水溶液进行喷雾，每次喷雾后地面不可有明显积水，使其快速发育成苗。

[0056] 苗床杂草防除：由于天天浇水，苗床上湿度较大，要注意水生杂草的生长，及时拔除这些杂草，以免争夺养分。

[0057] 采用本实施例提供的人工催芽方法，经过30天，白芨苗即可分化出1-2叶，通过接入解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1作为培养基分解菌，使催芽培养基被液化，直接用水冲洗幼苗即可除去种苗根部的培养基，可得到用于播种的幼苗，简单方便，克服了常规技术中由于种苗根部携带的固体培养基无法洗干净，导致人工驯化过程中受病菌感染使死亡率高的缺陷。采用该方法催芽，然后结合共生菌苗床，成活率达到了95％以上，相比于常规育苗方法有明显提高。采用常规育苗方法长成5-10cm的苗需要1年半时间，而本实施例中，移栽大田无死苗现象及缓苗期，苗床中培养6-9个月即得到株高10cm左右的白芨苗，育苗时间明显缩短，操作简单、适合规模化生产、降低了育苗成本、提高了育苗速度与效率。实施例2[0058] 实施例2与实施例1基本相同，区别在于：

[0059] 本实施例中，将白芨种子在实验室内进行人工催芽，所用到的培养基为：1/2MS培养基中添加土豆泥、活性炭、琼脂、NAA、6-BA及刺槐豆胶，使土豆泥的浓度为10g/L，活性炭的浓度为2.0g/L，琼脂的质量百分比为1.0％，NAA的浓度为1.2mg/L，6-BA的浓度为1.0mg/L，刺槐豆胶的质量百分比为2.0％，pH值6.0。

[0060] 在育苗阶段中，苗床按如下方法进行制备：将地面整平，然后在上面铺基质营养土，所述基质的N、P、k、有机质含量分别为：1.0g/kg、0.5g/kg、0.5g/kg、70％，基质厢面宽2m，高15cm，长度可根据地块决定。在苗床铺白芨芽前，厢面上需再撒上一层白芨共生菌，与干燥基质混合均匀，使菌含量达到1×109孢子/g，然后撒于厢面上，然后以水雾状喷头将厢面整个喷透。

[0061] 所述白芨共生菌按以下步骤得到：

[0062] 首先，将白芨块茎消毒，具体方法包括：将白芨块茎洗净，然后在超净工作台上，将其浸泡于75％酒精中漂洗10min，将白芨转入4％的次氯酸钠溶液中切成0.5cm(长)×0.5cm(宽)×0.3cm(高)的小块，消毒15min后，用无菌水漂洗3次，再用无菌滤纸将白芨块表面残留的水吸干，即为消毒好的的白芨内生真菌分离材料。

[0063] 然后，制备平板培养基，具体方法包括：将白芨块茎在等质量的水中煮透，过滤得到滤液，向将PDA培养基中添加所得滤液、琼脂，使滤液质量百分比为0.3％，琼脂质量百分比为1.4％，灭菌后冷却到50℃时，在培养基中添加卡拉霉素和氨苄青霉素，使其终浓度分别为30μg/mL和105μg/mL，混匀，倒平板待平板凝固后备用。

[0064] 最后，进行接种，具体方法包括：将消毒的白芨块贴到上述平板培养基表面，23℃下培养5天，纯化长出的菌丝，选择最先萌发生长前段生长整齐，不带红、黄绿等明显杂菌的菌丝，然后将菌丝接种到白芨无菌苗上，不会导致白芨苗死亡，且菌丝能顺利定殖于白芨块茎内，即为所需白芨共生菌。

[0065] 实施例3

[0066] 实施例3与实施例1基本相同，区别在于：

[0067] 本实施例中，将白芨种子在实验室内进行人工催芽，所用到的培养基为：1/2MS培养基中添加土豆泥、活性炭、琼脂、NAA、6-BA及刺槐豆胶，使土豆泥的浓度为60g/L，活性炭的浓度为1.2g/L，琼脂的质量百分比为0.5％，NAA的浓度为1.1mg/L，6-BA的浓度为0.8mg/L，刺槐豆胶的质量百分比为1.5％，pH值5.8。

[0068] 在育苗阶段中，苗床按如下方法进行制备：将地面整平，然后在上面铺基质营养土，所述基质的N、P、k、有机质含量分别为：2.0g/kg、2.0g/kg、2.0g/kg、40％，基质厢面宽2m，高15cm，长度可根据地块决定。在苗床铺白芨芽前，厢面上需再撒上一层白芨共生菌，与干燥基质混合均匀，使菌含量达到1×108孢子/g，然后撒于厢面上，然后以水雾状喷头将厢面整个喷透。

[0069] 所述白芨共生菌按以下步骤得到：

[0070] 首先，将白芨块茎消毒，具体方法包括：将白芨块茎洗净，然后在超净工作台上，将其浸泡于75％酒精中漂洗10min，将白芨转入4％的次氯酸钠溶液中切成0.5cm(长)×0.5cm(宽)×0.3cm(高)的小块，消毒15min后，用无菌水漂洗3次，再用无菌滤纸将白芨块表面残留的水吸干，即为消毒好的的白芨内生真菌分离材料。

[0071] 然后，制备平板培养基，具体方法包括：将白芨块茎在等质量的水中煮透， 过滤得到滤液，向将PDA培养基中添加所得滤液、琼脂，使滤液质量百分比为0.1％，琼脂质量百分比为1.2％，灭菌后冷却到48℃时，在培养基中添加卡拉霉素和氨苄青霉素，使其终浓度分别为28μg/mL和98μg/mL，混匀，倒平板待平板凝固后备用。

[0072] 最后，进行接种，具体方法包括：将消毒的白芨块贴到上述平板培养基表面，24℃下培养4天，纯化长出的菌丝，选择最先萌发生长前段生长整齐，不带红、黄绿等明显杂菌的菌丝，然后将菌丝接种到白芨无菌苗上，不会导致白芨苗死亡，且菌丝能顺利定殖于白芨块茎内，即为所需白芨共生菌。

[0073] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。