一种提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法

摘要

本发明公开了一种提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法，包括：将离体的东南景天植株切成含有完整腋芽的茎段，浸入无菌秋水仙素溶液中，密封避光，并放入温度为25℃±1℃的摇床中振荡；取出处理后的离体带腋芽茎段经无菌水冲洗后接种于分化培养基上，培养至腋芽处长出丛生芽；将丛生芽接种于生根培养基中，生根培养为完整植株；取完整植株的嫩叶在流式细胞仪上检测所获得株系的倍性，选择变异植株；取变异植株，切成茎段，在生根培养基中培养获得无菌苗；变异植株与对照株在加镉的培养基中进行镉处理，检测其体内镉积累量。本发明通过诱导东南景天染色体加倍，再经过检测获得加倍材料，提高东南景天对重金属的超积累能力。

权利要求

1.一种提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将离体的东南景天植株切成含有完整腋芽的茎段，浸入无菌秋水仙素溶液中，密封避光，并放入温度为25℃±1℃的摇床中振荡20～24h，所述秋水仙素溶液的质量浓度为

0.1-0.2％；

(2)取出步骤(1)处理后的离体带腋芽茎段，经无菌水冲洗后接种于分化培养基上，培养至腋芽处长出丛生芽，所述分化培养基的组成为：基础培养基MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH 5.8；

(3)将所得的丛生芽接种于生根培养基中，进行生根培养，所述生根培养基的组成为：

1/2MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2,4-D，pH5.8；

(4)取生根培养后的完整植株的嫩叶在流式细胞仪上检测所获得株系的倍性，选择染色体倍性增加的变异植株；

(5)取变异植株，切成茎段，在生根培养基中培养获得无菌苗。

2.根据权利要求1所述提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法，其特征在于，步骤(4)中倍性检测的方法包括如下步骤：(1)取嫩叶片放在预冷的培养皿中，加入预冷的OttoI，切碎，解离；

(2)吸取步骤(1)培养皿中的解离液，用400目滤膜过滤到离心管中，于3～5℃孵育3～

5min；

(3)离心弃去上清液，加入预冷的OttoI，再加入OttoII，最后加入预冷PI染液，置于3～

5℃条件下避光染色8～10min；OttoI、OttoII和PI染液的体积比为1:4:5；

(5)移至上样管，上流式细胞仪检测。

3.根据权利要求2所述提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法，其特征在于，所述OttoI的组成为：0.1mol/L柠檬酸，体积比浓度为0.5％的Tween20，pH 2.0-3.0；

所述OttoII的组成为：0.4mol/L十二水磷酸氢二钠，pH 2.0-3.0。

4.根据权利要求2所述提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法，其特征在于，所述PI染液的浓度为0.05mg/ml，每ml染液加入250μg RNA酶。

5.根据权利要求1所述提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法，其特征在于，当步骤(3)中的植株长到5cm高后，上流式细胞仪上检测检测。

说明书

一种提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物修复土壤重金属污染领域，具体涉及到一种利用染色体加倍改良锌镉超积累植物东南景天基因型的方法。

背景技术

[0002] 近年来土壤镉污染日益严重，土壤中的镉通过植物(或植物到动物)进入人体，危害人类的健康。如何治理和减轻土壤中的镉污染，成为目前急需解决的问题。植物修复是一种比较环保有前途的方式。东南景天是一种锌镉超积累植物，能够将锌镉较多的吸收积累至地上部，从而减轻土壤重金属污染。但是，东南景天的生物量相对较低，虽然相对积累量高，仍难以满足植物修复的需求。如何利用这一优良资源，提高污染土壤植物修复效率尤为重要。

[0003] 例如，公开号为CN101444185A的中国发明专利申请文献公开了一种重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，其特征是采用叶片愈伤组织诱导法，将东南景天叶片消毒，切去叶缘、叶脉和叶柄，切成0.2～0.3cm的小片，接种到已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8诱导培养基上，将培养瓶放入温度为±25℃，无光照的培养箱中1～2周诱导愈伤组织，将愈伤组织转移至已灭菌的玻璃培养瓶装的pH为5.5～5.8分化培养基中，再将培养瓶放入温度为±25℃，每天保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养40～50天，得到3～5cm高带有1cm以上幼根的幼苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，加入少许蒸馏水放置2～3天后，用水洗去培养基，移栽至蛭石：珍珠岩比例3∶1的基质，或有机质基质中，2～4周得到种苗。

[0004] 公开号为CN 1973617A的中国发明专利申请文献公开了一种重金属超积累植物东南景天种苗的繁殖方法，采用茎段扦插法，将东南景天剪成3cm以上带腋芽的茎段，直接扦插到到受重金属污染的土壤中，按传统农耕法管理生长，待植物生长至15cm～30cm收割地上部，作为种苗再次被剪成3cm以上带腋芽的茎段，扦插到污染环境的土壤中；或者将东南景天剪成3cm以上带腋芽的茎段，直接扦插到育苗基质或营养液中，按传统农耕法管理生长，得到种苗。

发明内容

[0005] 本发明提供一种提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法，通过诱导东南景天染色体加倍，再经过检测获得加倍材料，提高东南景天对重金属的超积累能力。

[0006] 一种提高超积累植物东南景天对重金属超积累能力的方法，包括如下步骤：

[0007] (1)将离体的东南景天植株切成含有完整腋芽的茎段，浸入无菌秋水仙素溶液中，密封避光，并放入温度为25℃±1℃的摇床中振荡；

[0008] (2)取出步骤(1)处理后的离体带腋芽茎段经无菌水冲洗后接种于分化培养基上，培养至腋芽处长出丛生芽；

[0009] (3)将所得的丛生芽接种于生根培养基中，进行生根培养；

[0010] (4)取生根培养后的完整植株的嫩叶在流式细胞仪上检测所获得株系的倍性，选择变异植株；

[0011] (5)取变异植株，切成茎段，在生根培养基中培养获得无菌苗。

[0012] 将变异植株即无菌苗与对照株在加镉的培养基中进行镉处理，检测其体内镉积累量。

[0013] 东南景天的超积累效应得益于其特异基因的表达，染色体的加倍能使这些基因相对过表达，从而提高修复效果；同时，加倍后会使其茎秆粗壮，生物量增大。

[0014] 人工诱导染色体加倍的方法中，秋水仙素加倍技术比较简单有效，使用最多。秋水仙素是一种从百合科植物秋水仙中提取出来生物碱，能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。加倍后的多倍体通常具有更强的抗逆性与适应性。东南景天以无性繁殖为主，能从叶腋处长出大量腋芽，快速繁殖。叶腋是东南景天分裂旺盛的组织区域，以秋水仙素处理，效果最好。

[0015] 优选地，所述秋水仙素溶液的质量浓度为0.1～0.2％。最优选为0.2％。

[0016] 优选地，步骤(1)中在摇床中震荡培养24-72h。进一步优选24h。

[0017] 优选地，所述分化培养基的组成为：基础培养基MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH 5.8。优选地，所述生根培养基的组成为：1/2MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2,4-D，pH5.8。

[0018] 优选地，步骤(4)中倍性检测的方法包括如下步骤：

[0019] (1)取嫩叶片放在预冷的培养皿中，加入预冷的OttoI，切碎，解离；

[0020] (2)吸取步骤(1)培养皿中的解离液，用400目滤膜过滤到离心管中，于3～5℃孵育3～5min；

[0021] (3)离心弃去上清液，加入预冷的OttoI，再加入OttoII，最后加入预冷PI染液，置于3～5℃条件下避光染色8～10min；OttoI、OttoII和PI染液的体积比为1:4:5；

[0022] (5)移至上样管，上流式细胞仪检测。

[0023] 进一步地：OttoI的组成为：0.1mol/L柠檬酸，0.5％(v/v)Tween20，pH 2.0-3.0，4℃保存；OttoII的组成为：0.4mol/L十二水磷酸氢二钠，pH 2.0-3.0，常温保存；PI(碘化丙啶)染液浓度为0.05mg/ml，每ml加入250μg RNA酶，锡纸包裹，避光，4℃保存。

[0024] 步骤(4)中倍性检测的方法更进一步地，具体步骤为：

[0025] 1)取约0.5g叶片放在预冷的培养皿中，加入1ml预冷的OttoI，用锋利的刀片一次性快速切碎；

[0026] 2)吸取培养皿中的解离液，用400目滤膜过滤到1.5ml离心管中，于4℃冰箱孵育5min；

[0027] 3)离心，转速1000r/min，温度4℃，时间5min；

[0028] 4)弃去上清液，加入预冷的OttoI 20μl，再加入OttoII 80μl，最后加入100μl预冷的碘化丙啶PI染液，每个样共约200μl细胞核悬浮液。置于4℃冰箱，避光染色10min；

[0029] 5)移至上样管，上机检测。

[0030] 优选地，当步骤(3)中的植株长到5cm高后，上流式细胞仪上检测。

[0031] 本发明方法处理条件简单易控制，重复性高，省时省力。

附图说明

[0032] 图1A为Otto’s提取、PI染液染色后流式细胞仪检测东南景天叶片相对DNA含量分布直方图，图1B为Otto’s提取、PI染液染色后流式细胞仪检测加倍东南景天叶片相对DNA含量分布直方图。

[0033] 图2为东南景天植株比较图，图2A为对照植株形态图，图2B为倍性增加植株形态图。

[0034] 图3为用Otto’s提取PI染色后，显微镜下观察到的细胞核。

[0035] 图4为镉胁迫下东南景天对照植株与倍性增加植株体内镉含量。

[0036] 图5A为Tris.MgCl2提取剂提取、PI染液染色后流式细胞仪检测东南景天叶片相对DNA含量分布直方图，图5B为Tris.MgCl2提取剂提取、PI染液染色后流式细胞仪检测加倍东南景天叶片相对DNA含量分布直方图。

具体实施方式

[0037] 实施例1

[0038] (1)无菌苗的获得：取东南景天上半段植株经流水冲洗20分钟后，用75％的乙醇浸泡杀菌60s，再置于0.1％的HgCl2消毒5min，用无菌水冲洗4-5次后，将其平放在高压灭菌过的滤纸上，用无菌手术刀将片切成小块，然后接入MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA的培养基上继代培养，生长一段时间后获得大量丛生芽，再转入1/2MS+
8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2,4-D的培养基中进行生根培养，获得大量的无菌苗供实验选用。

[0039] (2)秋水仙素加倍：选取健壮无菌苗放在无菌滤纸上，用无菌手术刀把大叶片切去一半，再将茎杆切成茎段，茎段上包含完整腋芽，然后放入高压灭菌过的0.2％的秋水仙素溶液中浸泡。将盛装离体带腋芽茎段和秋水仙素溶液的锥形瓶用封口膜和橡皮筋进行封口，保证其与外界隔离，用锡纸包裹避光，放入温度为25℃±1℃的摇床中振荡24h，转速为100rpm。

[0040] (3)增殖培养：在超净工作台上，将处理过的带腋芽茎段取出，无菌水冲洗4-5遍，再用无菌滤纸吸干残留水分，接种于MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA的培养基中，注意形态学上端朝上插入培养基，在温度25℃，光强为1500lx组培专用LED灯下光照16h，直到长出大量腋芽。

[0041] (4)生根培养：为了快速繁殖并获得大量植株，将腋芽切出，接种于1/2MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2,4-D培养基中生根生长。

[0042] (5)倍性检测：培养约一个月，取嫩叶制样在流式细胞仪上检测所获得株系的倍性，此时的诱变率能达27.3％。

[0043] 具体步骤为：

[0044] 1)取约0.5g叶片放在预冷的培养皿中，加入1ml预冷的OttoI，用锋利的刀片一次性快速切碎；

[0045] 2)吸取培养皿中的解离液，用400目滤膜过滤到1.5ml离心管中，于4℃冰箱孵育5min；

[0046] 3)离心，转速1000r/min，温度4℃，时间5min；

[0047] 4)弃去上清液，加入预冷的OttoI 20μl，再加入OttoII 80μl，最后加入100μl预冷的碘化丙啶PI染液，每个样共约200μl细胞核悬浮液，置于4℃冰箱，避光染色10min；

[0048] 5)移至上样管，上机检测。

[0049] OttoI的组成为：0.1mol/L柠檬酸，0.5％(v/v)Tween20，pH 2.0-3.0，4℃保存；OttoII的组成为：0.4mol/L十二水磷酸氢二钠，pH 2.0-3.0，常温保存；PI(碘化丙啶)染液浓度为0.05mg/ml，每ml加入250μg RNA酶，锡纸包裹，避光，4℃保存。

[0050] 用Otto’s提取PI染色后，显微镜下观察到的细胞核如图3所示。

[0051] (6)扩繁：将已确定了的倍性增加植株大量扩繁，切成茎段，在1/2MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2,4-D培养基中培养，保存无菌苗。

[0052] 图1A为流式细胞仪检测东南景天叶片相对DNA含量分布直方图；图1B为流式细胞仪检测加倍东南景天叶片相对DNA含量分布直方图。

[0053] 图2为东南景天植株比较图，图2A为对照植株形态图，图2B为倍性增加植株形态图。

[0054] 利用流式细胞仪对植物细胞倍性进行检测，对照植物有四个峰，说明未经秋水仙素加倍的东南景天本身体内含有四种DNA含量的细胞，即其本身就是混倍体。对变异株进行DNA含量测定，发现有五个峰，染色体的倍性增加，但其仍是混倍体。在外部形态上，变异株比对照的茎秆粗壮，叶片厚实，根系发达。组培条件下倍性增加的苗明显壮于对照苗，生物量大。组培条件下，同高度的苗，倍性增加苗的重量约是对照的2-3倍。

[0055] 图5A为Tris.MgCl2提取剂提取、PI染液染色后流式细胞仪检测东南景天叶片相对DNA含量分布直方图，图5B为Tris.MgCl2提取剂提取、PI染液染色后流式细胞仪检测加倍东南景天叶片相对DNA含量分布直方图。用Tris.MgCl2提取剂提取，用PI染色，经流式细胞仪分析，有些峰不是很明显，且有很多的背景碎片。相比，Otto’s提取方法效果更好。

[0056] Tris.MgCl2：0.2mol/L Tris，4mmol/L六水氯化镁，0.5％(v/v)Triton X-100，pH 7.5，4℃保存。

[0057] 实施例2

[0058] (1)镉处理：选择长势相同的倍性增加苗与对照，移入MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2,4-D培养基中，培养基中镉的浓度分别为0,50,100,200μM，每个处理三次重复。

[0059] (2)收样：试验处理30d后收获取样。收获植物时，将植物置于20mM Na2EDTA溶液交换15分钟，去除表面吸附的Cd2+；然后用自来水和去离子水分别洗三次。

[0060] (3)镉含量测定：将收取的植物置于105℃下杀青30min，然后在65℃下烘干至恒重；用研钵将植物样品磨细，供元素分析测定用。称取0.1g植物干燥粉末，使用HNO3/HClO4双酸法进行消煮。消煮后的溶液用去离子水定容后，使用ICP-MS(Agilent 7500a)进行镉含量测定。

[0061] 图4为镉胁迫下东南景天对照植株与倍性增加植株体内镉含量。