生物制品的连续加工方法

摘要

本发明涉及用于纯化生物药品和生物制品诸如单克隆抗体、蛋白质治疗剂和疫苗的连续加工技术的开发。描述了用于连续加工通向纯化原料药品的配制的进料流中的生物制品的方法。

权利要求

1.一种用于在连续方法系统中制造生物制品的方法，包括以下步骤：

(a)在生物反应器中产生含有生物制品的条件培养基；

(b)从所述条件培养基中连续移除细胞和细胞碎片以产生包含所述生物制品的澄清溶液；

(c)将所述澄清溶液连续转移到第一单元操作，所述第一单元操作包括捕获色谱方法，所述捕获色谱方法包括：(1)将所述包含生物制品的澄清溶液与能够与所述生物制品复合的亲和配体接触，以及(2)将在所述接触步骤中形成的所述亲和配体和所述生物制品的复合物解离以产生纯化的生物制品溶液；

(d)将所述纯化的生物制品溶液连续转移到包括低pH孵育方法的第二单元操作，所述低pH孵育方法包括(1)将所述纯化的生物制品溶液的至少一部分收集在孵育容器中，(2)将所述纯化的生物制品溶液的pH调节到经计算将使所述溶液中所含的任何病毒灭活的pH，以及(3)再次调节所述纯化的生物制品溶液的pH以产生病毒灭活的生物制品溶液；

(e)将所述病毒灭活的生物制品溶液连续转移到至少一个附加单元操作，所述至少一个附加的单元操作包括选自阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、纳滤、超滤/渗滤、微滤或它们任何顺序的组合的方法；以及(f)回收包含所述生物制品的溶液,

其中独立于每个转移步骤,所述转移步骤包括将来自前一单元操作的流导向中间储存容器,其中所述容器具有等于或小于在一整批加工过程中从所述前一单元操作接收的体积的一半的保持容量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中细胞和细胞碎片的所述移除包括离心。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一单元操作为模拟移动床亲和色谱方法。

说明书

生物制品的连续加工方法

[0001] 本申请为国际申请号为PCT/US2011/063598，国际申请日为2011年12月6日，发明名称为“生物制品的连续加工方法”的PCT申请于2013年7月4日进入中国国家阶段后申请号为201180064040.7的中国国家阶段专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及用于生产生物药品和生物制品(诸如单克隆抗体和疫苗)的连续加工技术的开发。

[0003] 发明背景

[0004] 连续方法广泛用于多种行业，例如石油化工、精细化工和农产品加工行业。蒸馏、推流式反应、色谱和吸附分离在大规模工业应用中均以连续模式操作。例如，熟知的大规模模拟移动床(SMB)纯化方法是从二甲苯混合物中分离对二甲苯的所谓Parex方法。该方法基于UOP LLC(Des Plaines,IL(US))开发并商业化的Sorbex SMB技术。其他SMB或相关连续逆流色谱技术值得注意的实例为从葡萄糖和果糖混合物(其用于生产高果糖玉米糖浆)中纯化果糖；从糖蜜中回收蔗糖和甜菜碱；纯化各种羧酸和氨基酸；以及生产肥料用硝酸钾。

[0005] 尚未明显从连续加工技术受益的一个行业为生物制药行业，在这个行业中最终药品通常为大分子(即，≥3kD)并且必须经历若干目的在于纯化和最终灭菌的步骤。直到最近，大部分生物药品和生物制品仍以不算太大的规模制造和纯化，因此没有必要放弃固有低效的批加工技术。然而，在最近几年中，第一种单克隆抗体治疗剂的商业成功连同在制造方法中采用完全一次性或单次使用组件的需要已促使人们对更高效的加工技术的兴趣渐增。

[0006] 模拟移动床分离方法的进展诸如集成BioSMBTM系统(Tarpon Biosystems,Inc.,Worcester,MA(US))已使得可能将传统上以批方式操作的分离方法步骤转化成可连续运行的SMB方法，从而获取澄清的进料并以连续的方式纯化目标分子诸如单克隆抗体或疫苗，以得到纯化的中间产品，其可直接用于目标在于最终的纯化原料药品和最终包装的无菌药品的另外下游加工。BioSMBTM系统提供了一种代替分批纯化方法步骤的灵活、可编程系统。其提供大大减小操作规模、大大减少溶剂使用和所需色谱介质量的优点，以及采用完全一次性组件的能力(从而减少不锈钢组件的投入，以及最大程度减少因清洗和整修永久组件所造成的停产时间)。

[0007] 改良SMB系统所提供的连续加工能力导致了人们对整体生物药品加工的其他阶段转化成连续加工方法的兴趣增加。生产生物药品通常以在生物反应器中生产蛋白质产品开始，然后为许多阶段或单元操作，每个阶段或单元操作被设计为从不需要的组分和杂质中分离产品。

[0008] 人们对单次使用或“一次性”技术的应用兴趣最近几年来明显增加，因为这些技术提供了时间和资金节省，还有其他优势。然而，随着工业规模一次性生物反应器的容量已向前飞跃，一次性下游加工(即，加工在生物反应器中生长的培养物直至最终包装产品)的设备设计已然滞后。例如，虽然能够进行2,000升细胞培养的新生物反应器现已上市并且正在设计5,000升容量的一次性生物反应器，但是目前可用的最大一次性下游色谱柱仍不够大(约30cm直径)以至于不能加工现代“高滴度”(如，5g/L靶蛋白)2,000升一次性生物反应器运行的输出。在2,000升生物反应器中生长的具有5g/升或更高蛋白质产物浓度的细胞培养物可提供超过10kg的蛋白质物料以供纯化。

[0009] 连续加工应允许大大降低生物反应器下游所需设备的规模，因此迫切需要针对生物药品生产所有阶段的新连续加工方法。发明概要

[0010] 本发明涉及在生物制药行业中用于纯化生物药品和生物制品以提高制造生产率和效率的新型连续加工技术(CPT)的开发。

[0011] 已开发了用于生物药品纯化的本文所述的新型CPT方法，该方法将有利地允许整个纯化方法采用一次性加工元件连续地操作。

[0012] 用于连续加工系统设计的优选元件是利用多阀门阵列，优选地以集成阀盒或阀组的形式。此类阀盒通过BioSMBTM系统来展示，其将数十个隔膜式阀集成为单个一次性块体，从而在连续色谱应用中产生流体控制的“集成电路式”方法。参见例如图10A-10E。通过将一次性阀盒和集成隔膜片与永久性致动器块体分离，BioSMBTM系统设计使得能够通过满足生物制药行业严格的性能和清洁性要求的完全一次性流路实现精密的流体控制。

[0013] 图2中所示的方块流程图示出了本发明CPT方法的多个加工步骤或单元操作。图2示出了单克隆抗体产品的纯化，但将容易地认识到，本文所述的连续加工的原理可适用于任何生物制品的纯化。

[0014] 在一个实施方案中，本发明涉及用于生产生物制品的方法，包括：

[0015] (a)将含生物制品的溶液连续转移到能够将溶液分离成两个或更多个级分的第一单元操作，所述两个或更多个级分包括至少一个含有所述生物制品的级分和至少一个含有希望与所述生物制品分离的含生物制品的溶液中的一种或多种组分的级分，其中所述第一单元操作具有至少一个入口和至少一个出口并被构造成允许在所述至少一个入口与至少一个出口之间的连续流体流；

[0016] (b)将来自所述第一单元操作的至少一个出口的流连续转移到具有至少一个接收来自所述第一单元操作的至少一个出口的流的入口的第二单元操作，来自所述第一单元操作的所述流包含所述生物制品，所述第二单元操作能够将通过所述至少一个入口接收的产品分离成两个或更多个级分，所述两个或更多个级分包括至少一个含有所述生物制品的级分和至少一个含有希望与所述生物制品分离的通过所述至少一个入口接收的产品中的一种或多种组分的级分，并且其中所述第二单元操作还具有至少一个出口并被构造成允许在所述至少一个入口与至少一个出口之间的连续流，并且其中所述第二单元操作的通量等于从所述第一单元操作接收的输出流；以及

[0017] (c)回收含有所述生物制品的流体级分。

[0018] 根据该实施方案，独立于每个转移步骤，转移步骤包括将来自前一单元操作的流导向中间储存容器，其中所述容器具有等于或小于在一整批加工过程中从前一单元操作接收的体积的一半的保持容量。

[0019] 在另一个实施方案中，本发明涉及在连续方法系统中制造生物制品的方法，该方法包括以下步骤：

[0020] (a)在生物反应器中产生含有生物制品的条件培养基；

[0021] (b)从条件培养基中连续移除细胞和细胞碎片以产生包含生物制品的澄清溶液；

[0022] (c)将澄清溶液连续转移到第一单元操作，该操作包括捕获色谱方法，该色谱方法包括

[0023] (1)将所述产品溶液与能够与所述生物制品复合的亲和配体接触，以及[0024] (2)将在所述接触步骤中形成的亲和配体和所述生物制品的复合物解离以产生纯化的生物制品溶液；

[0025] (d)将纯化的生物制品溶液连续转移到包括低pH孵育方法的第二单元操作，该孵育方法包括

[0026] (1)将纯化的生物制品溶液的至少一部分收集在孵育容器中，

[0027] (2)将纯化的生物制品溶液的pH调节到经计算将使溶液中所含的任何病毒灭活的pH，以及

[0028] (3)再次调节纯化的生物制品溶液的pH以产生病毒灭活的生物制品溶液；

[0029] (e)将病毒灭活的生物制品溶液连续转移到一系列另外的下游加工步骤，其至少包括一个阴离子交换色谱方法；

[0030] (f)将下游方法的产品连续转移到包括纳滤方法的第六单元操作；以及[0031] (g)将纳滤方法的产品连续转移到包括通过0.2μm过滤器微滤以产生稳定的纯化生物制品的第七单元操作。

[0032] 在一个实施方案中，步骤(b)中细胞和细胞碎片的移除通过离心方法进行。

[0033] 在方法的另一个实施方案中，第一单元操作为模拟移动床亲和色谱方法。

[0034] 在另一个实施方案中，本发明涉及将溶液孵育受控的时间段的方法，该方法包括：

[0035] (a)将生物制品溶液连续转移到第一孵育容器中；

[0036] (b)调节溶液条件以实现第一容器中的所需孵育条件；

[0037] (c)将第一容器的内容物连续转移到第二容器中或者作为另外一种选择转移到一系列容器或一段管路中，将收集量维持所需的停留时间；

[0038] (d)将第二容器的内容物连续转移到第三容器中；以及

[0039] (e)将溶液条件调节到后续或下一单元操作的所需条件。

[0040] 在又一个实施方案中，本发明涉及将生物制品溶液在所需的溶液条件下孵育受控的时间段并在所需的容许时间窗口内的方法，该方法包括：

[0041] (a)将生物制品溶液连续转移到一系列孵育容器中，其中每个容器的体积等于或小于流速乘以所需的容许时间；

[0042] (b)停止流向所述容器的入口，并在混合以确保溶液均匀性的同时将所述容器中的溶液条件调节到所需的孵育溶液条件；

[0043] (c)将各容器保持所需的孵育时间；

[0044] (d)在混合以确保溶液均匀性的同时再次将各容器中的溶液条件调节到后续单元操作中的加工所需的条件；以及

[0045] (e)将孵育的生物制品溶液从各容器转移到后续单元操作。

[0046] 在又一个实施方案中，本发明涉及用于连接连续加工制造方法的两个或更多个单元操作的设备，该设备包括：

[0047] (a)提供至少三个流体传输通道的阀组，所述至少三个流体传输通道包括：横穿所述阀组并具有入口端和出口端的中央通道，连接单独的入口与所述中央通道的灌注通道，以及连接单独的出口与所述中央通道的旁流通道，通道的每一个具有至少一个用于独立地打开或关闭通道的独立致动阀，中央通道入口适于接收来自上游单元操作的通量，并且灌注通道入口适于接收用于填充灌注通道和中央通道的流体；以及

[0048] (b)至少一个具有至少一个入口和至少一个出口的波动容器，所述波动容器入口连接到所述阀组的中央通道出口，并且所述至少一个波动容器具有保持连接到所述阀组中央通道入口的单元操作的通量的容量。

[0049] 在一个实施方案中，波动容器还包括将所述容器的内部与周围环境连通的通气出口。在一个实施方案中，可将过滤器插入所述通气出口与周围环境之间，并且其中通气出口还包括用于打开和关闭出口的阀。另外，波动容器出口可以连接到泵。

[0050] 在另一个实施方案中，设备的旁流通道连接到旁流收集容器，其具有保持连接到所述阀组中央通道入口的单元操作的通量的容量。

[0051] 在又一个实施方案中，本发明涉及用于连接连续加工制造方法的两个或更多个单元操作的设备，该设备包括：

[0052] (a)提供至少五个流体传输通道的阀组，所述至少五个流体传输通道包括：横穿阀组并具有入口端和出口端的中央通道，连接单独的入口与中央通道的灌注通道，连接单独的入口与中央通道的波动容器入口通道，连接单独的出口与中央通道的波动容器出口通道，以及连接单独的出口与中央通道的旁流通道，并且其中五个通道的每一个具有至少一个用于独立地打开或关闭通道的独立致动阀，中央通道入口适于接收来自上游单元操作的通量，所述灌注通道入口适于接收用于填充所述灌注通道和所述中央通道的流体；

[0053] (b)至少一个具有至少一个入口和至少一个出口的波动容器，其中波动容器入口连接到阀组的波动容器出口通道，并且波动容器出口连接到阀组的波动容器入口通道，并且其中所述至少一个波动容器具有保持连接到阀组中央通道入口的单元操作的通量的容量。所述至少一个波动容器还可以包括将所述容器的内部与周围环境连通的通气出口。在一个实施方案中，将过滤器插入通气出口与周围环境之间，并且其中通气出口还包括用于打开和关闭所述出口的阀。在另一个实施方案中，阀组的波动容器出口与波动容器入口通道之间的连接配备用于调节沿着连接的流体流的泵。

[0054] 在再一个实施方案中，设备的旁流通道出口连接到旁流收集容器，其具有保持连接到阀组中央通道入口的单元操作的通量的容量。

[0055] 在另一个实施方案中，本发明涉及连续加工系统，该系统包括：

[0056] (a)执行第一单元操作的第一设备，该设备包括：

[0057] (1)多个阀组件，每个模块具有横穿模块的中央通道和多个连接中央通道与阀组件外部的分支通道，其中通道的每一个具有至少一个用于独立地打开或关闭通道的独立致动阀，并且其中中央通道的阀将中央通道的入口端与中央通道的出口端分开，并且其中至少两个分支通道将通向阀组件的单独入口与中央通道阀入口侧上的中央通道连接，并且至少两个分支通道从中央通道阀出口侧上的中央通道引向阀组件的单独出口；

[0058] (2)多根溶液导管，每根导管连接到每个阀组件的单独分支通道，以及[0059] (3)多根色谱柱，每根柱具有入口和出口，其中柱入口连接到阀组件中央通道的入口端并且柱出口连接到不同阀组件中央通道的出口端，使得多根柱通过居间阀组件串联，并且其中串联中的最后一根柱的出口通过居间阀组件连接到串联中的第一根柱的入口；

[0060] (b)用于执行第二单元操作的第二设备，该设备包括：

[0061] (1)每一个都具有至少一个入口和至少一个出口的一个或多个孵育容器，其中所述一个或多个孵育容器总体上至少具有保持所述第一单元操作的输出的容量；

[0062] (2)包括入口和出口、连接到阀组件入口的入口通道以及一个或多个与入口通道连接的入口分支通道的阀组件，其中每个入口分支通道从入口通道引出并连接到所述一个或多个孵育容器之一的入口，并且其中入口分支通道的每一个具有至少一个用于独立地打开或关闭通道的独立致动阀，所述阀组件还包括引向阀组件出口的出口通道以及一个或多个与出口通道连接的出口分支通道，其中每个出口分支通道从出口通道引出并连接到所述一个或多个孵育容器之一的出口，其中出口分支通道的每一个具有至少一个用于独立地打开或关闭通道的独立致动阀；以及

[0063] (c)用于将所述第一设备的输出连接到所述第二设备的入口的第三设备，该第三设备包括：

[0064] (1)提供至少五个流体传输通道的阀组件，所述至少五个流体传输通道包括：横穿阀组件并具有入口端和出口端的中央通道，连接单独的入口与中央通道的灌注通道，连接单独的入口与中央通道的波动容器入口通道，连接单独的出口与中央通道的波动容器出口通道，以及连接单独的出口与中央通道的旁流通道，并且其中五个通道的每一个具有至少一个用于独立地打开或关闭通道的独立致动阀，其中中央通道入口连接到所述第一单元操作的设备的多个阀组件每一个的出口分支通道，灌注通道入口适于接收用于填充灌注通道和中央通道的流体，

[0065] (2)至少一个具有至少一个入口和至少一个出口的波动容器，其中波动容器入口连接到阀组件的波动容器出口通道，并且波动容器出口连接到阀组件的波动容器入口通道，并且其中所述至少一个波动容器具有保持第一单元操作的设备的输出的容量，并且其中阀组件的中央通道出口连接到用于执行第二单元操作的设备的阀组件的入口。

[0066] 在连续加工系统的一个实施方案中，所述至少一个波动容器和/或所述一个或多个孵育容器还包括将容器内部与周围环境连通的通气出口。在一个实施方案中，将过滤器插入通气出口与周围环境之间，并且其中通气出口还包括用于打开和关闭出口的阀。在又一个实施方案中，阀组的波动容器出口与波动容器入口通道之间的连接配备用于调节沿着所述连接的流体流的泵。

[0067] 在本发明的连续加工系统的另一个实施方案中，旁流通道出口连接到旁流收集容器，其具有保持连接到阀组中央通道入口的单元操作的通量的容量。

[0068] 在本文所述的连续加工系统的又一个实施方案中，将用于执行第一单元操作的设备的多个阀组件集成到主阀组中。

[0069] 在本文所述的连续加工系统的又一个实施方案中，所述一个或多个孵育容器配有用于混合容器的内容物的装置。例如，用于混合容器的内容物的装置可以是摇床。

[0070] 在本文所述的连续加工系统的另一个实施方案中，所述容器的任何一个均可以为单次使用的容器。

[0071] 已开发了用于生物药品纯化的本文所述的新型CPT方法，该方法将有利地允许整个纯化方法采用一次性加工元件连续地操作。

[0072] 用于连续加工系统设计的优选元件是利用多阀门阵列，优选地以集成阀盒或阀组的形式。此类阀盒通过BioSMBTM系统来展示，其将数十个隔膜式阀集成为单个一次性块体，从而在连续色谱应用中产生流体控制的“集成电路式”方法。参见例如图10A-10E。通过将一次性阀盒和集成隔膜片与永久性致动器块体分离，BioSMBTM系统设计使得能够通过满足生物制药行业严格的性能和清洁性要求的完全一次性流路实现精密的流体控制。

[0073] 图2中所示的方块流程图示出了本发明CPT方法的多个加工步骤或单元操作。图2示出了单克隆抗体产品的纯化，但将容易地认识到，本文所述的连续加工的原理可适用于任何生物制品的纯化。

[0074] 附图简述

[0075] 图1是示意图，示出了根据本发明作为加工步骤或单元操作(UO)的相互级联的连续加工概念。

[0076] 图2A是方块流程图，示出了目标在于生产纯化的单克隆抗体产品的单元操作互相串联的实例。

[0077] 图中显示了从生物反应器(10)中产生粗制含抗体溶液(条件培养基)再通过多个加工步骤最后以纯化抗体产品(18)的原料贮存结束的抗体连续加工。图2B示出了通过图2A中所示的单元操作的连续操作实现的纯加工时间的压缩。鉴于批加工要求每个连续的单元操作只有在前一单元操作的加工完成后才能开始，连续加工方法允许目标生物制品在其开始从上一单元操作出现时通过每个连续的加工步骤连续移动。因此，多个(如果不是全部)单元操作同时工作，并且通过批方法将需要至少数天才能完成的整个生产方法可通过连续加工操作，使得最终的纯化原料药品在几个小时内即可产生。另外，由于操作的连续性，所需设备的规模与批操作所需的相比得以显著减小。

[0078] 图3是连续加工系统的示意图，显示了两个另外的结构，即波动容器(7)，其用于调节单元操作之间的流和减小背压，以及紧急收集容器(21)，其用于在系统故障或扰乱时提供对部分加工的生物制品的补救装置。

[0079] 图4是根据本发明的连续加工系统的示意图，其中加工步骤(UO)使用多阀门阀组件(33,34,35)而集成。在所示的系统中，波动容器(7)连接到单独的阀组件(30)，使得其成为加工路径中的任选操作。

[0080] 图5是根据本发明的可供选择的连续加工系统的示意图，其中通往波动容器(7)的流不由单独控制的阀系统单独调节。相反，来自前一单元操作(31)的通量使用前一单元操作的阀系统(33)被导向波动容器(7)或被导向最终单元操作(32)(绕过波动容器)。

[0081] 图6是根据本发明的可供选择的连续加工系统的示意图，其与图4和5中所示的系统的不同之处在于主阀组(40)调节通往和来自多个(n)单元操作(UO)(31)的流，调节向多个(n)波动容器(7)的流向，调节从前面的单元操作(31)或波动容器(7)到下游单元操作(32)的流以及调节向收集容器(21)的紧急旁流，从而使得能够补救部分加工的生物制品。

[0082] 图7是连续生物制品制造方法的一部分的示意图，显示了通过多阀门调节器模块(44,45,46)互连的四个单元操作。在该实施方案中，波动容器(7)被设置为两个加工步骤(即单元操作(UO)42与43)之间的单独单元操作。换向阀将任何两个单元操作之间的流通过沿着旁流管线(47)导流而导向紧急截止容器(21)。

[0083] 图8是连续生物制品制造方法的一部分的示意图，显示了以图7的替代计划互连的三个单元操作(UO)。在该实施方案中，单元操作(42)与单元操作(43)之间的居间波动容器(7)为永久性装置，前一单元操作(42)的输出必须从中通过才能转移到此处所示的最后一个单元操作(43)。此方案的波动容器(7)因此不是任选操作。

[0084] 图9是连续生物制品制造方法的一部分的示意图，显示了以图7的替代计划互连的三个单元操作(UO)。在该实施方案中，从一个单元操作(UO)到下一个的流通过连接到具有共同入口(48)(例如用于灌注缓冲液)和导向收集容器(21)的共同出口(47)的相同多阀门阀组(44)而调节。每个阀组具有在通过泵(1)转移到后续单元操作(如42)前实现从前一单元操作(如41)接收的流旁流到波动容器(7)的入口和出口。重复阀组件(44)可被一体式主阀组(未示出)取代，其将由阀组件(44)代表的所有阀整合成单个可编程以适应所有所需的转移和旁流操作的阀组。

[0085] 图10A-10E是使用集成阀盒调节连续逆流多管柱模拟移动床色谱方法的操作的示意图。10A、10B、10C、10D和10E代表了涉及六根柱子的模拟移动床色谱方法中的顺序步骤。

[0086] 图11是需要在通往后续单元操作前将产品溶液孵育一定时间的单元操作的示意图。孵育单元操作可例如用于蛋白质重折叠、用于通过降低pH孵育而使病毒灭活或用于在进一步加工前要求溶液在一个阶段保持一段预定的孵育时间的任何其他操作。图11中所示的单元操作使用一系列保持/孵育容器(50,51,52)，而通向每个容器的流通过共同的阀组(40)调节。如果保持/孵育容器(50,51,52)中所接收的混合物需要均匀，则容器可配备用于保持内容物充分混合的装置，例如通过混合桨(由物件53示意性地表示)，然而也可使用任何可供选择的混合装置(如搅拌棒、摇床、振荡器等)。符号[X]n表示足够的阀X阵列存在于阀组(40)中以将所产生的流通过入口(54)独立地导向任何保持/孵育容器以及独立地从任何容器导向单元操作的出口(55)。在图11中，显示了通往容器52的流，以及显示了从容器50到出口54的独立流。虚线表示不在使用中的管线(流路)。

[0087] 图12和13显示了串联的保持/孵育容器(50)的可供选择的计划，其中流通过阀组(40)的阀阵列[X]n调节。图12的实施方案示出了串联的容器(50)之间的流通过阀组(40)调节。图13的实施方案示出了一种方案，其中通过一系列共三个保持/孵育容器(50)的流接连出现，在通量通过所有三个容器(50)前不能将流转向出口(55)。

具体实施方式

[0088] 本发明提供使得生物制品加工的至少两个或更多个步骤为连续的能够制造生物制品的方法。连续加工允许制造商使用更少的物料并依靠与批操作所需的设备相比规模减小的设备开展制造方法。连续加工缩短整个制造方法中的停产时间并因此缩短从制造运行开始到生产原料药物或包装成品的周期时间。

[0089] 为了使得可以更清楚地理解本发明，使用了如下定义的下列缩写和术语。

[0090] 如本文所用的术语“生物制品”是指通过生物过程或通过现有生物产品的化学或催化修饰而产生的所关注产品。生物过程包括细胞培养、发酵、代谢、呼吸等。生物制品通常包含蛋白质。所关注的生物制品包括例如抗体、抗体片段、蛋白质、激素、疫苗、天然蛋白质片段(诸如用作疫苗的细菌毒素如破伤风类毒素的片段)、融合蛋白或肽偶联物(如亚单位疫苗)、类病毒颗粒(VLP)等。

[0091] 如本文所用的“生物药品”是指经纯化或配制以便在生理上可接受地用作药物或治疗剂的生物制品。

[0092] 如本文所用的术语“单元操作”是指被设计为将不需要的成分从所关注的产品中分离或被设计为确保含有所关注产品的组合物基本上不含不需要的组分的制造方法。在生物药品制造中在例如生物反应器中产生后的此类单元操作可包括但不限于：用于使细胞培养生物反应器的输出澄清的初始回收操作，诸如离心、微滤、深层过滤等；例如通过亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱(HIC)、固定金属亲和色谱(IMAC)等的捕获色谱；用于实现例如病毒灭活、蛋白质重折叠、聚集体解离等的低pH(例如pH 3.0-3.5)或其他溶液条件下的孵育；用于滤除病毒、细菌、颗粒和其他污染物或杂质的微滤或纳滤等；用于产品浓缩的切向流过滤(例如通过超滤)；缓冲液交换(例如通过渗滤)；用于清除变体产物(例如具有四聚抗体产物的溶液中的重链二聚体)的“精制”或中间色谱或膜吸附分离(例如通过离子交换)；清除聚集体；清除DNA或宿主细胞蛋白质；病毒吸附；除去产物特定的杂质；用于原料贮存的过滤(例如0.2微米过滤)；以及类似的操作。可将单个单元操作设计为在同一操作中完成多个目标。

[0093] 术语“上游”或“上游方法”是指与通过生物过程或其他反应形成活性生物制品相关的生物药品制造步骤。通常，待分离并加工成生物药品的生物制品是发酵的结果或为重组转化宿主细胞的表达产物。因此，制造方法的上游部分通常涉及在天然产生(内源)目标蛋白的原核或真核细胞中或更通常地在通过重组DNA技术转化以表达一种或多种内源目标蛋白的原核或真核宿主细胞中产生目标蛋白(诸如抗体、活性蛋白或蛋白片段、融合蛋白、类病毒颗粒等)。涉及在细胞培养中产生生物制品的上游方法将在发酵罐或生物反应器中进行，并且上游方法可以是批方法(例如在发酵罐中生长的分批或分批补料细胞培养物)或连续方法(例如灌注细胞培养)。

[0094] 术语“下游”或“下游加工”是指需要将生物制品与杂质和污染物分离的生物制品“上游”加工后的步骤，通常导致产生原料药物。下游加工是指用于从产生生物制品的原始溶液中捕获所述生物制品、用于将生物制品从不需要的组分和杂质中纯化出来、用于滤除或灭活病原体(如病毒、内毒素)以及用于配制和包装所必需的一些或所有步骤。

[0095] 如本文所用的术语“连续方法”是指具有连续的两个或多个加工步骤的任何方法，其中将上游步骤(单元操作)的输出转移到下游步骤(单元操作)并且其中不需要上游加工步骤的运行完成就可以开始下一加工步骤。在连续方法中，目标产品的一部分始终通过加工系统移动。理想的是，对通过连续方法的流进行调节，使得尽最大的可能程度，连续方法每个步骤或单元操作同时地并以基本上相同的生产速率运行。以此方式，周期时间得到最大程度的压缩，并实现可能最短的完成时间。因此，涉及从上游单元操作移动到下游单元操作的产品流的表达“连续转移”或“连续地转移”意指，两个单元操作之间的连接或联系使得上游单元操作将产品流(直接地或通过其他组件)转移到第二(下游)单元操作，以及使得下游单元操作在上游单元操作的运行完成前开始(也就是说，对于部分地由两个单元操作构成的整个方法运行的至少一部分，两个连续的单元操作同时地加工正流入它们之中的产品流)。

[0096] 本文所述的连续加工技术("CPT")代表对现有批生物药品制造方法的根本性改进并将在资金和时间节省方面以及方法灵活性和扩展性方面产生显著的有益效果。采用CPT使得生物药品生产设施能够以吨级规模处理生物制品生产运行，而资金投入远远少于常规批制造方法。CPT还使得用于临床试验的生物药品的制造能够更快更具成本效益地实现。

[0097] 减少建立生物制造能力所需的资金投入将改善投资回报并降低运行成本，因而最终应使生物药品的价格更低。通过提高早期临床试验制造的效率，更多的新生物药品将能够进入临床试验，从而改善大型公司的开发渠道以及减少小型公司实现概念验证的时间和成本。加速新药开发并降低其生产成本对于生物药品的质量和可负担性具有深刻的影响。

[0098] 本文所述的CPT方法提供现在可以通过利用多个一次性生物反应器实现的吨级规模输出的处理手段。通过采用本文所述的连续加工方法，生物制品的制造商通常可以节省建造能够通过使用大规模不锈钢设备的常规批方法生产吨级规模生物药品的新设施所需的5亿美元/5年的投资。基于运行连续方法所需的设备的规模减小，可以实现将资金投入减少多达80％以及将放大生产能力的时间压缩到约2年。正在开发新生物制品的公司面临着在将产品从实验室规模的量放大和生产到临床前实验和临床试验所需的大得多的量时资金投入方面的挑战。由于在开发的这一时间点失败的风险较高(即，进入临床试验的生物药品不到20％得到商业规模生产审批)，因此正在开发新候选药物的公司(及其投资者)不愿意花费在将候选产品推进到临床试验的绝对必要资金以外的任何资金。另外，由于制造和开发活动在新生物药品开始人类临床试验前几乎总是处于关键的过程中，因此简化和加速生产临床供应药品的能力在开发过程的新药临床申报前(pre-IND)阶段具有重大价值。

[0099] 用于人类临床试验的临床供应药品需要按GMP制造使最早期项目产生了大量的成本，而延迟或未能实现GMP标准则会使得融资或获得进行原计划的临床研究审批更加困难。使用连续加工连同使用诸如本文所述的一次性技术已帮助减少了资本支出并已加快了实现临床制造的速度。建造基于一次性用品的临床制造设施的成本可少至1.5-2千万美元，相比之下，常规临床制造设施则需要3-5千万美元。本文所述的CPT方法可通过缩小生产所需产品量需要的设备规模以及通过使整个制造方法更灵活更可移植而进一步降低这些成本同时加速临床制造过程。

[0100] 由于本文所公开的这些改进导致更低的投资要求和更短的临床供应药品制造时间，因此早期生物药品开发的收益状况对于具有内部制造设施的大型公司以及对于可能外包其产品制造的小型公司都将得到改善。这种改善的收益状况将使得更具前景的候选生物制品进入临床试验：大型公司将能够使更多的候选产品进入早期试验，从而扩大进入药物开发渠道的候选药物数量；而力图根据人类临床研究进行概念验证以作为投资或合作目标必要条件的小型或创业型生物制药公司将更能跨越这一障碍。

[0101] 实现一次性用品的采用

[0102] 向生物药品制造方法中引入一次性用品(或单次使用技术)构成了从标准可重复使用技术的重大转变。使用一次性用品技术因行业对降低资本投资、加快开发速度和减少因重复使用生产设备造成的污染的广泛需求而驱动。在小规模、临床制造应用中采用一次性技术已相对快速，这归功于相对易于实施以及资金和时间节省方面的巨大优势。如上所述，不能获得足够大的一次性纯化设备代表了使用一次性技术实施较大规模方法的“瓶颈”。

[0103] 本文所述的CPT方法使得能够更全面地采用一次性用品。连续加工允许减小在处理目前大型和容量日益增加的生物反应器(目前2,000升，日渐增大到5,000升及以上)时所需的设备规模。连续加工允许利用可用的设备进行下游加工，包括单次使用(一次性)的设备；另外，CPT的流通容量允许与最大生物反应器的生产率匹配以及大大超过的生产率，从而使得能够更深入地利用完全一次性的方法。从传统批加工切换到连续加工从根本上改变了生物制药行业开发和制造其产品的方式。

[0104] 本文公开了具体地讲能够采用一次性组件的连续加工的构造。在许多情况下，一次性组件与永久性、可重复使用的设备相比将具有更低的容限或降低的容量，并且已经设计了用于连续加工的多个结构使得可以使用一次性组件并且系统可适应其特性的任何差异。例如，单次使用的塑料管道可用于替代不锈钢管道，然而从一个单元操作到另一个单元操作的系统压降的容限对于塑料管道而言远低于不锈钢管道。在本发明中，结合了可用于泄放系统并将给定的连接返回到大气压力的诸如波动容器的结构，使得不因用塑料管道替代不锈钢管道而导致管路失效或系统性能损失。

[0105] 连续单元操作

[0106] 在生物制品制造方法中的单元操作可受益于连续多管柱或多阶段操作这已通过从批操作转化到连续逆流模拟移动床(SMB)色谱的捕获色谱步骤所证实。在批操作中，捕获色谱操作(诸如使用蛋白A亲和色谱进行IgG靶标的蛋白A捕获)的多个步骤依次地进行：将来自生物反应器的澄清条件培养基施加到捕获色谱柱上，然后进行洗涤、洗脱、清洗(再生)和平衡步骤，而每个步骤完成后才开始下一步骤。在SMB多管柱系统中，采用多根柱，并且多个步骤在不同的柱上同时地运行。利用连续流，多管柱系统允许降低柱子的容量，从而允许使用小径柱处理大型生物反应器体积(而不是放大柱尺寸，以通过批捕获色谱适应生物反应器的进料)。这样的SMB多管柱系统的操作在图10A-10E中示出。

[0107] 已经开发了商业SMB系统(BioSMBTM系统，Tarpon Biosystems,Inc.,Worcester,MA(US))，其提供阀和连接的集成阵列(阀盒)以协调多种溶液和缓冲液流向大量互连的管柱，使得能够使用许多不同的分离介质实现可扩展的连续色谱操作。BioSMBTM系统可编程和可调节，并且其可用于将几乎任何单管柱批操作转换成连续多管柱操作。BioSMBTM系统还通过采用可更换的管道、管柱和阀膜而充分利用一次性组件，它们均可快速地从系统上断开连接以安装新的组件，从而缩短或基本上消除系统停产时间。

[0108] BioSMBTM系统的核心是用作液体处理的集成回路的阀盒，它将使得能够进行连续加工所需的许多阀结合到单个一次性形式的阀阵列中。(这样的阀阵列在图10A-10E中示意性地示出，其中每个方形项目108代表一个阀。因此示出了容纳在单个阀盒或阀组中的54个阀(108)的阵列，但是应当理解，可以采用更大的阀盒(或更小的重复性阀组件)。例如，商业BioSMBTM系统阀组的特征在于240个可单独致动的阀。)此阀盒经证实是一种稳固且可清洁的装置，适用于满足生物制药应用的严格要求。

[0109] 图1示意性地示出了根据本发明的连续加工的最广方面。在连续加工中，方法步骤或单元操作(UO)的级联以串联方式彼此直接连接。第一单元操作(3)的出口通过管线(2)直接连接到下一单元操作(4)的入口，并且第二单元操作(4)的流过液从该单元操作(4)的出口进入到第三单元操作(5)的入口。该示意图显示了通过管线(管道或流路)(2)互连的三个加工阶段或单元操作(3,4,5)，而产品流通过单台泵(1)驱动。对于生物药品，该方法以可直接施用给患者的形式的药学上可接受的生物制品制剂结束(例如在单元操作5之后)。如示意图中所示，每个单元操作串联到下一单元操作：第一单元操作(3)接收前一步骤(可以是批步骤)的输出或泵(1)的通量；第一单元操作(3)的通量被导向下一单元操作(4)的入口，并且该单元操作(4)的通量被导向第三单元操作(5)的入口。应当理解，示意图的每个UO可代表多个加工步骤，并且还应当认识到，可向这一系列单元操作添加另外的单元操作直到组装完成整个方法。在本发明的连续加工方法中，一个单元操作的通量连接到下一单元操作的输入，使得所连接的单元操作可连续运行，使得所关注的所需产品从一个单元操作移动到下一个，而不必等待一个单元操作完成即可将产品引入下一单元操作以开始进一步的加工。

[0110] 生物反应器的尺寸设定了将要在生物制品制造方法中加工的培养基的初始体积。在批方法中，产品的量是最重要的因素，然而在连续方法中，要加工的培养基的体积决定了所有下游操作的规模。因此，产品的滴度越大，通过采用连续方法获得的优势也越大。目前，
5克产品/升(5g/L)被视为诸如单克隆抗体的蛋白质产品的高滴度，然而，优化宿主细胞产生、培养基条件、生长周期等产生了10-13g/L或更高的滴度。

[0111] 应当指出，根据本发明的连续加工系统不需要从一个单元操作到下一个的恒定流或通过所有互连单元操作的恒定流。出于多种原因，可能需要调节或停止通过一个单元操作或单元操作之间的流速。连续加工只需要两个单元操作之间的联系使得第一或上游单元操作将产品流(直接地或通过其他组件)转移到第二(下游)单元操作以及使得下游单元操作在上游单元操作的运行完成前就开始(也就是说，对于制造运行的至少一部分，两个连续的单元操作同时地加工产品)。虽然连续加工不需要通过一系列连接的单元操作每一个的均匀或不间断流，但是优选的是加工系统的操作方式可尽可能地保持连续流流过系统。本文描述了允许实现整个连续方法的单元操作之间高程度的不间断流的结构。

[0112] 图2A是生物药品的示例性制造方法的方块流程图。在所示的方法中，以举例的方式，生物药品为单克隆抗体。示意图的每个方块代表单元操作，并且所示操作的序列(10-18)代表了连续地并尽最大可能程度同时地运行的连接单元操作的级联，使得在理想情况下不发生方法的关停或中断，并且单元操作不需要延迟以等候前一操作完成(如在批方法中)。图2A中所示的具体单元操作的序列是典型的并适用于单克隆抗体加工。应当认识到，不同的生物制品将根据包括不同的单元操作或以不同顺序执行的类似单元操作的方法来制造。例如，如果目标生物制品在细菌培养中产生并且最初作为宿主细胞内的聚集体或包涵体形成，则初始回收可涉及诸如以下单元操作：通过离心或超滤使细胞沉淀，裂解细胞，收获包涵体，解离聚集体(例如通过离液剂)和蛋白质重折叠，所有都在捕获色谱操作前进行。此外，捕获色谱单元操作将针对特定的蛋白质产品加以定制，并可涉及合适的非蛋白A(其选择性结合免疫球蛋白的恒定片段(Fc))的亲和配体或可涉及完全不同的色谱(例如IMAC、HIC、离子交换等)。同样，不同产品的下游加工可适当地涉及不同的步骤和不同系列的单元操作。适用于生产所需生物制品的加工阶段的设计在本领域从业人员的能力范围内；将加工阶段(单元操作)相联系以便能够连续加工生物制品是本发明的主题。

[0113] 再次参见图2A所示的单克隆抗体方法，第一方块(10)代表在其中产生细胞培养物的生物反应器，例如通过使表达并优选地分泌抗体到细胞培养基中的转化宿主细胞(如酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞等)生长。通常使包含所分泌的生物制品的条件培养基澄清，例如通过离心和/或微滤或深层过滤，以在转移到下一单元操作(11)前移除细胞和细胞碎片。下一方块(11)代表捕获色谱步骤，对于免疫球蛋白而言，其有利地采用蛋白A亲和色谱进行。蛋白A色谱步骤(11)的通量被连续送到下一单元操作(12)，其在该示意图中为病毒灭活步骤。由于在蛋白A介质上捕获的抗体通常采用低pH洗脱剂(例如100mM甘氨酸，pH 3.0-pH 
3.5)洗脱，因此低pH病毒灭活是接着蛋白A捕获和洗脱后连续进行的逻辑单元操作。来自病毒灭活(12)的通量被连续转移(在将溶液调节到合适的条件(即pH)以上样到下一色谱步骤后)到下一单元操作(13)，其在该示意图中为阳离子交换色谱，其被设计为消除产品相关的杂质，诸如聚集体和发生降解或不当组装的抗体。阳离子交换是抗体生产方法此阶段的逻辑单元操作，但是对于其他生物制品，另一类型的色谱操作可能更有效。例如，疏水相互作用色谱(HIC)、陶瓷羟磷灰石(CHT)或其他类型的色谱步骤可在此阶段出于特定目的被替换。来自阳离子交换色谱步骤(13)的通量被连续转移到下一单元操作(14)，其在该示意图中为超滤/渗滤步骤。超滤被设计为通过在切向流膜上保留产品然后通过用于缓冲液交换的渗滤而浓缩抗体。将所需的新缓冲液以通过渗透移除水/缓冲液的相同速率加入，因此体积和浓度保持恒定，而缓冲液得以交换。来自超滤/渗滤步骤(14)的通量被连续转移到下一单元操作(15)，其在该示意图中为阴离子交换色谱，其被设计为消除具有净负电荷的杂质，诸如DNA、内毒素、病毒和宿主细胞蛋白质。抗体通常具有相对高的等电点，因此可容易地调节条件使得抗体产品具有净正电荷而杂质表现出净负电荷(并因此抗体流过阴离子交换柱或膜的带正电介质/膜)。来自阴离子交换色谱步骤(15)的通量被连续转移到下一单元操作(16)，其在该示意图中为纳滤步骤，例如使用20nm-40nm的无菌膜式过滤器，其被设计为移除病毒。来自纳滤步骤(16)的通量被转移到下一单元操作(17)，其在该示意图中为任选的浓缩/缓冲液交换然后为微滤(0.2μm过滤器)，其被设计为将纯化的单克隆抗体放入用于原料贮存的溶液中(18)。在贮存稳定的制剂(18)中的原料纯化抗体可直接转移到将执行进一步操作的无菌灌装操作，所述进一步操作诸如必要时进行另外配制、无菌过滤以及将抗体灌装到无菌小瓶、注射器或其他容器中以作为生物药品分销。

[0114] 在诸如图2A所示的制造方法中，色谱步骤将有利地采用将使得能够连续操作的可编程多管柱调节系统操作，诸如前述BioSMBTM系统(Tarpon Biosystems,Inc.,Worcester,MA(US))。超滤/渗滤步骤的优选系统为CadenceTM系统(Pall Corp.,Port Washington,NY(US))。诸如为BioSMBTM系统中的特色功能的集成阀盒还能够调节最终纳滤和微滤步骤的连续操作。

[0115] 参见图2B，该图显示了在图2A中以图表示出的每个单元操作的时程表，而连续单元操作在前一单元操作结束前即开始的结构示出了通过连续加工获得的优势。而在使用批操作进行的制造方法中，每个时程将需要运行完成后才能将收集的产品转移到下一个批步骤，并且每个时程都不重叠。以所示规模进行的批制造将要花费四天或以上才能完成。相比之下，连续加工方法允许时程重叠，而被连接的单元操作在大部分时间都同时运行。当使连续加工最大化时，四天的批制造方法在约24小时内即可完成。

[0116] 参见图3，示意性地示出了一系列共四个单元操作(UO)。所示的系统配备有助于连续操作的两个附加结构。一个结构是连接在两个单元操作之间的波动容器(7)，使得第二单元操作(4)的输出被收集在容器(7)中。容器(7)配备可透过空气但筛出微生物的除菌级过滤器(8)，例如0.2微米过滤器。当打开阀(9)以通向空气时，容器(7)内部的压力等于周围(大气)压力。在大气压力下的容器内容物可通过泵(1)以下述压降送入下一单元操作(5)，该压降低于在无波动容器(7)运行的封闭系统中克服来自通过下游单元操作(5)和(6)维持的流动的背压所需的压降。

[0117] 在利用单次使用设备的连续方法中，合适的波动容器(7)和传输管线(管道，2)将通常由不太耐用的材料制成，诸如塑料。在此类情况下，容器(7)可以为塑料袋(平衡袋)或通气塑料瓶。此类塑性材料及其在单元操作之间的连接耐背压聚集的能力比例如不锈钢容器和管道低；因此，使用波动容器缓解系统压力并降低维持从一个操作到另一个的流动所需的压降不仅对于调节流动的连续性而且对于保持系统的完整性并避免材料或连接发生故障都具有高度的优势。

[0118] 再次参见图3，有助于通过整个系统连续流动的第二结构是安装旁流收集容器(21)，与传输导管(20)一起，使得可以从任何单元操作(UO)使流动转向，以使得在将流动转移到下一预期单元操作不可能的情况下(例如由于堵塞、下游污染、连接故障、确定需要继续孵育或在连续方法正常操作中的类似扰乱)经部分加工的产品不丢失。安装旁流收集容器(21)提供对已在一个或多个单元操作中部分加工但是如果产品流通过已因污染、流动阻塞、泄漏、下游单元操作未准备好等而变得不适合接收产品的下游阶段时将会丢失的产品提供补救手段。捕获在旁流容器(21)中的部分加工产品可在其被转向的点引入单元操作的级联，从而避免在制造方法不得不停止、重置和重新开始的情况下将会存在的产率降低和返工成本。有利的是，可在必要时提供单独的回流管线(未示出)和泵，以将收集在旁流容器(21)中的产品溶液返回到单元操作级联中的任何点。

[0119] 图4示出了特征在于如图3中所示的波动容器(7)和旁流收集容器(21)的制造方法，但是在该图中，波动容器(7)通过提供足够的阀和连接(由[X]n表示)的阀组件(34)连接到方法中，以将上游单元操作(31)的流通过管线(2)直接导向后续单元操作(32)或者作为另外一种选择导向中间波动容器(7)。该系统因此将波动容器(7)当作上游单元操作(31)与下游单元操作(32)之间的中间任选单元操作。在该图中，[UO]n表示位于上游的多(n)个单元操作，它们的输入和输出由重复阀组件(33)调节。优选地，所示的重复阀组件(即33、34、35)将为相同的模块，其将使得单元操作之间的连接和流路标准化，简化方法程序，以及提供可易于更换的调节单元操作流的组件。

[0120] 参见图5，示意性地示出了根据本发明的连续方法的替代实施方案，其中波动容器结构(7)作为单独的单元操作而连接，然而波动容器(7)的使用通过以下方式成为任选的：提供从通过阀组件(33)调节的上游单元操作(31)由输入管线(2)引向波动容器(7)或者作为另外一种选择由单独管线(20)直接引向下游单元操作(32)的连接。每个单元操作(UO)被连接到一系列容器或储存容器，其提供运行单元操作的每个步骤所需且适当的输入(缓冲液、洗涤溶液、洗脱缓冲液、平衡溶液、溶剂等)。输入溶液的收集由项目30和36示意性地表示；每一组输入溶液将是不同的，因为它们将针对特定单元操作的步骤而定制，但是许多单元操作的共同溶液当然可以连接到不止一个单元操作。各种输入溶液的流可有利地通过集成阀组(未示出)调节，该阀组可优选地为调节从一个单元操作到下一个单元操作(如33、
34)的联系的相同阀组。在图5中，还提供了紧急旁流收集容器(21)，而从每个单元操作引向该容器(21)的连接则通过阀组件(33,34)实现。

[0121] 参见图6，示意性地示出了根据本发明的连续方法的替代实施方案，其中多个波动容器(7)被连接到系统，而具有多个阀[X]n的主阀组(40)将单元操作(UO)、波动容器(7)和旁流收集罐或容器(21)的整个系列互连。

[0122] 参见图7，示意性地示出了包括单元操作(41,42,43)的制造方法或制造方法的一部分。联系单元操作和其他结构的连接由单独的阀组件(44,45,46)调节。优选的是，每个阀组件是相同的，从而使得连接为一致的并简化任何单个阀组件的更换。更优选地，联系单元操作的连接将集成到一个主阀组(未示出)中，从而允许所有单元操作均根据单个集成阀切换程序而运行。在图7中，每个阀组件(44,45,46)具有将流导向所需的结构的通道和合适的阀。第一单元操作(41)的输出通过穿过其相关阀组件(44)的中央通道的输入管线(2)而被直接导向下一单元操作(42)。关闭中央阀并打开通向旁流管线(47)的侧阀提供将第一单元操作(41)的输出转向旁流收集容器(21)的回路。阀组件(44)还具有用于灌注缓冲液的单独的可控流路，以帮助在来自前一单元操作(41)的进料未准备好、被中断或转向时维持通往下一单元操作(42)的恒定流。第二单元操作(42)通过其阀组件(45)连接到波动容器(7)。与其他阀组件(44,46)格式相同的阀组件(45)也提供旁流收集和缓冲液灌注流路。通过除菌级过滤器(8)和夹管阀(9)通气的波动容器(7)将该段系统的压力返回到大气压力。波动容器(7)的输出可因此以压降通过泵(1)泵送到下一单元操作(43)。波动容器(7)的输出可通过阀组件(46)直接导向单元操作(43)或通过阀的适当操纵借助管线(47)导向旁流收集容器。如在其他阀组件(44,45)中，还提供了用于灌注缓冲液的具有单独流路的最后示出的阀组件(46)。

[0123] 图8显示了在根据本发明的连续制造方法中一系列共三个单元操作(UO)的可供选择的实施方案。在该实施方案中，如图7中的波动容器(7)通过直接输入管线(48)连接以接收来自第二单元操作的流过液。该波动容器(7)不是上游单元操作(42)与下游单元操作(43)之间的任选步骤。

[0124] 参见图9，示出了制造方法中一系列共三个单元操作(UO)。重复阀组件(44,45)具有将波动容器(7)置于单独的回路上的附加通道和阀，从而使得液流转向波动容器(7)并因此任选地转向下游单元操作(42或43)。这样的回路使得可以延迟从上游单元操作到下一下游单元操作的流动或提供对来自下游单元操作的背压聚集进行平衡的装置。

[0125] 图7、8和9中所示的连接方案显示了利用集成、重复阀组件连接单元操作的优势。产品流可被转向可供选择的流路，以进行可供选择的加工、附加加工或保持，或在下游系统故障或扰乱时紧急补救部分加工的产品。波动容器起到以受控的方式收集含产品的流体并允许泵从(不加压的)波动容器抽出所述流体的作用。借助此结构，在一系列单元操作中的累积压降(其将为各个单元操作的压降之和)可保持在较低的水平，使得可在该方法中的任何地方使用一次性组件(通常具有低压力额定值)。波动容器的另一个功能是形成进入下一单元操作的稳定流(通过泵)，即使前一单元操作不产生稳定、平稳的产品流仍是如此。对于许多单元操作，例如捕获色谱，产品流始终连续地从系统中流出。但是，单元操作的流出也可能以重复的间隔出现。通常情况下存在连续流，但是例如多管柱方法的循环性质也允许产品间歇流动。在单元操作的流出产品流中的这些波动通过居间波动容器而缓冲，这为操作人员提供了控制和产生更均匀的下游单元操作输入的手段。可以看出，提供如图9中所示连接到每个单元操作的任选波动袋回路提供了使一系列单元操作形成连续方法的机制，即使在一个或多个组成操作不提供将转移到下游单元操作的连续、平稳输出时。波动容器因此变成设计连续方法的可用结构。

[0126] 波动容器将具有允许操作人员使前一单元操作产生的液流中的任何波动的影响最小化的体积。例如，在前一单元操作为多管柱色谱方法(诸如SMB方法)的情况下，波动容器的容量优选地被选择为使得其可适应SMB方法洗出液的多个(如三个)连续峰。波动容器优选地配备从波动容器释放空气而不允许污染物进入波动容器的装置。实现此目的的一种方式(图7、8、9中示出)是提供具有配备除菌级微过滤器(8)如0.2μm孔径过滤器的出口的波动容器。过滤器的出口然后优选地配备阀(9)，如夹管阀，以控制空气释放。从系统释放空气在启动程序中尤其重要，以将空气从所有设备和仪器中逐出。

[0127] 生物制品的连续捕获

[0128] 在任何生物制品制造方法中初始单元操作之一将为捕获步骤，其通常在制造方法的初始回收步骤之后。如上所述，捕获单元操作通常为亲和色谱方法，但是根据目标生物制品，其也可以有利地利用任何其他合适的分离技术，诸如疏水相互作用色谱(HIC)、固定金属亲和色谱(IMAC)、离子交换色谱等。亲和捕获和洗脱需要一系列步骤，包括上柱(即，通过包含目标物的进料流)、洗涤和洗脱，并且在洗脱后通常需要进行色谱介质的清洗(再生)和平衡，使得系统可在不更换柱的情况下进行重复循环。

[0129] 模拟移动床色谱法提供了一种在捕获单元操作中的连续加工方式。捕获目标的连TM续纯化借助于采用集成阀组件，诸如为BioSMB 色谱系统(Tarpon Biosystems,Inc.)中的特色功能的阀组。可对计算机辅助的阀组编程，以在进料流、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、清洗缓冲液和平衡缓冲液之间自动切换柱进料，以形成模拟移动床分离。这样的系统在图10A-
10E中示意性地示出，其显示了采用填充有捕获介质的六根柱(参见图10A中的1、2、3、4、5、
6)进行的四区式SMB色谱单元操作。这六根柱通过集成阀组相互串联，该阀组表示为单独致动阀(108)的阵列，因此图10A-10E中所示的阵列显示了54个阀(108)。

[0130] 参见图10A，阀组具有至少五个入口，例如以便在所示的系统中适应来自产品进料流(101)、洗涤溶液(102)、洗脱剂(103)、清洗溶液(104)和平衡缓冲液(105)的输入。还示出了用于回收产品和排出废液的输出管线(分别为106和107)。

[0131] 柱色谱纯化方法的连续操作通过接连地考虑图10A-10E而展示。参见图10A，进料流(101)通过阀组沿着由合适的阀(108)致动而形成的引向第一亲和分离柱(1)的流路被导向。第一柱(1)通过阀组将其出口连接到第二柱(2)的入口，并且两根柱都接收来自进料流的输入，直到至少第一柱(1)的柱床变得被亲和捕获的生物制品饱和。

[0132] 参见图10B，第一柱(1)的柱床饱和后，将阀组的阀切换为将进入第一柱(1)的输入从进料流(101)变为洗涤溶液(102)。同时，第二柱(2)继续接收进料流(101)，然而通过阀组的进料流(101)的通道已切换为来自进料流(101)而不是来自第一柱(1)的直接输入。第二柱(2)的出口通过合适的阀(108)致动经阀组导向串联中的下一柱(3)的入口。来自柱出口的连续流过液通过废液管线(107)转向，但在可回收的产品从柱中洗脱时除外，在此情况下，将柱的通量通过阀组导向产品回收管线(106)。应当认识到，“废液”管线(107)实际上可不止一根管线，从而为操作人员提供对柱输出的更多控制并提供不只是回收洗脱产品的装置。例如，此类辅助管线可用于溶剂回收或可重复使用的(或可能包含可回收的可重复使用组分)任何流过液的回收。

[0133] 优选地，阀组内的阀致动和后续通道切换沿着整个柱系列加以协调。更优选地，阀切换通过计算机程序控制，使得切换自动地发生，并且捕获色谱的连续阶段在不中断或系统停机的情况下进行。这种可编程的切换和自动化的协调切换已在前述BioSMBTM纯化系统中实现。因此，BioSMBTM系统或具有其特征的协调系统可适于生物药品纯化方法中的其他单元操作，并因此提供适于使制造方法的所有单元操作成为连续方法的设备。

[0134] 参见图10C，阀组中阀(108)的编程切换将第一柱(1)接收的输入更换为洗脱缓冲液流(103)。固定在第一柱(1)上的捕获生物制品开始从柱中洗脱，并且柱(1)出口下游的阀(108)的合适切换将柱(1)的流过液(洗出液)导向产品回收管线(106)。沿着产品回收管线(106)导向的溶液有利地被传输到后续单元操作(未示出)。例如，参见图2A关于抗体产品所示的制造方法，柱将填充适合抗体捕获的色谱介质，诸如蛋白A/琼脂糖，并且从回收管线(106)回收的溶液将含有所需的产品(抗体)，但是例如在洗脱缓冲液(103)为低pH缓冲液(pH 3.0-pH3.5)时也可以为低pH溶液，这种缓冲液是从蛋白A亲和柱中洗脱抗体的典型手段。因此，如果将目标产品接收在低pH溶液中，则后续单元操作可以包括缓冲液交换以再次调节pH(因为抗体在低pH下将最终变性)，或在再次调节pH前可直接从捕获色谱单元操作进行低pH单元操作。如图2A中所示，对于抗体生物药品加工而言有利的低pH单元操作是连续低pH病毒灭活。因此，在蛋白生物制品生产方法中有利的连续单元操作对将包括捕获色谱单元操作接着是低pH病毒灭活单元操作。

[0135] 再次参见图10C，在第一柱(1)的输入切换为洗脱缓冲液(103)后产品从第一柱洗脱的同时，串联中的第二柱(2)的输入被切换为洗涤缓冲液(102)。第三柱(3)继续上样进料流(101)，并且其流过液被导向串联中的第四柱(4)的入口。

[0136] 参见图10D，示出了下一区转移，其中第一柱(1)(现在已经没有了产品)通过阀组将其入口切换为接收被设计为使亲和介质再生以用于另一个循环的清洗溶液；同时，被产品饱和的柱(2)在接收一个循环的洗涤缓冲液后(图10C)现在接收洗脱缓冲液(103)，使得产品从柱(2)中系统脱并通过阀组的合适阀(108)致动经产品回收管线(106)回收，并且在连续加工系统中可直接转移到下游单元操作。串联中的第三柱(3)接收此处所示循环的洗涤缓冲液(102)，并且第四柱(4)继续上样进料流(101)以实现柱床被产品饱和。第四柱(4)的流过液通过阀组直接连接到第五柱(5)的入口，以开始为该柱上样产品。

[0137] 参见图10E，示出了在图10D中所示的循环后的下一个区转移，其中第一柱(1)(现在已经没有了产品并进行了清洗以使亲和配体再次活化)通过阀组将其入口切换为接收被设计为准备亲和介质以用于另一个循环(即，在下一个循环中接收进料流(101))的平衡缓冲液(106)；同时，输入管线通过阀组切换，使得被完全洗脱的第二柱(2)现在将其入口连接到清洗溶液(104)。在接受一个循环的洗涤缓冲液后(图10D)被产品饱和的第三柱(3)现在接收洗脱缓冲液(103)，使得产品从柱(3)中洗脱并通过阀组的合适阀(108)致动经产品回收管线(106)回收。在连续加工系统中，产品回收管线(106)可将产品溶液直接转移到下游单元操作。串联中的第四柱(4)接收此处所示循环的洗涤缓冲液(102)，并且第五柱(5)继续上样进料流(101)以实现柱床被产品饱和。第五柱(5)的流过液通过阀组直接连接到第六柱(6)的入口，以开始为该柱上样产品。在此循环后，可以开始一轮新的纯化、洗涤、洗脱、清洗和平衡循环，而阀将进料流切换到第六柱(6)的入口并且第六柱(6)的出口直接连接到串联中的第一柱(1)，使得来自前一柱(6)的产品进料溢流被捕获在已再生、重新平衡的第一柱(1)上。

[0138] 上文已经描述了连续捕获色谱方法，其中色谱方法步骤的多管柱操作使用可切换通道的阀组“集成回路”(即，可致动阀的阵列，可对其进行编程以形成进料的切换流路，以通向具有多个步骤的多管柱单元操作中的一系列柱)调节。出于举例说明的目的，此类系统已在对进料流中的抗体产品进行蛋白A亲和色谱分离的背景下进行了描述，然而应当认识到，诸如图10A-10E的所示阀阵列的设备可用于形成任何类型的色谱分析的多管柱、连续方法，包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、使用另一种类型的非蛋白A的配体的亲和色谱、金属离子螯合、疏水相互作用色谱等等。

[0139] 连续低pH病毒灭活

[0140] 如上所述，在设计包括一系列单元操作的生物药品制造方法时，早期步骤将通常为捕获色谱步骤。在图2A中所示的抗体生产方法中，蛋白A捕获色谱步骤紧接着从生物反应器中初始回收抗体后进行。在许多捕获色谱操作中，尤其是蛋白A亲和色谱法，从亲和捕获介质的洗脱通过降低流过色谱柱的缓冲液的pH而实现。蛋白A/抗体复合物在低pH下解离，例如约pH 3.0与pH 3.5之间。因此，蛋白A柱的洗出液为低pH溶液。抗体产品如果保持在低pH下超过30分钟(±5分钟)将发生严重的降解；在另一方面，低pH孵育是使可能存在于溶液中的病毒灭活的非常好的方法。如果抗体产品旨在作为药物使用，则病毒灭活是整个制造方法中的必需步骤，并且如果捕获色谱步骤产生了含有抗体产品的低pH洗出液，则将有利的是在连续方法中将洗出液直接转移到设计用于低pH病毒灭活的单元操作。

[0141] 参见图11，示意性地示出了设计为连续低pH病毒灭活的单元操作。该单元操作被设计为接收低pH进料(如通过入口(54)进入集成多阀门阀块或阀组(40))并将进料转移到一系列保持/孵育容器(50,51,52)中的一个。阀组(4)配备适用于独立地和可供选择地转移到连接到阀组(40)的保持/孵育容器(50,51,52)任一个的通道和阀阵列(由图[X]n表示)。图11所示单元操作的目标是使产品溶液在适用于可能存在于溶液中的病毒灭活的pH下孵育。例如，对于抗体产品溶液，在低于pH 3.5的预先选定的受控pH(例如±0.2pH单位)下孵育30分钟±5分钟，根据公认的标准降低活病毒的水平，并且抗体产品的降解或变性将是可接受的。病毒灭活步骤通常被设计为提供3或以上的对数下降值，即至少10,000倍的活病毒减少。

[0142] 再次参见图11，将产品溶液的等分试样通过入口(54)转移到孵育容器(52)。容器的尺寸可被制定为接收前一单元操作通量的所有或任何部分转移。在利用一次性设备的连续方法中，容器(50,51,52)可有利地为塑料袋、瓶、烧瓶等。同样，系统的其他组件诸如通向阀组(40)的管道以及阀组本身的部件可由单次使用的材料制成。例如，阀系统可由覆盖阀致动器和相关通道的阵列的可更换片状膜形成，其中柔性膜的并置导致关闭的阀控通道系统，其模式由阵列中不同的打开和关闭阀的组合决定。(参见例如为BioSMBTM纯化系统(Tarpon Biosystems,Inc.,Worcester,MA(US)中的特色的阀盒系统)。

[0143] 为了密切地监控溶液的pH，每个容器将配备pH传感器(未示出)以及用于接收酸性和/或碱性溶液以将pH调节到所需范围内的进入口(未示出)。可能重要的是，引入容器(50,51,52)中的抗体产品溶液保持充分混合，例如使得可得到准确的pH读数并且任何pH调节都将影响容器中收集到的整个等分试样。在此类情况下，容器将配备混合装置，其在图11中示意性地由螺旋桨式混合桨(53)表示，但是作为另外一种选择其可以是适于实现产品溶液所需均匀程度的任何装置。磁力搅拌棒、摇瓶、摇床等均是合适的并为本文所设想的。

[0144] 通过阀组件(40)的可变引入通道可将来流导向每一个保持/孵育容器(50,51,52)。每个孵育容器的内容物可单独地导向该单元操作的出口(55)。在图11的示意图中，通过入口(54)进入单元操作的溶液被导向第三孵育容器(52)，而第一孵育容器的内容物被导向出口(55)，例如以转移到下一单元操作。图11中的虚线代表可用但未使用的通道，它们用于将来自入口(54)的溶液导向容器(50)和(51)，以及用于将容器(51)和(52)的内容物导向出口(55)，例如以转移到下一单元操作。除了所示的管线外，阀组件(40)可设有阀和泵(未示出)以将溶液从一个容器转移到另一个。通过一系列容器的这种转移可例如在需要对此单元操作的pH或其他溶液条件进行分步调节的情况下实施。在另一个实施方案中，第一容器(52)可用于低pH下的孵育，然后第二和后续容器可用于进一步的加工，诸如缓冲液交换(例如以逐渐升高pH)、将产品暴露于离液剂或在有利的溶液条件下孵育以实现蛋白质重新组装或重折叠。参见图12和13，示出了通过一系列串联的三个保持/孵育容器(50)转移溶液。在图12中，保持/孵育容器(50)之间的转移通道示为流过阀组件(40)，使得通过操纵集成阀系统来控制顺序转移。在图13中，从一个容器(50)到下一个的顺序转移不使用阀组件(40)控制，而是通过某些其他装置进行，例如通过溢流、人工转移或通过源容器中的传感器触发的转移，例如定时器、料位传感器或在达到特定pH时发送转移操作信号的pH传感器。

[0145] 将蛋白质产品暴露于低pH的可接受时间窗口通常很窄(例如30±5分钟)。过短的暴露时间不能提供充分的病毒灭活，而过长的暴露时间则会导致较高程度的产品降解。连续加工允许在紧密的时间容限内操作低pH病毒灭活单元操作。优选的方法涉及以半连续方式使产品溶液的“包”或等分试样穿过单元操作。在低pH病毒灭活步骤前的单元操作为捕获色谱操作(例如抗体产品的蛋白A亲和色谱法)的情况下，产品作为一系列连续的洗出液峰进入低pH病毒灭活单元操作。通过混合可在预定的孵育期间(例如在上述实例中的30分钟±5分钟)内收集的低pH加工的多个洗脱液峰，将应用正确的孵育时间并可实施连续转移到下一单元操作。

[0146] 以举例的方式，在连续病毒灭活系统中，其中产品进料是从蛋白A色谱柱洗脱的单克隆抗体，病毒灭活单元操作可有利地如下进行：

[0147] 1.来自蛋白A的洗出液将具有pH 3.5-pH 4.5范围内的pH。在收集待加工的混合液(例如，在等于低pH孵育期间的时间内来自蛋白A柱的洗脱峰)后，将在保持/孵育容器中将pH通过酸滴定调节到低pH病毒灭活条件(例如pH 3.3)；

[0148] 2.酸滴定将通过在温和混合和连续pH监测下添加稀酸(如1M HCl)直到达到低pH病毒灭活的pH设定点而实现；

[0149] 3.一旦达到合适的pH，将容器中的产品溶液内容物保持所需的灭活时间(如30分钟)；

[0150] 4.在所需的孵育时间后，将采用另一pH调节步骤(优选地在转移到另一(下游)保持容器后)将灭活溶液的pH调高到适合转移到后续单元操作的pH(例如pH 5.0)，该后续单元操作诸如为上样到阳离子交换色谱柱(参见例如图2A的项目13)；

[0151] 5.在将产品溶液转移到下一单元操作后，可清洁并冲洗保持容器以上样另一蛋白A洗出混合液，或者可将容器丢弃并将新的容器连接到系统以接收后续蛋白A洗出混合液并让它们通过低pH灭活步骤。

[0152] 为了避免从一个容器到另一个容器物理转移产品溶液，在以上序列中描述的包含混合蛋白A洗出液的容器的“移动”可通过合适的控制器和阀盒实现。这与使用图10A-图10E所示系统中的阀盒实现的色谱柱的模拟“移动”非常相似。

[0153] 在可供选择的实施方案中，蛋白A洗出液可流过连续混合的保持袋(容器)的级联序列，其中第一个将实现蛋白A洗出液的pH调节，而其中最后一个将实现下一单元操作前的灭活溶液的pH再次调节。袋子的大小被制定为确保实现低pH病毒灭活的合适停留时间。

[0154] 连续加工设计

[0155] 可以认识到，为了有效地联系整个制造方法的单元操作使得它们可以连续的方式运行，在操作的每个阶段进行性能的定量分析是必要的。必须开发和执行产品产率和纯度的分析方法。此类方法可包括评估整个方法中的产品纯度的SDS-PAGE(还原和非还原)方法，评估通过纯化方法对宿主细胞蛋白清除率的宿主细胞蛋白ELISA，以及确定产品浓度和产率的HPLC或紫外吸光度方法。

[0156] 多管柱逆流连续色谱方法诸如SMB方法的设计需要与批方法相同的基本方法信息。这包括进料溶液中的产品浓度(滴度)、平衡结合容量(静态结合荣浪)和整个方法顺序。依赖于色谱介质、产品和溶液条件的质量转移动力学相关信息对于系统定制也是需要的。
一般来讲，这可得自穿透曲线分析。为此，设计完善的批方法是设计连续多管柱或多阶段纯化方法非常好的起点。

[0157] 对于低pH灭活步骤，需要用于确定和确认病毒灭活的可接受时间范围的分析方法。对于超滤/渗滤(UF/DF)步骤(参见图2A的项目14)，可通过小试规模的切向流过滤(TFF)系统获得关于在变化的流速和产品浓度下随跨膜压而变化的流量的有用数据。对于纳滤和最终0.2微米过滤步骤(参见图2A的项目16和17)，可获得关于随流量而变化的压降以及各个膜装置的负荷容量的可用数据。

[0158] 使用方法的每个单元操作获得的此类批方法数据，可以设计连续加工操作。第一设计选择为加工时间。与其中加工时间是方法设计的结果的批方法相反，连续方法允许预先选择加工时间。加工时间越长，通过单元操作系列的流速可以越低并且整个系统可以更紧凑(在所用设备的规模方面)。在另一方面，过长的加工时间可导致达到不可接受水平的某些阶段的产品降解。进料流速是需要加工的体积和加工时间的结果。需要加工的体积称为“批”或“批量”。

[0159] 进入CPT方法的最低进料流速Qm由最长加工时间t用以下公式计算：

[0160]

[0161] 其中Ap是所需的产品的量；Cp是进料中的产品浓度；而Y是总体方法产率。假定细胞培养上清中的抗体产品的初始滴度为1g/L并且纯化方法的总体方法产率为60％，则实现3天100g生产率的最低进料流速为39mL/分钟。为了确保系统可运行以充裕地实现生产率目标，目标CPT方法进料流速将设置在比最低流速高至少10％的值或约45mL/分钟。

[0162] 一旦确定进料流速，CPT方法设计可以第一单元操作例如捕获步骤(诸如蛋白A亲和色谱步骤)的设计开始。对于连续SMB色谱步骤，设计算法以确定色谱介质的最低(模拟)转运速率开始。其为在没有质量转移阻力的情况下将允许结合所有产物的介质在将存在理想平推流而不存在任何其他非理想参数的情况下的转运速率。为了适应质量转移阻力以及处理其他非理想的因素或限制，实际的色谱介质模拟转运速率将选择为高于最低转运速率。通常，从业人员选择5-40％范围内的安全裕度。在上样区中色谱介质的体积然后取决于通过上样区中的柱子的流速和所需的停留时间，其主要依赖于质量转移现象，诸如扩散。知道所需的停留时间和进料流速，就可以计算上样区中的所需树脂体积。

[0163] 完成第一单元操作的设计后，可将此步骤的出口产品流速设置为等于方法中第二单元操作的入口流速，使得每个连接步骤的水流容量相匹配。与第一单元操作相似的设计算法可应用于方法中的每个单元操作。每个单元操作的批数据可用于开发该单元操作的连续操作设计，其允许联系到之前和后续单元操作。当完成整个纯化方法中所有单元操作的这一过程时，初始CPT方法设计即完成。通过该初始设计，可以定型、制定和订购制造方法所有步骤的合适设备和一次性用品，以适应初始CPT设计的参数和要求。

[0164] 一旦已确立初始设计，接着可通过反复实验对每个方法步骤进行优化，以使任何所需的属性最大化，诸如体积生产率或缓冲液利用。为了建立无缝简洁的连续方法，每个单元操作的大小和通量将由流速(水流容量)而不是待加工的总体积或质量进行控制。对于每个步骤，优化将涉及研究控制单元操作大小和水流容量的原理和现象。例如，使用连续多管柱SMB的色谱步骤的优化将涉及研究分离因子S和转运单元数NTU对方法步骤性能的影响。

[0165] 分离因子S是由与产品进料速率相关的床转运速率所致转运能力的度量，并定义如下：

[0166]

[0167] 其中Φfeed和Φbed分别为液相和固定相的流速(就床而言，Φbed为模拟转运速率)，Qstastic为介质的结合容量，并且Cfeed为进料中的浓度。

[0168] 转移单元数NTU用作逆流色谱系统的质量转移动力学的度量，并定义如下：

[0169] NTU＝koL×a×V/Φfeed

[0170] 其中koL为系统的总体质量转移系数，V为柱体积，并且a为比表面积，其等于颗粒表面积除以柱体积。NTU是系统中的停留时间和特征性质量转移时间的比率。

[0171] 通过评价不同NTU和S值下的性能的实验研究，可以确定每个步骤的最佳加工条件，以便实现所需的生产率同时满足分离或性能目标(例如，蛋白A色谱步骤的宿主细胞蛋白质移除)。除了该优化外，将有利的是研究单元操作的稳定性和对干扰的灵敏性，以便确立集成方法稳健性的一些初步参数。例如，最佳的加工条件可能太接近将会导致不可接受的性能的条件，在此情况下，对条件进行调节以提供最佳和可接受地稳定的性能。

[0172] 最后，在此阶段，应特别注意每一个单元操作的压降。由于其可变为单元操作级联中的限制因素，因此波动容器的安装将是均衡级联中关键点的系统压力并因此需要调节压降以维持所需下游流速的重要装置。

[0173] 通往入口进料速率的每个步骤的稳健性将具有重要的意义，以确保能够适应实际操作中将经历的运行条件的范围。包括在此目标内的是开发整个连续管线的关闭和启动程序，包括本文所述的紧急收集容器的使用程序。

[0174] 在制造方法的连续操作期间，必须在方法中的每个点采样，以确认通过CPT方法实现了预期的产品和方法属性(即纯度、产率)。可对最终纯化的原料产品进行分析，以通过SDS-PAGE和HPLC确定产品纯度、通过ELISA确定具体杂质(例如宿主细胞蛋白质)的清除率以及确定产品浓度使得能够确定总产率。

[0175] 参考文献：

[0176] Rosset AJ,Neuzil RW and Broughton DB.Industrial application of preparative chromatography,in:Rodrigues AE,Tondeur D(eds.),Percolation Processes:Theory and Application,Rockville,MD,Sijthoff&Noordhoff Press；1981.[0177] Van Walsem HJ and Thompson MC,Simulated moving bed in the production of lysine,J.Biotech,1997；59:127-132.

[0178] Trout B and Bisson W,Continuous manufacturing of small molecule pharmaceuticals:the ultra lean way of manufacturing,presented at MIT Leaders for Global Operations Conference；Cambridge,MA；Dec 3-4,2009.

[0179] Bisschops M et al,Single-use continuous,counter-current,multicolumn chromatography.BioProcess International,June2009；7(Supp 5):18-23.[0180] Coffman J.Development of a Protein A SMB step for a Mab with up to 10g/L titers,presented at BioManufacturing and Development conference；Boston,MA；Nov 1-3,2010.

[0181] 通过前述说明，显然的是，可以采用灵活和可用的连续加工方法使得几乎任何生物药品制造过程的运行更高效、成本更低。本文所述的连续加工结构还允许制造方法的运行时间得以明显压缩。

[0182] 虽然上文已经描述了许多实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的公开内容或所附权利要求书的范围的情况下可作出所述方法和设备的修改和变型。上文引述的论文和出版物据此以引用方式并入。