提供一种极具药用价值和观赏潜力的植物见血青的离体保存方法。通过对见血青的种子萌发、丛生芽诱导和离体保存等步骤，用见血青果荚，经表面消毒，将果荚破开，取外植体种子，接种在种子萌发培养基上，长出带叶子的小苗，经丛芽增殖培养基培养获得假鳞茎，假鳞茎转接在离体保存培养基中，离体保存的小苗经常规炼苗后进行移栽，建立了见血青的快繁和离体保存体系，继代周期达3年以上。该方法对羊耳蒜属植物种质资源的开发、利用和保护提供重要的理论来源和技术支持。
1.见血青的离体保存方法，用见血青果荚，经表面消毒，将果荚破开，取外植体种子，接种在种子萌发培养基上，长出带叶子的小苗，经丛芽增殖培养基培养获得假鳞茎，假鳞茎转接在离体保存培养基中，离体保存的小苗经常规炼苗后进行移栽，所述的培养基如下：(1)种子萌发培养基：基本培养基为MS大量元素减半，其余成分与MS相同的1/2MS培养基；(2)丛芽增殖培养基：含大量元素、微量元素和铁盐的MS+B5维生素+IAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+肌醇100mg/L；(3)离体保存培养基：1/2MS+PPP333 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L；以上培养基(1)和(2)只添加蔗糖20g/L，(3)添加蔗糖40g/L和活性炭1-2g/L；所有培养基均添加琼脂5.8g/L2
固化，pH5.8，在如下培养条件下培养：培养温度25±2℃，光照强度10-20μmol/(m·s)，光照12h/d。
2.如权利要求1所述的见血青的离体保存方法，其特征在于所述的外植体种子的获得是选择野外生长发育良好、没有病虫害的见血青果荚，在果荚成熟未开裂之前采摘，将其表面附着物搽洗干净，将经过初步处理的蒴果用75％酒精进行表面消毒20-30s，再用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液进行消毒15-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干果荚表面水分，然后切开果荚，将种子散落到种子萌发培养基中，接种7周后，出现原球茎分化，10周后出现叶原基分化。
3.如权利要求1所述的见血青的离体保存方法，其特征在于所述的丛芽增殖培养是将经种子萌发培养得到的带有一片叶子的见血青小苗，去除须根后接种至丛芽增殖培养基上，每瓶接种5个外植体，45天后出现芽分化，并在原假鳞茎的顶部或基部长出新的假鳞茎，继续在此培养条件下继代培养2-3次，60天继代一次，增殖率达1∶5，新增殖出的假鳞茎大小为0.2cm×0.3cm-0.3cm×0.4cm，呈淡绿色。
4.如权利要求1所述的见血青的离体保存方法，其特征在于所述的离体保存培养是将经丛芽增殖培养得到的新增殖的假鳞茎转接在离体保存培养基上，每个培养瓶接种5个，培养60天后，假鳞茎转为墨绿色并增大，基部的假鳞茎呈近圆形，顶部的假鳞茎长圆柱形，不断长出新假鳞茎，继续在离体保存培养基中培养，假鳞茎增大和分化同时有气生根生成；在此培养条件下，培养瓶口用保鲜膜缠绕数圈封严，培养基增加到每瓶75ml，继代周期延长至
3年以上，所用培养瓶为白色透明玻璃瓶，直径7.5cm×高9.0cm，容积300ml。
5.如权利要求1所述的见血青的离体保存方法，其特征在于所述的移栽是将离体保存3年以上的见血青带根小苗进行移栽，先将瓶苗放在大棚内炼苗1周，然后从培养瓶中取出生根苗,洗去附着的培养基，晾干水分后进行移栽，移栽基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐殖土∶沙土＝2∶1，栽好后浇透定根水，早期视苗生长状况进行及时通风或补水处理，待试管苗长出新叶后，可揭膜粗放管理。
6.如权利要求1所述的见血青的离体保存方法，其特征在于所述方法是取野外生长发育良好、没有病虫害的见血青果荚，在果荚成熟但未开裂之前采摘，带回实验室，用纱布将蒴果表面附着物搽洗干净，用75％酒精消毒20-30s，再用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液消毒15-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干果荚表面水分；然后用解剖刀切开果荚，将种子散落到种子萌发培养基中，接种7周后，原球茎分化，10周后，叶原基分化，将带有一片叶子的见血青小苗去除须根后接种至丛芽增殖培养基上，每瓶接种5个外植体，45天芽分化，在原假鳞茎的顶部或基部长出新的假鳞茎；继续在此培养条件下继代培养2-3次，60天继代一次，增殖率达1∶5，将新增殖的假鳞茎转接在离体保存培养基上，每瓶接种5个，培养60天后，假鳞茎转为墨绿色并增大，基部的假鳞茎呈近圆形，顶部的假鳞茎长圆柱形，并不断长出新的假鳞茎，继续在离体保存培养基中培养，在假鳞茎增大和分化的同时有气生根生成，在此培养条件下，培养瓶口用保鲜膜缠绕数圈封严，培养基增加到每瓶
75ml，继代周期延长至3年以上，将保存3年以上的见血青带根小苗进行常规炼苗后，移栽到基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐殖土∶沙土＝2∶1；所述的种子萌发培养基为：基本培养基为MS大量元素减半，其余成分与MS相同的1/2MS培养基；丛芽增殖培养基为：含大量元素、微量元素和铁盐的MS+B5维生素+IAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+肌醇100mg/L；离体保存培养基为：1/2MS+PPP333 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L；种子萌发培养基和丛芽增殖培养基添加蔗糖20g/L，离体保存培养基添加蔗糖40g/L和活性炭1-2g/L；上述三种培养基均添加琼脂5.8g/L固化，pH5.8，在如下培养条件下培养：培养温度25±2℃，光照强度10-20μmol/(m2·s)，光照
7.如权利要求6所述的见血青的离体保存方法，其特征在于所述种子萌发培养基和丛芽增殖培养基为40ml，离体保存培养基为75ml。
见血青的离体保存方法
技术领域：
[0001] 本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及植物见血青(Liparis nervosa(Thunb.Lindl.))的离体保存方法。背景技术：
[0002] 见血青(Liparis nervosa(Thunb.Lindl.))为兰科(Orchidaceae)羊耳蒜属(Liparis)地生草本植物，广泛分布于世界热带与亚热带地区。其茎(或假鳞茎)圆柱状，肉质肥厚，为民间常用中药，具有清热解毒、凉血止血的功效，可用于多种出血性疾病及毒蛇咬伤、皮炎、跌打损伤等症。见血青的多糖提取液和总生物碱具有较好的抗氧化性和抑菌效果，具有很高的药用价值；同时，见血青还具有观赏价值,是盆花的好材料。见血青已被列为国家二级保护植物。目前，关于羊耳蒜属植物各方面的研究越来越多，其中如专利公开号为CN102274403A的关于见血青总生物碱的提取方法，CN104813937A的关于见血青再生及快速繁殖方法，两者从化学成分和组培快繁方面对该植物进行了研究；同属植物紫花羊耳蒜(L.nigra)、长唇羊耳蒜(L.pauliana)、北方羊耳蒜(L.makinoana)和羊耳蒜(L.japonica)等也具有止血止痛等功效，也已有组培快繁方面的研究报道。随着对该属植物组培快繁工作的深入、以及人们对于该属植物野生资源的过度采收和其野生环境的日益遭受破坏，进一步开展该属物种的离体保存方法的研究，将对羊耳蒜属植物种质资源的开发、利用和保护提供重要的理论来源和技术支持。迄今为止，现有技术尚未见有见血青离体保存方法的报道。发明内容：
[0003] 本发明的目的在于提供现有技术中没有的一种极具药用价值和观赏潜力的植物见血青的离体保存方法。通过对见血青的种子萌发、丛生芽诱导和离体保存等步骤，建立了见血青的快繁和离体保存体系，继代周期达3年以上。该方法对羊耳蒜属植物种质资源的开发、利用和保护提供重要的理论来源和技术支持。
[0004] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0005] 见血青的离体保存方法，用见血青果荚，经表面消毒，将果荚破开，取外植体种子，接种在种子萌发培养基上，长出带叶子的小苗，经丛芽增殖培养基培养获得假鳞茎，假鳞茎转接在离体保存培养基中，离体保存的小苗经常规炼苗后进行移栽。
[0006] 如所述的见血青的离体保存方法，其中所述的培养基如下：(1)种子萌发培养基：基本培养基为MS大量元素减半，其余成分与MS相同的1/2MS培养基；(2)丛芽增殖培养基：含大量元素、微量元素和铁盐的MS+B5有机物+IAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+肌醇100mg/L；(3)离体保存培养基：1/2MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L；以上培养基(1)和(2)添加蔗糖20g/L，(3)添加蔗糖40g/L，活性炭1-2g/L；所有培养基均添加琼脂5.8g/L固化，pH5.8，在如下培养
2
条件下培养：培养温度25±2℃，光照强度10-20μmol/(m·s)，光照12h/d。
[0007] 如所述的见血青的离体保存方法，其中所述的外植体种子的获得是选择野外生长发育良好、没有病虫害的见血青果荚，在果荚成熟未开裂之前采摘，将其表面附着物搽洗干净，将经过初步处理的蒴果用75％酒精进行表面消毒20-30s，再用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液进行消毒15-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干果荚表面水分，然后切开果荚，将种子散落到种子萌发培养基中，接种7周后，出现原球茎分化，10周后出现叶原基分化。
[0008] 如所述的见血青的离体保存方法，其中所述的丛芽增殖培养是将经种子萌发培养得到的带有一片叶子的见血青小苗，去除须根后接种至丛芽增殖培养基上，每瓶接种5个外植体，45天后出现芽分化，并在原假鳞茎的顶部或基部长出新的假鳞茎，继续在此培养条件下继代培养2-3次，60天继代一次，增值率达1∶5，新增殖出的假鳞茎大小为0.2cm×0.3cm-0.3cm×0.4cm，呈淡绿色。
[0009] 如所述的见血青的离体保存方法，其中所述的离体保存培养是将经丛芽增殖培养得到的新增殖的假鳞茎转接在离体保存培养基上，每个培养瓶接种5个，培养60天后，假鳞茎转为墨绿色并增大，基部的假鳞茎呈近圆形，顶部的假鳞茎长圆柱形，不断长出新假鳞茎，继续在离体保存培养基中培养，假鳞茎增大和分化同时气生根生成；在此培养条件下，培养瓶口用保鲜膜缠绕数圈封严，培养基增加到每瓶75ml，继代周期延长至3年以上，所用培养瓶为白色透明玻璃瓶，直径7.5cm×高9.0cm，容积300ml。
[0010] 如所述的见血青的离体保存方法，其中所述的移栽是将离体保存3年以上的见血青带根小苗进行移栽，先将瓶苗放在大棚内炼苗1周，然后从培养瓶中取出生根苗,洗去附着的培养基，晾干水分后进行移栽，移栽基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐殖土∶沙土＝2∶1，栽好后浇透定根水，早期视苗生长状况进行及时通风或补水处理，待试管苗长出新叶后，可揭膜粗放管理。
[0011] 具体地，本发明的见血青的离体保存方法，是取野外生长发育良好、没有病虫害的见血青果荚，在果荚成熟但未开裂之前采摘，带回实验室，用纱布将蒴果表面附着物搽洗干净，用75％酒精消毒20-30s，再用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液消毒15-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干果荚表面水分；然后用解剖刀切开果荚，将种子散落到种子萌发培养基中，接种7周后，原球茎分化，10周后，叶原基分化，将带有一片叶子的见血青小苗去除须根后接种至丛芽增殖培养基上，每瓶接种5个外植体，45天芽分化，在原假鳞茎的顶部或基部长出新的假鳞茎；继续在此培养条件下继代培养2-3次，60天继代一次，增值率达1∶5，将新增殖的假鳞茎转接在离体保存培养基上，每瓶接种5个，培养60天后，假鳞茎转为墨绿色并增大，基部的假鳞茎呈近圆形，顶部的假鳞茎长圆柱形，并不断长出新的假鳞茎，继续在离体保存培养基中培养，在假鳞茎增大和分化的同时有气生根生成，在此培养条件下，培养瓶口用保鲜膜缠绕数圈封严，培养基增加到每瓶75ml，继代周期延长至3年以上，将保存3年以上的见血青带根小苗进行常规炼苗后，移栽到基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐殖土∶沙土＝2∶1；所述的种子萌发培养基为：基本培养基为MS大量元素减半，其余成分与MS相同的1/2MS培养基；丛芽增殖培养基为：含大量元素、微量元素和铁盐的MS+B5有机物+IAA0.5mg/L+KT 0.5mg/L+肌醇100mg/L；离体保存培养基为：1/2MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L；种子萌发培养基和丛芽增殖培养基添加蔗糖20g/L，离体保存培养基添加蔗糖40g/L，活性炭1-2g/L；上述三种培养基均添加琼脂5.8g/L固化，pH5.8，在如下培养条件下培养：培养温度25±2℃，光照强度10-20μmol/(m2·s)，光照12h/d。
[0012] 如所述的见血青的离体保存方法，其中所述的种子萌发培养基和丛芽增殖培养基为40ml，离体保存培养基为75ml。
[0013] 更具体地，本发明取野外选择生长发育良好、没有病虫害的见血青果荚，在果荚成熟但未开裂之前采摘带回实验室，用纱布将其表面附着物搽洗干净。将经过初步处理的蒴果用75％酒精进行表面消毒20-30s，再用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液进行消毒15-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干果荚表面水分。然后用解剖刀切开果荚，将种子散落到培养基(1)中。接种后约7周，出现原球茎分化，10周后出现叶原基分化。然后将带有一片叶子的见血青小苗去除须根后接种至丛芽增殖培养基(2)上，每瓶接种
5个外植体。45天后出现芽分化，并在原假鳞茎的顶部或基部长出新的假鳞茎。继续在此培养条件下继代培养2-3次，60天继代一次，增值率可达1∶5。新增殖出的假鳞茎大小0.3cm×
0.4cm左右，呈淡绿色。将新增殖的假鳞茎转接在培养基(3)上，每瓶接种5个，培养60天后，假鳞茎转为墨绿色并增大，基部的假鳞茎呈近圆形，大小0.8cm×1.0cm左右；顶部的假鳞茎长圆柱形，1.0cm×2.5cm，并不断有新的假鳞茎长出。继续在(3)培养基中培养，在假鳞茎增大和分化的同时有气生根的生成。在此培养条件下，培养瓶口用保鲜膜缠绕数圈封严，培养基增加到75ml左右每瓶，继代周期可延长至3年以上，大大延长了继代周期，缩短了继代次数，维持了种质资源的遗传性。将保存3年以上的见血青带根小苗进行常规炼苗后，移栽到基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐殖土∶沙土＝2∶1，移栽成苗率90％以上。
[0014] 与现有技术相比，本发明的优益性在于：对于羊耳蒜属植物，特别是见血青野生资源，本发明提供了该属物种的离体保存方法，为进一步开展该属物种的离体保存方法的研究，对羊耳蒜属植物种质资源的开发、利用和保护提供重要的理论来源和技术支持，能够解决和缓解对该属植物的过度采收和其野生环境的日益遭受破坏的严重问题。具体实施方式：
[0015] 为了更好地说明本发明的实质，下面用本发明的实施例来进一步说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。根据本发明技术方案和实施例的描述，也许同领域技术人员在本发明的基础上还可以对本发明技术方案进行一些修改和改进。因此，在不偏离本发明主要技术方案的基础上所做的修改和改进，均应属于本发明要求保护的范围。
[0016] 实施例1：
[0017] 1、材料：见血青(Liparis nervosa(Thunb.exA.Murray)Lindl.)。
[0018] 2、材料类别：见血青的种子。
[0019] 3、培养条件：(1)种子萌发培养基：基本培养基为1/2MS(MS大量元素减半，其余成分与MS同)；(2)丛芽增殖培养基：MS+B5维生素+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+肌醇100mg/L；(3)离体保存培养基：1/2MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L。以上培养基(1)和(2)添加蔗糖20g/L，(3)添加蔗糖40g/L，活性炭1-2g/L。所有培养基均添加琼脂5.8g/L固化，pH5.8，培养温度均为25±2℃，光照强度10-20μmol/(m2·s)，光照12h/d。所用培养瓶均为白色透明玻璃瓶，直径7.5cm×高9.0cm，容积约300ml；(1)和(2)所用的培养基约为40ml，离体保存所用的(3)培养基约为75ml。
[0020] 4、生长与分化情况
[0021] 4.1外植体的获得：野外选择生长发育良好、没有病虫害的见血青(Liparis nervosa(Thunb.exA.Murray)Lindl.)果荚，在果荚成熟未开裂之前采摘带回实验室，用纱布将其表面附着物搽洗干净。将经过初步处理的蒴果用75％酒精进行表面消毒20-30s，再用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液进行消毒15-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干果荚表面水分。然后用解剖刀切开果荚，将种子散落到种子萌发培养基(1)中。接种后约7周，出现原球茎分化，10周后出现叶原基分化。
[0022] 4.2丛芽增殖培养：将带有一片叶子的见血青小苗去除须根后接种至丛芽增殖培养基(2)上，每瓶接种5个外植体。45天后出现芽分化，并在原假鳞茎的顶部或基部长出新的假鳞茎。继续在此培养条件下继代培养2-3次，60天继代一次，增值率可达1∶5。新增殖出的假鳞茎大小0.3cm×0.4cm左右，呈淡绿色。
[0023] 4.3离体保存：将新增殖的假鳞茎转接在离体保存培养基(3)上，每瓶接种5个，培养60天后，假鳞茎转为墨绿色并增大，基部的假鳞茎呈近圆形，大小0.8cm×1.0cm左右；顶部的假鳞茎长圆柱形，1.0cm×2.5cm，并不断有新的假鳞茎长出，但不如在培养基(2)上增殖明显。继续在(3)培养基中培养，在假鳞茎增大和分化的同时有气生根的生成。在此培养条件下，培养瓶口用保鲜膜缠绕数圈封严，培养基增加到75ml左右每瓶，继代周期可延长至3年以上，大大延长了继代周期，缩短了继代次数，维持了种质资源的遗传性。
[0024] 4.4移栽：将保存3年以上的见血青带根小苗进行移栽。首先将瓶苗放在大棚内炼苗1周，然后从培养瓶中取出生根苗,洗去附着的培养基，略微晾干水分后进行移栽。移栽基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐殖土∶沙土＝2∶1，栽好后浇透定根水，早期视苗生长状况进行及时通风或补水处理，待试管苗长出新叶后，可揭膜粗放管理，移栽成苗率90％以上。
[0025] 实施例2：
[0026] 1、材料：见血青(Liparis nervosa(Thunb.exA.Murray)Lindl.)。
[0027] 2、材料类别：见血青的种子。
[0028] 3、培养条件：(1)种子萌发培养基：基本培养基为1/2MS(MS大量元素减半，其余成分与MS同)；(2)丛芽增殖培养基：MS+B5维生素+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+肌醇100mg/L；(3)离体保存培养基：1/2MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L。以上培养基(1)和(2)添加蔗糖20g/L，(3)添加蔗糖40g/L，活性炭1.5g/L。所有培养基均添加琼脂5.8g/L固化，pH5.8，培养温度均为25±2℃，光照强度15μmol/(m2·s)，光照12h/d。所用培养瓶均为白色透明玻璃瓶，直径7.5cm×高9.0cm，容积约300ml；(1)和(2)所用的培养基约为40ml，离体保存所用的(3)培养基约为75ml。
[0029] 4、生长与分化情况
[0030] 4.1外植体的获得：野外选择生长发育良好、没有病虫害的见血青(Liparis nervosa(Thunb.exA.Murray)Lindl.)果荚，在果荚成熟未开裂之前采摘带回实验室，用纱布将其表面附着物搽洗干净。将经过初步处理的蒴果用75％酒精进行表面消毒30s，再用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液进行消毒20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干果荚表面水分。然后用解剖刀切开果荚，将种子散落到种子萌发培养基(1)中。接种后约7周，出现原球茎分化，10周后出现叶原基分化。
[0031] 4.2丛芽增殖培养：将带有一片叶子的见血青小苗去除须根后接种至丛芽增殖培养基(2)上，每瓶接种5个外植体。45天后出现芽分化，并在原假鳞茎的顶部或基部长出新的假鳞茎。继续在此培养条件下继代培养3次，60天继代一次，增值率可达1∶5。新增殖出的假鳞茎大小0.3cm×0.4cm左右，呈淡绿色。
[0032] 4.3离体保存：将新增殖的假鳞茎转接在离体保存培养基(3)上，每瓶接种5个，培养60天后，假鳞茎转为墨绿色并增大，基部的假鳞茎呈近圆形，大小0.7cm×1.1cm左右；顶部的假鳞茎长圆柱形，1.0cm×2.7cm，并不断有新的假鳞茎长出，但不如在培养基(2)上增殖明显。继续在(3)培养基中培养，在假鳞茎增大和分化的同时有气生根的生成。在此培养条件下，培养瓶口用保鲜膜缠绕数圈封严，培养基增加到75ml左右每瓶，继代周期可延长至3年以上，大大延长了继代周期，缩短了继代次数，维持了种质资源的遗传性。
[0033] 4.4移栽：将保存3年以上的见血青带根小苗进行移栽。首先将瓶苗放在大棚内炼苗1周，然后从培养瓶中取出生根苗,洗去附着的培养基，略微晾干水分后进行移栽。移栽基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐殖土∶沙土＝2∶1，栽好后浇透定根水，早期视苗生长状况进行及时通风或补水处理，待试管苗长出新叶后，可揭膜粗放管理，移栽成苗率90％以上。
