一种用于检测肠道病毒的试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种用于检测肠道病毒的试剂盒及其应用。本发明所提供的试剂盒中含有用于检测肠道病毒的引物对组，由3个引物对组成，其序列为序列表中序列1‑6。本发明提供的试剂盒支持高通量，可快速、准确地检测常见肠道病毒感染，对于临床而言，能够在1小时内获得3种肠道病毒指标的检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的检测也可以用于地域性的流行病学调研和疫情监控，以研究肠道病毒感染在中国的流行情况。

权利要求

1.用于检测肠道病毒的试剂盒，含有成套单链DNA；所述成套单链DNA，由探针组和引物对组组成；

所述引物对组，由如下3个引物对组成：由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1；由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对3；

所述探针组由如下3个单链DNA探针组成：序列表中序列7所示的单链DNA探针1；序列表中序列8所示的单链DNA探针2；序列表中序列9所示的单链DNA探针3；

所述探针组中的每条单链DNA探针的5’端均标记有荧光报告基团FAM，3’端均标记有荧光淬灭基团TAMRA；

所述试剂盒还含有内对照引物对和内对照探针；所述内对照引物对由序列表中序列10和序列11所示的两条单链DNA分子组成；所述内对照探针为序列表中序列12所示的单链DNA探针；所述内对照探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA；

所述试剂盒中还含有碟式芯片；

所述碟式芯片的1#至6#反应腔分别存放干燥的如下（1）-（5）：（1）所述引物对1和所述单链DNA探针1；

（2）所述引物对2和所述单链DNA探针2；

（3）所述引物对3和所述单链DNA探针3；

（4）所述内对照引物对和所述内对照探针；

（5）阴性对照品；

所述碟式芯片为24反应腔碟式芯片。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液；

所述恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM pH 8.0的Tris-HCL， 50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15%体积百分含量DMSO，1M 山梨醇，

20mM 四甲基氯化铵；

所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶 1U/μl，T7 RNA 聚合酶 5U/μl，核糖核酸酶H 0.5U/μl，焦磷酸酶0.5U/μl，RNA酶抑制剂 5U/μl，BSA 0.5μg/μl。

说明书

一种用于检测肠道病毒的试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于核酸扩增技术领域，涉及一种用于检测肠道病毒的试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、致肠细胞病变人孤儿病毒(enterocytopathichumanorphanvirusECHO简称埃可病毒)及新型肠道病毒共71个血清型。肠道病毒属病毒引起的传染病，临床表现轻者只有倦怠﹑乏力﹑低热等，重者可全身感染，脑﹑脊髓﹑心﹑肝等重要器官受损，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡。本类疾病分布于世界各地，在热带和亚热带全年都有，在温带夏季多见，在温暖﹑潮湿﹑卫生条件差﹑人群拥挤的地区发病率高。

[0003] 手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)是由肠道病毒感染引起的临床症候群，具有临床表现多样的特点，多数病例临床表现较轻，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数病例出现呼吸系统、中枢神经系统损害，引起脑炎、心肌炎、肺水肿、弛缓性麻痹等症状，个别重症患儿发病快，导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种，包括柯萨奇病毒A组、肠道病毒71型等。

[0004] 早期快速诊断肠道病毒感染能够及时指导临床治疗为合理选择抗病毒抗细菌药物提供依据并在防止抗生素滥用方面具有重要意义。

[0005] 目前检测常见肠道病毒的方法较多，但都存在不足，如电镜检测方法复杂昂贵，病毒分离培养耗时极长且假阴性较多，在拿到培养结果后通常已失去临床意义，酶联免疫法检测的是病毒特异性抗体但一次仅能检测一种病毒。而基于核酸扩增的核酸检测，由于速度快(通常3小时内可完成检测)、灵敏度高、特异性好，在病毒检测领域正逐渐成为金标准。

[0006] 依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)，即NASBA扩增技术，是由一对引物介导的、在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩增的过程。在41℃恒温条件下，在反应速度方面，NASBA扩增1h可将模板RNA扩增约109～1012倍，而通常的PCR反应需要2～3h。在检测灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低于10gene copies/μl的痕量靶标，而PCR的检测限在100gene copies/μl左右。因此，NASBA技术无论是扩增效率还是检测灵敏度都高于RT-PCR技术。而又由于NASBA的反应仅需要一个41℃的恒温条件，水浴锅即可满足反应要求，不需要复杂的升降温等常规PCR所依赖的温控设备，因此NASBA技术的仪器成本非常低廉。与相应的检测技术结合，NASBA还具有操作简便、特异性强等诸多优点。

发明内容

[0007] 本发明的第一个目的是提供一种用于检测肠道病毒的引物对组。

[0008] 本发明所提供的用于检测肠道病毒的引物对组，由如下3个引物对组成：

[0009] 由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1；由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对3。

[0010] 其中，所述引物对1(Entv_TY)用于扩增肠道病毒；所述引物对2(EV71_VP1)用于扩增肠道病毒EV71型；所述引物对3(CA16_VP1)用于扩增肠道病毒CA16型。

[0011] 本发明的第二个目的是提供一种用于检测肠道病毒的成套单链DNA。

[0012] 本发明所提供的用于检测肠道病毒的成套单链DNA，由探针组和所述引物对组组成；所述探针组由如下3个单链DNA探针组成：序列表中序列7所示的单链DNA探针1；序列表中序列8所示的单链DNA探针2；序列表中序列9所示的单链DNA探针3。

[0013] 其中，所述单链DNA探针1(Entv_TY_MB)用于实时监测所述引物对1的扩增结果；所述单链DNA探针2(EV71_VP1_MB)用于实时监测所述引物对2的扩增结果；所述单链DNA探针3(CA16_VP1_MB)用于实时监测所述引物对3的扩增结果。

[0014] 所述探针组中的每条单链DNA探针的5’端均标记有荧光报告基团FAM，3’端均标记有荧光淬灭基团TAMRA。

[0015] 在本发明所提供的所述成套单链DNA中，每个引物对及其对应的单链DNA探针可单独包装在一个包装内。如所述引物对1和所述单链DNA探针1包装在第一个包装内；所述引物对2和所述单链DNA探针2包装在第二个包装内；所述引物对3和所述单链DNA探针3包装在第三个包装内。

[0016] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测肠道病毒的试剂盒。

[0017] 本发明所提供的用于检测肠道病毒的试剂盒，含有所述引物对组或所述成套单链DNA。

[0018] 所述试剂盒还可含有内对照引物对和内对照探针。所述内对照引物对为用于扩增人基因组中管家基因GAPDH mRNA的引物对GAPD_IC，由序列表中序列10和序列11所示的两条单链DNA分子组成。所述内对照探针(GAPD_IC_MB)为序列表中序列12所示的单链DNA探针，用于实时监测所述内对照引物对(GAPD_IC)的扩增结果。

[0019] 所述内对照探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。

[0020] 所述试剂盒中还可含有恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液。

[0021] 所述恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM pH 8.0的Tris-HCL，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨醇，20mM四甲基氯化铵。

[0022] 所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/μl，T7RNA聚合酶5U/μl，核糖核酸酶H 0.5U/μl，焦磷酸酶0.5U/μl，RNA酶抑制剂5U/μl，BSA 0.5μg/μl。

[0023] 所述试剂盒中还可含有碟式芯片，如24反应腔碟式芯片。

[0024] 在本发明中，所述24反应腔碟式芯片为博奥生物集团有限公司生产的“晶芯RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪”的配套碟式芯片，其型号为1×24。

[0025] 所述碟式芯片的1#至5#反应腔分别存放干燥的如下(1)-(5)：

[0026] (1)所述引物对1和所述单链DNA探针1；(2)所述引物对2和所述单链DNA探针2；(3)所述引物对3和所述单链DNA探针3；(4)所述内对照引物对和所述内对照探针；(5)阴性对照品。

[0027] 所述阴性对照品具体可为无RNA酶的水(Rnase-free水)。

[0028] 其中，将引物和探针包埋入碟式芯片的方法为：将引物、与所述引物相对应的探针、琼脂糖混合，配制成混合溶液，使所述引物、所述探针和所述琼脂糖在所述混合溶液中的终浓度分别为0.2μM、50nM、0.1％(质量百分含量)；取1μl所述混合溶液点入相应的碟式芯片反应腔，于洁净超净台内晾干后，压片封装，冲压抽真空后制成。

[0029] 所述引物对组或成套单链DNA或试剂盒在检测或辅助检测肠道病毒中的非诊断目的应用也属于本发明的保护范围。

[0030] 在所述应用中，将15μl所述恒温扩增缓冲液和10μl所述恒温扩增酶溶液，与25μl待测样本溶液混合后注射入所述碟式芯片中，41℃下恒温反应1h。

[0031] 在所述应用中，可以鼻咽拭子作为待测样本；相应的，所述待测样本溶液可为从鼻咽拭子中提取的RNA。

[0032] 在本发明中，所述肠道病毒具体可为如下中的至少一种：肠道病毒、肠道病毒EV71型和肠道病毒CA16型。

[0033] 本发明提供的试剂盒支持高通量，可快速、准确地检测肠道病毒感染，对于临床而言，能够在1小时内获得3种肠道病毒指标的检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的检测也可以用于地域性的流行病学调研和疫情监控，以研究肠道病毒感染在中国的流行情况。

附图说明

[0034] 图1为碟式芯片及引物点样腔示意图。

[0035] 图2为3种肠道病毒参考品碟式芯片检测结果图。其中，A为含有肠道病毒靶标基因的重组质粒pUC19-Entv在1#反应腔的检测结果；B为含有肠道病毒EV71靶标基因的重组质粒pUC19-EV71在2#反应腔的检测结果；C为含有肠道病毒CA16靶标基因的重组质粒pUC19-CA16在3#反应腔的检测结果。A-C中，E1表示模板为101拷贝/μl，以此类推，E5表示模板为105拷贝/μl；NC表示阴性对照。

具体实施方式

[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0038] 实施例1、用于检测肠道病毒的试剂盒的制备及其使用

[0039] 一、用于检测肠道病毒的试剂盒的制备

[0040] 本发明所提供的用于检测肠道病毒的试剂盒组成如下：

[0041] 1、恒温扩增缓冲液

[0042] 恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM Tris-HCL(pH 8.0)，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨醇，20mM四甲基氯化铵。

[0043] 2、恒温扩增酶溶液

[0044] 恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/μl，T7RNA聚合酶5U/μl，核糖核酸酶H 0.5U/μl，焦磷酸酶0.5U/μl，RNA酶抑制剂5U/μl，BSA0.5μg/μl。

[0045] 3、装载有引物对和单链DNA探针的24反应腔碟式芯片

[0046] 所述24反应腔碟式芯片为博奥生物集团有限公司生产的“晶芯RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪”的配套碟式芯片，其型号为1×24，示意图如图1所示。

[0047] 所述24反应腔碟式芯片的1#至5#反应腔分别存放干燥的如下(1)-(5)：

[0048] (1)引物对1和单链DNA探针1；(2)引物对2和单链DNA探针2；(3)引物对3和单链DNA探针3；(4)内对照引物对和内对照探针；(5)阴性对照品。所述阴性对照品具体为无RNA酶的水(Rnase-free水)。

[0049] 其中，所述引物对1(Entv_TY)用于扩增肠道病毒，由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述引物对2(EV71_VP1)用于扩增肠道病毒EV71型，由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成；所述引物对3(CA16_VP1)用于扩增肠道病毒CA16型，由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成。所述内对照引物对(GAPD_IC)用于扩增人基因组中管家基因GAPDH mRNA，由序列表中序列10和序列11所示的两条单链DNA分子组成。

[0050] 所述单链DNA探针1(Entv_TY_MB)用于实时监测所述引物对1的扩增结果，其核苷酸序列为序列表中序列7；所述单链DNA探针2(EV71_VP1_MB)用于实时监测所述引物对2的扩增结果，其核苷酸序列为序列表中序列8；所述单链DNA探针3(CA16_VP1_MB)用于实时监测所述引物对3的扩增结果，其核苷酸序列为序列表中序列9。所述内对照探针(GAPD_IC_MB)用于实时监测所述内对照引物对(GAPD_IC)的扩增结果，其核苷酸序列为序列表中序列12。每条所述单链DNA探针以及所述内对照探针(GAPD_IC_MB)的5’端均标记有荧光报告基团FAM，3’端均标记有荧光淬灭基团TAMRA。

[0051] 其中，将引物和探针包埋入碟式芯片的方法为：将引物、与所述引物相对应的探针、琼脂糖混合，配制成混合溶液，使所述引物、所述探针和所述琼脂糖在所述混合溶液中的终浓度分别为0.2μM、50nM、0.1％(质量百分含量)；取1μl所述混合溶液点入相应的碟式芯片反应腔，于洁净超净台内晾干后，压片封装，冲压抽真空后制成。

[0052] 二、用于检测肠道病毒的试剂盒的使用方法

[0053] 1、反应体系配制

[0054] 取15μl恒温扩增缓冲液(见步骤一1)、10μl恒温扩增酶溶液(见步骤一2)、25μl待测样本液混合成50μl反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载有引物对和单链DNA探针的24反应腔碟式芯片(见步骤一3)，贴封口膜后迅速离心30s。

[0055] 2、恒温扩增反应与检测

[0056] 将碟式芯片置于博奥Isochip-RT恒温扩增仪中，设置41℃反应1小时，并同时完成实时荧光扫描。

[0057] 3、结果判断

[0058] 反应结束后，根据各反应腔中样本的扩增曲线按照如下方法确定所述待测样本液中是否含有相应肠道病毒的基因组：若所述待测样品产生S型扩增曲线，则所述待测样本液中含有相应肠道病毒的基因组；反之，则所述待测样本液中不含有相应肠道病毒的基因组。

[0059] 实施例2、用于检测肠道病毒的试剂盒的灵敏度和特异性分析

[0060] 一、参考品RNA核酸的制备

[0061] 1、构建包含有肠道病毒靶标基因的质粒

[0062] (1)含有肠道病毒靶标基因的质粒

[0063] 将肠道病毒Entv靶标基因序列的5～1705区段(肠道病毒Entv靶标基因序列的Genbank号Sequence ID:gb|KC755230.1|，Update Date：2013-12-17)插入到pUC19载体(天跟生化公司产品)的多克隆位点EcoRⅤ间，得到重组质粒pUC19-Entv。

[0064] (2)含有肠道病毒EV71靶标基因的质粒

[0065] 将肠道病毒EV71靶标基因序列的4～1695区段(肠道病毒EV71靶标基因序列的Genbank号Sequence ID:gb|HM245928.1|，Update Date：2011-9-27)插入到pUC19载体(天跟生化公司产品)的多克隆位点EcoRⅤ间，得到重组质粒pUC19-EV71。

[0066] (3)含有肠道病毒CA16靶标基因的质粒

[0067] 将肠道病毒CA16靶标基因序列的1392～2564区段(肠道病毒CA16靶标基因序列的Genbank号Sequence ID:gb|AY790926.1|，Update Date：2005-8-9)插入到pUC19载体(天跟生化公司产品)的多克隆位点EcoRⅤ间，得到重组质粒pUC19-CA16。

[0068] 2、参考品RNA核酸的制备

[0069] 供试重组质粒：步骤1构建的3种含有相应肠道病毒靶标基因的重组质粒。

[0070] (1)酶切：先将各供试重组质粒使用EcoRI内切酶37℃酶切2h。

[0071] (2)转录：按5μl 5×Transcription Optimized Buffer(Promega)，2U T7RNA聚合酶，10mM DTT(Promega)，10U重组RNA酶抑制剂(Promega)，2mM rNTP，酶切产物5μl配制总体积为50μl的反应体系，震动均匀后37℃转录4h。

[0072] (3)消化：将转录完成后的体系加入1μl的DNA消化酶(rDnaseI，5U/μl)，震荡离心，37℃孵育20min。

[0073] (4)纯化：使用Macherey-Nage公司的RNA纯化试剂盒产品(其产品目录号为740948)按如下步骤纯化转录产物RNA：a)配制RA1-C2H5OH混合液：以RA1:C2H5OH＝1:1(体积比)的比例配制。每100μl的转录产物中，需要加入600μl RA1-C2H5OH混合液，即300μl RA1+
300μl C2H5OH溶液，在这里需要根据转录产物的管数计算所配混合液的体积。若产物不足
100μl，则用水将产物的量补到100μl(即在每管产物中加入50μl的天根Rnase-free H2O)。
b)将之前准备好的RA1-C2H5OH混合液分到1.5ml离心管内，两管，每管600μl，将100μl产物转入到相对应的离心管内，管内共700μl，充分震荡离心。c)准备两个吸附柱，并做好相应的标记，将700μl产物混合液转入到吸附柱内(吸附柱最大容量为700μl)，1.2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。d)在吸附柱内加入700μl的RA3，放置1min，使其可以充分的分散在吸附柱的底部，1.2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。e)在吸附柱内加入350μl的RA3，放置2min，1.2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。f)在吸附柱内加入300μl的RA3，放置2min，1.2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。g)打开吸附柱的盖子3min后，1.2万rpm空离2min，倒掉下层溶液，重复此步骤一次。h)空离结束以后，把吸附柱转移到相对应的离心管中，打开吸附柱盖子放置15min，使乙醇挥发完全，在吸附柱中加入60μl Rnase-H2O(试剂盒里自带的)洗脱，放置2min，1.2万rpm离心2min。i)将离心所得模板吸回吸附柱中，放置2min，1.2万rpm离心2min，重复此步骤两次。j)丢掉吸附柱，将离心管内的模板取出2μl，用Nano drop测定其浓度，并记录其浓度及其260/280，260/230比值。

[0074] 二、用于检测肠道病毒的试剂盒的灵敏度和特异性分析

[0075] 1、不同浓度的参考品模板制备

[0076] 将上述步骤一纯化后的各RNA模板(对应步骤一1中构建的3种重组质粒)均计算定量至1010拷贝/μl，并梯度稀释，得到105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、10拷贝/μl等不同浓度的模板稀释液。

[0077] 2、反应体系配制

[0078] 取15μl恒温扩增缓冲液(见实施例1步骤1)、10μl恒温扩增酶溶液(见实施例1步骤2)、25μl某浓度的模板稀释液混合成50μl反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载有引物对和单链DNA探针的24反应腔碟式芯片(见实施例1步骤3)，贴封口膜后迅速离心30s。

[0079] 3、恒温扩增反应与检测

[0080] 将碟式芯片置于博奥Isochip-RT恒温扩增仪中，设置41℃反应1小时，并同时完成实时荧光扫描。并按照实施例1步骤二3的方法对结果进行判定。

[0081] 三、结果

[0082] 结果如图2所示：

[0083] (1)对于重组质粒pUC19-Entv的RNA样品而言，24反应腔碟式芯片的1#反应腔对105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、10拷贝/μl模板的检测结果均有明显的S型扩增曲线，显示为阳性；而2#和3#反应腔均无扩增曲线，显示为阴性。

[0084] (2)对于重组质粒pUC19-EV71的RNA样品而言，24反应腔碟式芯片的2#反应腔对5 4 3 2
10拷贝/μl、10拷贝/μl、10 拷贝/μl、10拷贝/μl、10拷贝/μl模板的检测结果均有明显的S型扩增曲线，显示为阳性；而1#和3#反应腔均无扩增曲线，显示为阴性。

[0085] (3)对于重组质粒pUC19-CA16的RNA样品而言，24反应腔碟式芯片的3#反应腔对105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、10拷贝/μl模板的检测结果均有明显的S型扩增曲线，显示为阳性；而1#和2#反应腔均无扩增曲线，显示为阴性。

[0086] 另外，对于所有的3种重组质粒的RNA样品而言，24反应腔碟式芯片的4#反应腔(内对照)和5#反应腔(阴性对照)均无扩增曲线。4#反应腔(内对照)之所以无扩增曲线是因为待测样本是3种重组质粒的RNA核酸，不含有人基因组中管家基因GAPDH的RNA。

[0087] 以上结果说明该试剂盒具有较高的扩增灵敏度和扩增特异性。

[0088] 实施例3、实际临床样品的检测

[0089] 一、临床样本类型

[0090] 本实施例所采用临床样本来自深圳三院于采集的鼻咽拭子样本(本着本采集者自愿的原则)，所采拭子存放于3mL生理盐水中，共560例。

[0091] 二、临床样本中病毒核酸的提取

[0092] 临床样本病毒核酸提取所用的试剂盒为QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)，按如下步骤进行提取：

[0093] (1)取步骤一中存放临床样本拭子的生理盐水140μl于1.5ml离心管中；

[0094] (2)加入560μl含有Carrier RNA混合液的Buffer AVL(即5.6μl Carrier RNA混合液+560μl Buffer AVL于离心管中，轻微漩涡15s；

[0095] (3)瞬时离心完成后，室温(15-25℃)放置10-20min，以保证Buffer AVL在离心管中有充足的时间进行裂解；

[0096] (4)加入560μl乙醇(96-100％，体积百分含量)于离心管中，漩涡混匀15s，离心；

[0097] (5)取630μl样本溶液于吸附柱中，放置2min，使其与吸附柱充分接触，8000rpm，离心1min，换干净收集管；

[0098] (6)若样本溶液多于630μl，则重复上一步；

[0099] (7)在吸附柱中加入500μl的AW1洗液，放置2min，使其与吸附柱充分接触，8000rpm离心1min，换干净收集管；

[0100] (8)在吸附柱中加入500μl的AW2洗液，放置2min，使其与吸附柱充分接触，12000rpm离心3min，换干净收集管；

[0101] (9)在吸附柱中加入300μl的AW2洗液，放置2min，使其与吸附柱充分接触，12000rpm离心3min，换干净收集管；

[0102] (10)将吸附柱盖子打开放置2min，使其内外压强一致，8000rpm空离1min。空离结束以后，重复此步骤一次。

[0103] (11)空离结束后，将吸附柱转移到1.5ml离心管中，打开吸附柱盖，放置20-30min，使乙醇挥发完全；

[0104] (12)加入50μl Buffer AVE洗脱核酸，8000rpm离心1min，离心完成以后，将洗脱下的核酸吸回吸附柱，离心1min后丢掉吸附柱。

[0105] 三、实际临床样品的检测

[0106] 1、反应体系配制

[0107] 取15μl恒温扩增缓冲液(见实施例1步骤一1)、10μl恒温扩增酶溶液(见实施例1步骤一2)、25μl步骤二提取得到的临床样本溶液混合成50μl反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载有引物对和单链DNA探针的24反应腔碟式芯片(见实施例1步骤一3)，贴封口膜后迅速离心30s。

[0108] 2、恒温扩增反应与检测

[0109] 将碟式芯片置于博奥Isochip-RT恒温扩增仪中，设置41℃反应1小时，并同时完成实时荧光扫描。并按照实施例1步骤二3的方法对结果进行判定。

[0110] 实验同时设置常规RT-PCR方法用于本发明试剂盒检测结果的可靠性验证。用于检测各肠道病毒的特异性RT-PCR引物序列如表1所示。

[0111] 表1用于检测3种肠道病毒的特异性RT-PCR引物序列

[0112]指标名称 RT-PCR上游引物(5’-3’) RT-PCR下游引物(5’-3’)
肠道病毒 CCCCTGAATGCGGCTAATCCYAAC CCAATCCAATAGCTATATGGYAACAA
肠道病毒EV71型 AACACCCGTAYGTGCTTGATGCTGG TAGGGATTACTGGCGTCGCTCCTTG
肠道病毒CA16型 CACCCCCATGCARCGCTTGTGYTTT TRGACTGCCACGGRCCATCTCTTCC

[0113] 四、结果

[0114] 本发明试剂盒的检测结果显示，针对每一种肠道病毒，采用RT-PCR方法检测阳性的样本例采用本发明试剂盒检测均显示阳性结果。以上表明，本发明试剂盒对相应肠道病毒的检测结果准确可靠。本发明试剂盒和RT-PCR法检测肠道病毒临床样本的统计结果参见表2。

[0115] 表2本发明试剂盒和RT-PCR法检测肠道病毒临床样本的统计结果

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