用于促进伤口愈合的短生物活性肽

摘要

本发明公开具有生物活性的具有4至6个氨基酸残基的肽。这些肽构成本身为抗微生物蛋白天蚕杀菌素(cecropin) B的片段的肽HB‑107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)的短片段，且展现细胞刺激和迁移性质。本发明肽包括位于HB107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)的位置11与16之间的4至6个连续氨基酸残基(即EKMGRN)。该公开的肽包括用于医学治疗诸如来自糖尿病溃疡等皮肤创伤的可用的剂。所述肽也有效地预防并逆转源自各种环境伤害的皮肤表面损伤。重要的是，所述肽的治疗效应在等于或大于肽HB‑107的那些的浓度下呈现，且因此代表用于研发有效疗法的较廉价、更通用的方式。也公开产生及使用这些肽的方法。

权利要求

1.一种分离肽，其中所述肽的序列是由SEQ ID NO:4 (EKMG)或SEQ ID NO:5 (MGRN)或SEQ ID NO:2 (KMGRN)组成，其中所述肽呈游离酸形式，在羧基端酰胺化或在氨基端脂化。

2.如权利要求1所述的肽，其为SEQ ID NO:4 (EKMG)或SEQ ID NO:5 (MGRN)或SEQ ID NO:2 (KMGRN)。

3.如权利要求1所述的肽，其包括L-及D-氨基酸镜像异构物中的任一者或两者。

4.一种组合物，其包括至少一种如权利要求1至3任一项所述的肽和医药上可接受的载剂。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述肽是以介于0.1 μg/mL至500 μg/mL范围内的浓度存在。

6.如权利要求4所述的组合物，其中所述肽是以介于0.1 μg/mL至20 mg/mL范围内的浓度存在。

7.如权利要求4所述的组合物，其中所述组合物呈以下形式：气溶胶、液体、凝胶、微囊封剂、乳霜、糊剂、软膏、粉剂或泡沫，或纳入适于施加至皮肤或粘膜组织表面或在该皮肤组织下的装置中。

8.如权利要求4所述的组合物，其中所述组合物呈以下形式：乳液、洗剂或溶液。

9.一种组合物，其用于当以治疗有效量施加有效量的时间时愈合哺乳动物的伤口，其中所述组合物包括医药上可接受的载剂和至少一种如权利要求1至3中任一项所述的肽。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述伤口影响所述哺乳动物的皮肤或相关粘膜组织。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述伤口是由于起泡、烧伤、撕裂、溃疡、擦伤、皮疹、瘢痕、妊娠纹或老化或环境暴露的效应。

12.如权利要求10所述的组合物，其中所述伤口是由于擦破。

13.如权利要求4至11中任一项所述的组合物，其用于皮肤护理治疗。

14.如权利要求4至11中任一项所述的组合物，其用于化妆产品。

15.一种如权利要求1至3中任一项所述的肽的用途，其用于制造用来治疗哺乳动物的皮肤或粘膜组织伤口的药剂。

16.如权利要求15所述的用途，其中所述伤口是由于起泡、烧伤、撕裂、溃疡、擦伤、皮疹、瘢痕、妊娠纹或老化或环境暴露的效应。

17.如权利要求15所述的用途，其中所述伤口是由于擦破。

18.组合物在制备治疗哺乳动物的皮肤或粘膜组织的伤口的药物中的用途，其包括向伤口位点施用组合物，所述组合物包含由SEQ ID NO:4 (EKMG)或SEQ ID NO:5 (MGRN)或SEQ ID NO:2(KMGRN)组成的序列的肽。

19.权利要求18所述的用途，其中所述肽是SEQ ID NO:4 (EKMG)或SEQ ID NO:5 (MGRN)或SEQ ID NO:2 (KMGRN)。

20.权利要求18所述的用途，其中所述肽包括L-及D-氨基酸镜像异构物中的任一者或两者，或缀合至载剂分子，经酰胺化或脂化。

21.权利要求18所述的用途，其中所述肽呈游离酸形式。

22.权利要求18所述的用途，其中所述伤口是由于起泡、烧伤、撕裂、溃疡、擦伤、皮疹、瘢痕、妊娠纹或老化或环境暴露的效应。

23.权利要求18所述的用途，其中所述伤口是由于擦破。

说明书

用于促进伤口愈合的短生物活性肽

[0001] 本申请案涉及于2013年2月14日提交的美国临时申请案第61/764,913号的优先权，该申请案的全文以引用方式并入本文中。

[0002] 【发明背景】

[0003] 本发明涉及具有生物、化妆品及治疗活性的肽。具体而言，本发明涉及刺激角质形成细胞细胞增殖及迁移的SEQ ID NO:1 (EKMGRN)的4至6个连续氨基酸残基的短肽。本发明进一步涉及使用所述肽来促进伤口修复和治疗侵袭皮肤及其它相关体表(例如口腔)的多种损伤的方法。

[0004] 【发明背景】

[0005] 皮肤是身体的最大器官且是环境与内部生物之间的界面。它是由两个主要层构成：表皮，其为皮肤的最外层；和真皮，其正好在表皮下面。角质形成细胞是构成95%表皮的主要细胞。上基部角质形成细胞分化成由蛋白质和脂质(包含神经酰胺、胆固醇及脂肪酸)围绕的在化学及物理上有抗性的角质层。自然或强制移除此角化上皮的顶层会刺激下面的细胞转换来替代受损或损失的细胞。此角化层在身体与环境之间提供保护及水障壁功能。角质形成细胞的主要功能是形成障壁来保护身体免于化学、物理及机械危害、微生物的侵袭、热、UV辐射及失水(Proksch等人，2008)。角质形成细胞也是与表皮连续的粘膜组织的主要成份(Presland及Dale，2000)。

[0006] 伤口定义为皮肤的上皮完整性的破坏。正常伤口愈合涉及复杂且动态但良好协调的一系列事件，包含发炎、新组织形成及组织重塑。伤口愈合开始于组织受损的时刻且需要上皮形成与真皮修复的精确配合，其中上皮形成过程最终取决于角质形成细胞的迁移、增殖及分化能力(Singer及Clark，1999)。在上皮形成期间，位于伤口外围的角质形成细胞迁移且增殖以在伤口上方形成单层。角质形成细胞的进一步增殖及分化建立包括正常复层的表皮层。具有正常真皮成纤维细胞的角质形成细胞也使得I型及III型胶原的mRNA上调、成纤维细胞增殖增加及细胞外基质累积并重塑，以通过恢复组织的结构及功能来完成愈合(Bergers G和Coussens LM，2000)。因此，角质形成细胞增殖和迁移的能力对于在皮肤表面上实施所述过程至关重要。鉴于已知某些生长因子在伤口愈合期间天然地参与，已有工作致力于研发用于治疗伤口的基于生长因子的方法(Mustoe等人，1994；Steed，1995)。然而，大多数采用该策略的尝试无法达成临床上显著的结果，这部分归因于与使用诸如所涉及的大尺寸的蛋白质等治疗性蛋白质相关联的困难。使用生长因子的疗法也受损于制备较大蛋白质相关的复杂性及高成本。宿主防御肽(HDP) (也称为抗微生物肽) 已被暗示为皮肤伤口愈合的调控剂。由于他们的尺寸较小，这些短活性肽已吸引治疗剂研发的注意(Zhang和Falla，2006)。

[0007] HDP在自然界中普遍存在且形成真核生物的固有免疫系统的中心组分。它们作为病原体清除以及宿主细胞行为调节的效应子来促进组织再生和修复而言对于固有宿主防御至关重要。正常伤口修复涉及发炎、上皮形成、组织-肉芽及重塑的精确协调。已显示宿主防御肽影响所有这些行为。抗菌肽PR-39具有通过抑制嗜中性粒细胞氧化酶活性的抗发炎功能，且诱导伤口修复中重要的多配体蛋白聚糖，硫酸肝素蛋白聚糖(Gallo等人，1994；Shi J., Ross, CR.等人，1996)。也显示，抗菌肽家族宿主防御肽的另一成员LL-37影响器官培养物中人类皮肤伤口的上皮再形成(Heilborn JD等人，2003)。人类嗜中性粒细胞防御素促进I型胶原的表达，同时抑制间质胶原酶的表达(Oono T.等人，2002)。此外，极其不同的人类抗菌肽LL-37与人类β-防御素-3促进包含刺激上皮细胞迁移、促进血管生成及阻抑促发炎反应的活性(Steinstraesser等人，2008, 2009)。其吸引嗜中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞及T淋巴细胞，且也在许多细胞类型中诱导产生嗜中性粒细胞及单核细胞趋化因子。HDP最近也已被暗示为通过调节发炎、血管生成以及细胞外组织沉积及重塑的皮肤伤口修复的调控剂。已显示HDP对伤口修复的影响并不取决于抗微生物功能，且提供了用于HDP的潜在的新颖临床应用。我们先前已报导，在鼠类模型中衍生自天蚕杀菌素B的非抗微生物宿主防御肽HB 107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)保留了帮助伤口修复的能力，且利用HB 107所观察到的益处与用生长因子rhPDGF治疗伤口无法区分(Lee等人，2004)。HB 107治疗的伤口的组织学分析表明，在HB 107治疗的伤口中表皮增生增多，此指示HB 107可影响角质形成细胞增殖或迁移(Lee PH.等人，2004)。最近已描述HDP的一组新型合成变体(称为固有防御调控剂(IDR))，其提供针对多重抗药性细菌的全身性感染的广谱保护(Easton DM.等人，
2009)。例如，IDR-1及IDR 1002通过增强宿主的固有免疫防御同时阻抑潜在有害的过度发炎反应来赋予针对微生物挑战的保护(Easton等人，2009；Nijnik A.等人，2010)。

[0008] 【发明概述】

[0009] 本发明涉及可用于促进哺乳动物的伤口愈合的短生物活性肽。由分离的肽优选靶向的伤口是影响皮肤和相关粘膜表面的那些。尽管不受限于任何具体机制，但本发明肽能够通过刺激细胞增殖及迁移来影响伤口愈合。本发明肽以体外及体内方式是可用的，且能够在角质形成细胞中诱导上述的活性。

[0010] 本发明的一个实施方案涉及含有位于HB 107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)的位置11和16之间(即EKMGRN (SEQ ID NO:1))的4至6个连续氨基酸残基的分离肽。分离肽可含有氨基酸的L-或D-镜像异构物形式或其组合。根据本发明的另一实施方案，分离肽可偶联至载体蛋白，或用脂肪酸经C端酰胺化或N端乙酰化修饰(即脂化)。在将肽施加至其皮肤和伤口时，这些添加增强肽的生物活性。

[0011] 根据本发明的某些优选实施方案，分离肽都含有甲硫氨酸。分离肽的特定实施方案包括SEQ ID NO: 1、2、3、4及5，其中的所有都显示针对细胞增殖及迁移的刺激活性且影响伤口修复。

[0012]SEQ ID NO. HB编号 序列
     
1 HB2265 EKMGRN
2 HB2262 KMGRN
3 HB2263 EKMGR
4 HB2234 EKMG
5 HB2235 MGRN

[0013] 本发明的另一实施方案涉及制造用于治疗组合物或化妆品组合物的药剂，所述组合物含有医药上或化妆品上可接受的载体及一或多种上述的肽。上述的组合物可用于愈合哺乳动物的皮肤伤口的药剂或化妆品应用。所述组合物中肽的浓度优选介于约0.1 μg/mL至约500 μg/mL，或约0.1 μg/mL至约20 mg/mL范围内。组合物的优选形式为气溶胶、乳液、液体、溶液、洗剂、乳霜、糊剂、软膏、粉剂、凝胶及泡沫。

[0014] 此外，本发明的肽及含有它们的组合物可提供对纳入一般皮肤护理及化妆品调配物(例如，各种皮肤化妆品、皮肤乳霜、洗剂、防晒剂及治疗性洗剂或乳霜(例如用于雷射程序后护理的抗痤疮调配物))中而言有用的特征。

[0015] 本发明也涉及将上述的组合物用于愈合哺乳动物伤口的方法。通常，治疗方法需要向伤口、尤其皮肤(表皮)及相关粘膜组织的那些给予有效量的含肽组合物，保持有效时间量。所述伤口包含手术伤口、擦破、起泡、烧伤、撕裂伤、溃疡、擦伤、皮疹、瘢痕、妊娠纹以及因老化及环境暴露的内因性及外因性效应所致的皮肤损伤（包含起皱、皮肤下垂及光损伤）。

[0016] 【发明详述】

[0017] 美国专利第5,962,410号、第5,861,478号及第7,696,174号提供可用于理解本发明的 公开内 容，且所述专利的全文以引 用方式并入本文中。肽HB107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN) (SEQ ID NO: 10)本身构成其为存在于蛾物种中的抗微生物蛋白的天蚕杀菌素B的片段。尽管HB-107不展示衍生出它的蛋白质的抑菌效应，但其确实展示表皮伤口愈合质量(Lee等人，2004)。此19个氨基酸的残基肽是刺激对伤口愈合至关重要的角质形成细胞增殖、迁移、刮伤闭合及抗发炎活性的多功能免疫调节剂。

[0018] 基于此基本原理，当前研究中我们聚焦于由SEQ ID NO: 1 (HB2265)表示的6个氨基酸的一段序列，HB107的位置11-16的EKMGRN。

[0019] 包括位于HB 107中的4至6个连续氨基酸残基的肽的合成说明

[0020]

[0021] 我们进一步产生由SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、7、8及9表示的包括来自SEQ ID NO: 1的3至5个连续氨基酸残基的肽。为评价新衍生的肽是否具有伤口愈合活性，使肽SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8及9经历角质形成细胞刮伤测试——被公认用于评价活性化合物促进伤口闭合的能力的测定。表1中显示， SEQ ID NO 1、2、3、4及5的肽在介于10 μg/ml与20 μg/ml之间的浓度下显著诱导刮伤闭合。与视为100%的经PBS治疗的伤口闭合百分比相比，由SEQ ID NO: 1、2、3、4及5诱导的伤口闭合百分比介于182%-218%范围内。然而，由SEQ ID NO: 6 (HB2268)及SEQ ID NO: 7 (HB2269)表示的三肽及四肽HB2232都无法诱导刮伤闭合(表1)。也显示，在相同体外角质形成细胞刮伤测试中，缺少氨基酸甲硫氨酸残基(GRNIRN)的另一肽SEQ ID NO: 9 (HB1062)无法促进刮伤闭合(表1)。因此，有对于所观察到的伤口愈合活性必须的两个关键要素。在所指定序列中，第一，必须为最少四个连续氨基酸残基；
及第二，必须含有甲硫氨酸残基。HB2232 (KIEK)及HB1062 (GRNIRN)二者对于促进刮伤闭合而言失活的事实表明，甲硫氨酸残基是不可替代的氨基酸，其必须作为四个或更多个连续残基中的一个氨基酸存在以促进伤口愈合活性。我们因此推断出，在位于位置11至16的HB107的中心区域中(在EKMGRN内)必须含有甲硫氨酸残基的4至6个连续氨基酸残基促进伤口修复。为确认该活性并非归因于肽对角质形成细胞的毒性，使所有肽经历MTT细胞毒性测试。所测试的肽在高达500 μg/ml的浓度下对体外正常皮肤角质形成细胞都无细胞毒性(表
1)。

[0022] 对体外刮伤闭合观察到的活性与肽的增殖活性密切相关，如体外角质形成细胞增殖测定中所显示(表2)。在较低浓度下增殖活性更显著。对于每种肽而言刺激角质形成细胞增殖活性所需的最佳浓度可变化，但通常介于0.625 μg/ml至5 μg/ml范围内(表2)。SEQ ID NO 1 (HB2265)在2.5 μg/ml及5 μg/ml下显示活性，且SEQ ID NO 2 (HB2262)在0.625 μg/ml至5 μg/ml所测试的所有浓度下刺激角质形成细胞增殖。SEQ ID 3 (HB2263)、SEQ ID 4 (HB2234)及SEQ ID 5 (HB2235)在0.625 μg/ml至2.5 μg/ml的相对较低的浓度下赋予该活性。三肽HB2268 (KMG)及HB2269 (GRN)在所测试的所有浓度下似乎并不显示增殖活性。四肽HB2232也不诱导角质形成细胞增殖(表2)。总之，本发明的肽具有针对皮肤角质形成细胞增殖的调节活性，且该活性对于皮肤伤口修复至关重要。

[0023] 为更好地理解该机制，将一代表性肽SEQ ID NO: 3 (HB2235)用于使用EPIDERM™组织替代物(MatTek, Ashland MA)通过SUNNY BIODISCOVERY™基因分布型(Santa Paula, CA)实施的基因分布型研究。将皮肤替代物平衡过夜，然后使用20G针施加全厚度穿刺伤口，随后用一式两份肽或水对照治疗24 hr。也使用一组两种正常组织作为对照以观察受伤组织与正常组织之间的基因分布型变化。在治疗结束时，提取RNA且使其经历PCR测定分析。首先比较受伤未经治疗对未受伤未经治疗组织以观察响应于伤损的基因的表达谱，然后比较受伤未经治疗对受伤经HB2235治疗的组织。表3列出一些在伤口愈合级联的不同信号传导途径中受显著影响的基因。受影响基因表示编码基质蛋白(例如胶原及整合蛋白)的那些、促发炎级联中的基因(例如细胞因子及趋化因子受体)、参与组织重塑过程的基因(例如基质金属蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活物及蛋白酶抑制剂)及其它参与伤口愈合的基因。成功的伤口愈合是涉及许多细胞类型、非细胞组分(例如纤维蛋白和胶原)以及生物活性化学物类的混合剂的良好协调过程。尽管其是重迭过程的连续级联，但通常将它分成三个时期：发炎；增殖；及重塑。如表3中所显示，急性受伤或创伤后，与正常未受伤皮肤组织相比，通常与促发炎细胞因子及趋化因子受体相关的基因显著上调。例如，C-X-C趋化因子配体2和5分别上调4.29倍及2.93倍(表3)。粒细胞巨噬细胞群落刺激因子2和介白素-6信号转导子也分别上调1.87倍及1.93倍。在发炎期期间，血小板在创伤位点聚集，然后白血球(例如嗜中性粒细胞和巨噬细胞)浸润至伤口位点中，在此期间形成富含纤维蛋白的凝块以防止进一步失血，且该凝块用作早期细胞迁移至伤口中的支架。在创伤后24 hr内观察到的发炎信号(受伤对正常组织)始终一致，且对于在生理学条件下将嗜中性粒细胞和巨噬细胞吸引至创伤位点至关重要。富含纤维蛋白的凝块最终在稍后阶段中通过诸如纤溶酶等蛋白质分解。纤溶酶的产生受组织纤维蛋白溶酶原激活物的存在的管控，该活化剂是与基质金属蛋白酶(MMP)的功能密切结合将纤维蛋白溶酶原转化成纤溶酶的蛋白质。此于表3中清晰可见，创伤后24 hr时编码组织及尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物(PLAT及PLAU)二者以及MMP (MMP-1)的基因上调。在正常伤口愈合过程中，重塑阶段是在较长时间标度上发生，通常花费数周完成，该阶段涉及合成并重塑胶原的成纤维细胞和角质形成细胞的快速增殖时期。在仔细检查经HB2235治疗的受伤组织时，我们观察到在伤口愈合级联中存在若干受HB2235影响或调节的关键步骤。第一，该肽明显缩短初始发炎期的持续时间，如在用HB2235治疗24 hr后编码促发炎细胞因子和趋化因子受体的基因显著下调所指示(表3)。与发炎信号的下调一致，抗发炎细胞因子IL-10上调(表3)。此具有重大意义，原因是众多研究指示缩短发炎过程的长度或持续时间可明显地促进伤口愈合，因为很明显，延迟伤口愈合与贯穿伤口愈合的所有阶段的明显发炎相关(Leitch等人，2009；Wang等人，2006)。第二，在治疗24 hr后HB2235显著下调编码纤维蛋白溶酶原激活物及MMP的基因，这指示其可加速组织肉芽过程。
第三，通过调节编码对细胞迁移及增殖活性至关重要的生长因子(例如TGF-β 1、PDGF、EGF)的基因，该肽明显参与上皮再形成及组织重塑过程的加速，在此期间新形成的组织开始覆盖伤口区域以完成组织修复。最显著地，经HB2235治疗的组织显示超过玻连蛋白(VTN)5倍的上调(表3)。VTN是于细胞外基质中发现的丰富糖蛋白且众所周知促进角质形成细胞黏附、增殖和迁移(Upton等人，2008)。第四，与细胞增殖及迁移活性一致，HB2235刺激编码对上皮再形成及组织重塑至关重要的基质蛋白(例如胶原及整合蛋白)的基因的上调(表3)。
基因阵列分析强烈支持该肽通过促进细胞增殖和迁移以及基质重塑和胶原刺激来加速上皮形成过程。

[0024] 本发明的肽(包含SEQ ID NO 1、2、3、4和5)展示对角质形成细胞迁移和增殖的上调至关重要的活性，而角质形成细胞迁移及增殖对在角质形成细胞所驻留的表皮组织中的伤口愈合过程至关重要。本发明中所公开的肽比先前所公开的序列新颖且短。由本发明的肽引起的生物活性是细胞增殖及迁移，二者在调介伤口愈合功能中都发挥重大作用。

[0025] 由于尺寸较小，本发明的例如具有4个氨基酸残基的肽就制造而言是较容易的且因此显著成本有效的。而且，与较大肽相比，所公开肽对于化学修饰而言易于操纵且较少溶解度问题。其易处置使得较大数目的药物递送选择成为可能，例如要使用的媒剂和如何施用它。本发明肽的小尺寸及较大溶解度允许经由以下来增加其愈合潜能：增加伤口位点处的吸收和保留；将局部角质形成细胞和其它细胞于较高浓度的肽下暴露较长时间段。

[0026] 所有所公开的肽都可使用标准Fmoc (9-芴基甲氧基羰基)固相化学法来合成。每种上文所描述的肽可包括L-或D-氨基酸镜像异构物。肽的羧基端可为酸性(-COOH)或经酰胺化的(例如，-CONH2、-CONHR或-CONR2)。羧基端的酰胺化可使本发明肽与游离酸形式相比较不易受蛋白酶降解影响且增加其极性，从而提供提高的治疗潜能。其论述，N端脂化或乙酰化可在不改变肽的生物活性功能的情况下改良穿过皮肤的肽渗透性(Samah A，2011)。因此，肽也可经脂化，这可提供增强的皮肤渗透性。可用于提供本发明化合物的C12-18脂质组分的饱和或不饱和脂肪酸的实例包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、油酸及亚麻油酸。

[0027] 肽可偶联至可溶或不可溶载剂分子以按需修饰其溶解度性质并增加靶组织中肽的局部浓度。可溶载剂分子的实例包含聚乙二醇(PEG)与聚乙烯吡咯烷酮的聚合物；不可溶聚合物的实例包含但不限于硅酸盐、聚苯乙烯及纤维素。肽可使用脂质体技术或经由纳米技术来微囊封以增强其稳定性且用于控制释放以增强其在应用期间及之后的稳定性。

[0028] 本发明涉及使用例如在调配物中或作为治疗剂的上文所描述的肽的方法。这些方法可涉及单个肽或多个肽组合的使用。在某些情况下，本发明组合物可布置在置于皮肤上、皮肤中或皮肤下的装置内。所述装置包含通过被动或主动释放机制接触皮肤或毛囊的方式而释放物质的经皮贴片、植入物及注射剂。在本文所描述的方法中用于递送肽的组合物可呈以下形式：气溶胶、乳液、液体、洗剂、溶液、凝胶、微囊封剂、乳霜、糊剂、软膏、粉剂、泡沫或其他医药上可接受的调配物。此外，所述肽可使用较少涉及的调配物(例如去离子水/蒸馏水、PBS或标准医用盐水溶液)来递送。

[0029] 调配物可任选具有化妆品吸引力及/或含有诸如类视色素、维生素C或其它肽等可用作本发明肽的治疗作用的佐剂的其它试剂。也可将抗生素添加至调配物中以避免感染，由此允许发生最大愈合过程。

[0030] 该调配物可含有蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂可经选择以特异性靶向预期将使所选生物活性肽降解的蛋白酶；该选择将基于生物活性肽的长度及/或序列来确定。然而，蛋白酶抑制剂未必是以任何特定方式来选择；例如，可在本发明中采用含有两种或更多种抑制剂的蛋白酶抑制剂混合剂。可将以下类型的蛋白酶抑制剂纳入本发明中：丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、硫醇蛋白酶抑制剂及苏氨酸蛋白酶抑制剂。本发明中所使用的蛋白酶抑制剂可为肽或蛋白质或化学品。所述抑制剂的非限制性实例为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，其包含α-1-抗胰蛋白酶、补体1-抑制剂、抗凝血酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂1和神经丝抑蛋白；或化学品，包含但不限于熊果酸及凝血酸，其可用作本发明肽的治疗作用的佐剂。

[0031] 本发明的肽可用于治疗皮肤的伤口。皮肤表皮由主要自角质形成细胞制造的高度动态的复层上皮组成。诸如成纤维细胞等其它细胞类型也位于表皮中。新分化的角质形成细胞自表皮的增殖性基底层连续出现以补充上部层，逐渐分化成外部角化且脱落的死包膜。角质形成细胞也是与表皮连续的粘膜组织的主要成份(Presland和Dale，2000)。该组织缺少表皮的不可渗透的角化层，且形成与口、鼻、咽喉、耳、肛门及生殖器相关的内衬表面。与皮肤类似，粘膜表面对于防止感染物进入身体的各个组织至关重要，因此，创伤这些组织类型可损害个体的健康。皮肤及粘膜组织损伤发生在表皮层因例如撕裂、烧伤或起泡而破裂时。创伤也可涉及在不同时撕裂伤表皮的情况下涉及组织损伤的压伤或瘀伤。皮肤感染以及某些慢性疾病(例如癌症及自体免疫疾病)也可对表皮表面造成不利影响。溃疡(例如侵袭糖尿病人的那些或与褥疮相关的那些)是皮肤损伤的另一形式；这些伤口通常非常难处理、会发炎、容易感染且需要长期愈合过程。溃疡或其它类型的慢性伤口的持久性归因于参与愈合的细胞过程的失效。伤口愈合的失效可能部分地因伤口边界处的角质形成细胞未迁移以闭合或覆盖疮疡的事实所致的无法使伤损形成上皮的结果(Enoch及Price，2004)。
皮肤和粘膜伤口的愈合部分经由基底角质形成细胞的活化来协调。活化时，位于伤口外围的角质形成细胞增殖并迁移以在称为上皮形成的过程中在伤口上方形成单层。角质形成细胞的进一步增殖和分化建立包括正常复层的表皮层(Enoch和Price，2004)。因此，本发明也可用于治疗与粘膜组织中的角质形成细胞相关的损伤。术语“相关粘膜组织”是指以类似于皮肤的方式组织的任何组织且含有上皮细胞/角质形成细胞。所述组织的实例是口、鼻咽、耳及泌尿生殖表面以及眼睛的眼睑结膜。可影响这些组织且适于用本发明肽治疗的伤口或伤损/损伤的实例是擦破、起泡、烧伤、撕裂伤、穿刺、溃疡、擦伤、皮疹及瘢痕。术后外伤也可用所述肽来治疗。

[0032] 表皮损伤的另一形式是细微的且经较长时间段产生，最终损害皮肤功能，因此称为皮肤老化。皮肤老化受遗传程序以及在整个个体寿命中发生的累积的环境和内源损伤的影响。存在两个主要的诱导皮肤老化的过程；太阳保护皮肤中的内因性的(时间老化)及太阳暴露区域中的外因性的(光老化)。内因性老化反映遗传背景且取决于时间。无论如何，皮肤老化共有以下各项中的一项或多项：皱纹、细纹、色素沉着过度、失去光泽、光滑度、紧致度、肤色透明度及均匀度以及毛孔外观的改变。潜在的这些可见体征是由环境刺激(例如紫外(UV)及污染)的急性或慢性暴露以及遗传倾向诱导的各种组织学及细胞学变化。诸如起皱、干燥、变薄、下垂、较易受瘀伤及晒伤影响等化妆品问题是除老化外也可因于损伤剂(例如紫外线及污染)下的延长暴露而过早地发生的表皮损伤的常见外部体征。研究表明，皮肤老化最引人注意的形态改变是皮肤组织的逐渐损失。此皮肤组织损失可归因于若干因素，例如细胞的损失和细胞增殖减少。在如表皮等自我更新组织中，细胞数受增殖、终端分化与细胞凋亡之间的微妙平衡的紧密地调控(Robert L、Labat-Robert J和Robert AM. 2009)。因此，所公开的肽可用于与由内因性及外因性刺激物引起的皮肤老化相关的问题，以预防或逆转老化效应。以相关方式，所述肽可适用于已因暴露于各种外部物质(例如太阳光)而损伤的组织。本发明也可用作这些方面中的化妆品，以使皮肤具有更年轻外观及纹理且提供更佳功能。可使本身未经改变或经由化学修饰及/或专门递送的短肽渗透经过表皮以影响抗衡导致皮肤变薄、皱纹、脆弱及粗糙/硬化的那些的过程。由于角质形成细胞是表皮表面的主要组分且在老化及损伤皮肤中减少，故预期通过肽刺激对其的补充逆转上述的问题。

[0033] 皮肤相对有弹性，但其拉伸能力有限。妊娠纹或条纹是皮肤上具有颜色不佳的色调的结瘢的形式。它们是由真皮撕裂所引起，其随时间可减少，但不会完全消失。它们首次出现为微红色或紫色纹，但往往逐渐褪色至较浅范围。妊娠纹通常是与体重快速生长或快速损失相关的皮肤快速拉伸的结果。妊娠纹可在从未经受显著或过度拉伸或膨胀的身体位点上的任何位置出现。最常见位置为腹部、乳房、上臂、腋下、背部、大腿、髋及臀部。妊娠纹通常是由如青春期及怀孕等一些主要生命阶段的激素变化所引起，但皮质类固醇治疗、肥胖、美容手术及密集塑身可产生妊娠纹。在皮质类固醇作用下，与正常皮肤相比，角质形成细胞及成纤维细胞二者的生长可严重受损，且因此胶原I及III的合成以及纤连蛋白合成也显著减少高达90%以上(Rogalski等人，2002)。修复和恢复真皮/表皮部分中角质形成细胞的功能可是妊娠纹校正的关键。本发明的肽促进角质形成细胞增殖和迁移，且因此对于治疗妊娠纹是理想的。

[0034] 通常，医药上可接受的调配物将包含适用于人类皮肤上的任何载剂。所述医药上及化妆品上可接受的载剂包含乙醇、二甲基亚砜、甘油、二氧化硅、氧化铝、淀粉以及等效载剂和稀释剂。调配物可任选具有化妆品吸引力及/或含有诸如类视色素或可用作用于本发明肽的治疗作用的佐剂的其它肽的其它剂。也可将抗生素添加至调配物中以避免感染，由此允许发生最大愈合过程。组合物中肽的浓度可是约0.1 μg/mL至约500 μg/mL或约0.1 μg/mL至约20 mg/mL；然而，所采用的最终浓度可在这些范围外变化，此取决于伤口/组织病况的性质、本发明肽的生物活性及为获得增强的组合物吸收而使用的任何佐剂或技术。

[0035] 在本发明的优选实施方案中，其中欲使组合物与人类角质组织接触，除本发明肽之外的任何其它组分应适于施加至角质组织；即，所述其它组分在纳入组合物中时展示在合理医学判断范围内的过度毒性、不兼容性、不稳定性、过敏反应等等。CTFA Cosmetic Ingredient Handbook（CTFA化妆品成分手册），第二版(1992)描述皮肤护理产业中常用的多种非限制性化妆品及医药成份，其适用于本发明组合物中。这些成份类别的实例包含：磨料、吸收剂、美容组分(例如芳香剂)、颜料、着色剂/色素、精油、皮肤感受剂(skin sensate)、收敛剂等(例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁子香酚、乳酸甲酯、榛子馏出物)、抗痤疮剂、抗结块剂、消泡剂、抗微生物剂(例如丁基氨基甲酸碘丙基酯)、抗氧化剂、黏合剂、生物添加剂、缓冲剂、增量剂、螯合剂、化学添加剂、化妆品杀生物剂、变性剂、药物收敛剂、外用镇痛药、成膜剂或材料、遮光剂、pH调节剂、推进剂、还原剂、多价螯合剂、皮肤美白及亮肤剂(例如氢醌、曲酸、抗坏血酸、抗坏血酸基磷酸镁、抗坏血酸基葡糖胺)、皮肤调节剂(例如润湿剂)、柔肤剂及/或皮肤愈合剂(例如泛醇及其衍生物、库拉索芦荟、泛酸及其衍生物、尿囊素、没药醇及甘草酸二钾)、皮肤治疗剂、增稠剂和维生素及其衍生物。

[0036] 可将本发明肽和相关组合物给予人类和动物(包含所有哺乳动物)。也可与典型及/或实验材料(例如组织移植物、皮肤替代物、组织培养产品氧及敷料)组合施加。实例包含但不限于纱布(织造及非织造、浸渍、非黏附、封装、清创)；压缩绷带和系统；伤口填充剂及清洁剂；接触层；胶原；羊膜；非细胞人类真皮；非细胞基质和组合产品；及各种常用敷料。

[0037] 常用敷料的列表

[0038]

[0039] 通常，组合物可经局部、经口、经皮、全身性或通过本领域技术人员已知可用于将本发明肽递送至靶组织的任何其它方法给予。组合物也可以体外或离体方式施加至(例如)在培养物中生长的细胞或患者移植物。

[0040] 本发明的组合物可含有一种或多种发挥皮肤护理活性的其它试剂。除生物活性肽组分外，本发明可含有其它活性试剂，例如透明质酸、烟酰胺、植烷三醇、金合欢醇(farnesol)、没药醇、水杨酸、视黄醇、视黄酸、α羟酸、抗坏血酸及海藻酸（alguronic acid）。预期，某些另外的活性剂将与生物活性肽组分以协同方式起作用，或将增强调配物的存架寿命。

[0041] 此外，氨基酸的缩写遵循常规用法：

[0042]丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 ASN N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷酰胺 Gln Q
谷氨酸 Glu E
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V

[0043] 用于医药调配和给予的技术的细节可参见最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing公司，Easton Pa.)。尽管局部递送合意，但仍存在其它递送方式，例如：经口、非经肠、气溶胶、肌内、皮下、经皮、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内给予。可将本发明调配在多种载剂媒剂中，例如在喷雾剂；气溶胶；水-油型乳液；油和水型乳液；面霜或身体乳霜；防晒洗剂或晒后洗剂；或其它局部给予媒剂中。
此外，本发明的肽和含有它们的组合物可提供纳入一般皮肤护理和化妆品调配物(例如各种皮肤化妆品、皮肤乳霜、洗剂、防晒剂及治疗性洗剂或乳霜(例如抗痤疮调配物))中的有用特征。

[0044] 下列实施例被包含以展示本发明的某些优选实施方案。实施例

[0045] 实施例1：刺激细胞迁移及刮伤闭合的肽的鉴定

[0046] 使人类皮肤角质形成细胞(ATCC CRL-2404)在补充有5 ng/ml人类重组上皮生长因子(EGF)的不含血清的角质形成细胞生长培养基(Life Technologies公司，Grand Island, N.Y.)中生长。将细胞接种至12孔板上且使其达到100%铺满。将细胞单层饥饿24 hr，然后使用P200 (200 μl)吸管头制造刮伤。在0时洗涤刮伤且拍照。添加最终浓度为40 μg/ml的肽。将细胞保持在37℃，具有>90%湿度的5% CO2培育器中，在室温下经短时段捕获影像时除外。治疗7-8 hr后接着刮伤闭合，且结果显示于表1中。

[0047] 表1. 对所培养角质形成细胞的刮伤闭合。将治疗7 hr后，将经PBS治疗的伤口闭合视为100%，相对于PBS治疗计算经肽治疗的伤口闭合：

[0048]SEQ ID NO. HB编号 序列 治疗7 hr后的伤口闭合(%) 对角质形成细胞的细胞毒性(μg/ml)NA NA PBS 100 -
1 HB2265 EKMGRN 199* >500
4 HB2234 EKMG 191* >500
5 HB2235 MGRN 218* >500
2 HB2262 KMGRN 182* >500
3 HB2263 EKMGR 188* >500
6 HB2268 KMG 107 >500
7 HB2269 GRN 102 >500
8 HB2232 KIEK 100 >500
9 HB1062 GRNIRN 99 >500

[0049] *：显著。

[0050] 实施例2. 对正常人类皮肤角质形成细胞的细胞毒性

[0051] 为确保肽对细胞无细胞毒性，将正常人类表皮角质形成细胞接种至96孔板。在37℃下在5% CO2存在下培育板以使细胞生长至>95%铺满。将肽以50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml及500 μg/ml的浓度稀释至储备溶液中。用含有各种浓度肽的新鲜培养基更换细胞培养基，然后在37℃和5% CO2下培育24 hr。在治疗结束时，使用购自ATCC (Manassas VA)的MTT测定试剂盒测量细胞活力。结果显示于表1中。在50 μg/ml至500 μg/ml的浓度下，肽不改变如使用MTT分析测量的细胞活力。

[0052] 实施例3：刺激细胞增殖的肽的鉴定

[0053] 使正常人类皮肤角质形成细胞(ATCC CRL-2404)在补充有5 ng/ml人类重组上皮生长因子(EGF)的不含血清的角质形成细胞生长培养基(Life Technologies公司，Grand Island, N.Y.)中生长。每天用显微镜检查细胞。当培养物变成50%-75%铺满时，抽吸板中的培养基且添加0.25%胰蛋白酶/EDTA。当细胞变圆且分离时，通过添加新鲜培养基来中和胰蛋白酶。然后将细胞离心且将沉淀物重悬于新鲜培养基中。使用血球计对细胞悬浮液进行计数，且通过将100 μl细胞悬浮液添加至每一孔中将细胞总数调节至约500-1000个细胞/孔。通常，使用中心的60个孔，且用新鲜培养基填充外部孔以最小化蒸发。当培育6-8 hr后每一孔中的细胞贴附时，一式三份地添加100 μl含有PBS或2×期望浓度肽的新鲜培养基。然后在37℃和5% CO2下将微量板培育48-72 hr。

[0054] 在培育结束时，根据制造商的说明书使细胞经历CYTOSCAN™ SRB细胞毒性测定(GBiosciences公司，St. Louis, MO)。简言之，在磺基罗丹明B (suforhodamine B，SRB)染色之前固定细胞。大量洗涤后，使用溶解缓冲液溶解颜色。使用微量板读数器测量565 nm下的吸光值。表2中所显示的结果是一式三份治疗的平均值，且将大于120的值视为显著。

[0055] 表2. 本发明肽对正常人类表皮角质形成细胞增殖的调节.

[0056]

[0057] *：显著。

[0058] 实施例4. 基因分布型分析.

[0059] 使用由Sunny Biodiscovery公司(Santa Paula, CA)执行的PCR阵列来分析84个编码伤口愈合、细胞外基质及黏附分子的基因。简言之，EPIDERM™皮肤替代物是自MatTek (Ashland, MA)获得且根据制造商的说明书来处理。过夜平衡后，更换培养基且使用20G针制造10个全厚度穿刺伤口，并在一式两份皮肤组织的顶部施加HB2235 (330 μg/ml)或水对照且允许治疗24小时。也使用一组两种正常未受伤组织作为对照以观察受伤组织与正常组织之间的基因分布型。在治疗结束时，收集组织且保存在RNAlater溶液(Ambion, Austin, TX)中。提取RNA且用Illustra微型RNAspin试剂盒(GE Healthcare, Piscataway, NJ)纯化。使用Agilent HP-8452A二极管阵列分光光度计在260 nm及280 nm下评价经纯化的总RNA。均衡各样品的RNA浓度，且使用PCR阵列PAHS-121 A和来自Qiagen的第一链合成试剂盒、SYBR Green主混合物及PCR运行条件，用BioRad iCycler iQ检测系统通过实时定量PCR来测量所关注基因的表达。在用RT2分布型仪PCR阵列数据分析3.5版软件将基因表达正规化至所携载的5个管家基因后，使用效率ΔΔCt方法来定量结果。若表达水平相当高(检测小于30个循环)且在每一一式两份系列中调节为1.5或更高，则将基因视为差异表达。

[0060] 表3. 受伤皮肤组织与未受伤对照相比和经HB2235治疗的受伤组织相对于未经治疗的受伤组织的所选基因表达分布型，表示为倍数变化

[0061]

[0062]

[0063] 根据本公开内容无需过多实验即可制造并实施本文所公开和主张的所有组合物或方法。尽管已根据优选实施方案描绘本发明的组合物和方法，但本领域技术人员将明了，可在不背离本发明的概念、精神及范畴下改变所述组合物及/或方法及本文所阐述方法的步骤或步骤的顺序。更具体而言，应明了，可用某些在化学及生理上都相关的剂取代本文所描述的剂，同时可达成相同或相似结果。对本领域技术人员显而易见的所有所述类似取代及修改都被认为在本发明的范畴内。

[0064] 本申请案中所鉴定的所有专利及公开案都通过其全文引用并入本文中。

[0065] 参考文献

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