芍药叶片组织培养直接成芽的培养基及培养方法

摘要

本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种芍药叶片组织培养直接成芽的培养基及培养方法。该方法是在3月下旬选取幼嫩的芍药叶片；灭菌后接种于培养基上温度25±2℃，暗培养2个月，获得不定芽；所述培养基是改良MS基本培养基，添加TDZ 0.1～3.0mg·L‑1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L‑1，水解酪蛋白600mg·L‑1，琼脂6.4g·L‑1，pH为5.8。利用该方法可以使芍药叶片出芽率最高可达85％，有效地解决了问题，节约了人力、物力，缩短了芍药再生的时间，为芍药优良品种快繁提供技术支撑，市场前景广阔。

权利要求

1.一种芍药叶片组织培养直接成芽的培养基，其特征在于，所述培养基是：改良MS基本培养基，添加TDZ 0.1～3.0mg·L-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L-1，水解酪蛋白600mg·L-1，琼脂6.4g·L-1，pH为5.8；所述改良MS基本培养基配方如下：大量元素：硝酸钾KNO3 250mg/L，硝酸铵NH4NO3 500mg/L，磷酸二氢钾KH2PO4 550mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O 250mg/L，硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O 500mg/L；

微量元素：碘化钾KI 0.83mg/L，硼酸H3BO3 6.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O 22.3mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O 0.025mg/L，氯化钴CoCl2·6H2O 0.025mg/L；

铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3mg/L，硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8mg/L；

有机成分：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素VB1 0.1mg/L，盐酸吡哆醇VB6 

0.5mg/L，烟酸VB5 0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6.4g/L。

2.一种芍药叶片组织培养直接成芽的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：3月下旬选取幼嫩的芍药叶片；灭菌后接种于培养基上，温度25±2℃，暗培养2个月，获得不定芽；所述培养基是改良MS基本培养基，添加TDZ 0.1～3.0mg·L-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L-1，水解酪蛋白600mg·L-1，琼脂6.4g·L-1，pH为5.8；其中，所述改良MS基本培养基配方如下：大量元素：硝酸钾KNO3 250mg/L，硝酸铵NH4NO3 500mg/L，磷酸二氢钾KH2PO4 550mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O 250mg/L，硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O 500mg/L；

微量元素：碘化钾KI 0.83mg/L，硼酸H3BO3 6.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O 22.3mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O 0.025mg/L，氯化钴CoCl2·6H2O 0.025mg/L；

铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2·EDTA 37.3mg/L，硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8mg/L；

有机成分：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素VB1 0.1mg/L，盐酸吡哆醇VB6 

0.5mg/L，烟酸VB5 0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6.4g/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，叶片灭菌处理采用酒精与升汞相结合的灭菌方法，具体步骤如下：①先将幼嫩叶片在流水中冲洗10min，去除外部泥土，再用洗洁精清洗一下，流水冲洗干净；

②将幼嫩叶片置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75％酒精消毒30s，无菌水反复冲洗5～6次；

③再用0.1％升汞消毒3min，无菌水反复冲洗5～6次；

④外植体置于无菌滤纸上吸干水分，切去叶片的边缘部分和主脉，切成1cm×1cm的大小接种于培养基上，为避免交叉感染，每瓶接种3个叶片。

说明书

芍药叶片组织培养直接成芽的培养基及培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种芍药叶片组织培养直接成芽的培养基及培养方法。

背景技术

[0002] 芍药(Paeonia lactiflora Pall.)是我国的传统名花，位列“花相”，仅次于“花王”牡丹，在我国已有4000多年的栽培历史。芍药的花朵硕大，花色艳丽，花型美观，花香馥郁，深受广大人民群众的喜爱，而一些具有新奇性状的品种，市场前景尤为广阔。如普通的3～5年生芍药栽培品种售价一般为20～30元，而较为新奇的品种如‘黄金轮’售价约为普通品种的10倍，并需求量巨大。而如何快速、高效地将这些新奇品种进行扩繁，是摆在种植者面前迫切需要解决的难题。

[0003] 当前芍药最常用的繁殖方法是分株繁殖与播种繁殖，前者虽然能保持原品种的性状，但需要植株生长3～5年才能分一次，并且周期较长、繁殖系数较低，分株后的母株翌年观赏价值明显下降；后者既不能保持原品种的性状，又需要经过4～5的童期才能开花，因此，两者均不适宜进行大规模的商业化生产。植物组织培养是植物快速繁殖的一种最为有效的方法，与传统繁殖方法相比，组织培养既能保持原有品种和优良性状，扩大其繁殖系数，又不受季节的影响，可以周年运转，大幅度地提高了繁殖的效率。CN102428872B公开了一种通过种胚培养获得完整芍药植株的方法，但由于种胚并不能完全保持母本的性状，因此不能用于优良品种的扩繁。吴红娟等人发表的论文‘观赏芍药‘大富贵’丛生芽诱导及生根技术’(吴红娟,沈苗苗,于晓南.观赏芍药‘大富贵’丛生芽诱导及生根技术.东北林业大学学报,2011,39(9):20-22.)、‘芍药不同品种启动培养比较及‘朱砂判’丛生芽诱导的研究’(吴红娟,于晓南.芍药不同品种启动培养比较及‘朱砂判’丛生芽诱导的研究.内蒙古农业大学学报,2010,31(4):29-33.)报道了以地下休眠芽为外植体诱导丛生芽的方法，该方法对于优良品种的扩繁存在3点不足：①一个植株所包含的地下休眠芽数量有限，以其为外植体的繁殖效率不高；②每株组培苗只能产生3～5个丛生芽，繁殖系数不高；③整个过程必须经历一个地下芽启动培养的过程，耗费大量的人力、物力，提高成本。胡映泉等人发表的论文‘芍药不定芽的诱导技术’(胡映泉,冯海华,时宝凌.芍药不定芽的诱导技术,山西林业科技,2003,增刊:23-24,33.)对芍药嫩茎进行组织培养，在M S+BA 3.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L培养基上可一步成芽，缩短了成芽时间，但该论文数据较为含糊，统计的时间也未作交代，最终芽的诱导率最高只有74％。王吉凤等人发表的论文‘5个芍药品种愈伤组织诱导及分化研究’(王吉凤,李青,孟会.5个芍药品种愈伤组织诱导及分化研究.北京林业大学学报,2011,32(3):213-216.)中成功诱导出愈伤组织，并分化出不定芽，但其愈伤褐化严重、玻璃化、易碎，芽分化率低，仅有7.95％。孙晓梅等人发表的论文‘芍药愈伤组织诱导及不定芽分化的研究’(孙晓梅,程婉,刘萍,周文强,王丹,杨宏光.芍药愈伤组织诱导及不定芽分化的研究.沈阳农业大学学报,2014-02,45(1):24-27.)对芍药子叶、茎、叶片进行培养，以基部茎为最优的不定芽分化外植体，但分化率只有35％，且需经过愈伤诱导阶段。综上所述，在芍药组织培养过程中，前人均成功分化出不定芽，但是他们多以种胚、地下休眠芽、茎段等为外植体，不仅分化率低，而且继代次数多(分两步实施)，实验过程繁琐，周期较长，并不能获得理想的效果。

发明内容

[0004] 本发明为了解决芍药组培过程中的关键技术问题，提供了一种以芍药叶片为外植体一步成芽的培养基及培养方法，为芍药优良品种快繁提供技术支撑。

[0005] 本发明采用的芍药叶片组织培养直接成芽的培养基，其特征在于，改良MS基本培养基，添加TDZ 0.1～3.0mg·L-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L-1，水解酪蛋白600mg·L-1，琼脂6.4g·L-1，pH为5.8。

[0006] 本发明还公开了一种芍药叶片组织培养直接成芽的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：3月下旬选取幼嫩的芍药叶片；灭菌后接种于培养基上温度25±2℃，暗培养2个月，获得不定芽；所述培养基是改良MS基本培养基，添加TDZ 0.1～3.0mg·L-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L-1，水解酪蛋白600mg·L-1，琼脂6.4g·L-1，pH为5.8。

[0007] 所述叶片灭菌处理采用酒精与升汞相结合的灭菌方法采用酒精与升汞相结合的灭菌方法，具体步骤如下：

[0008] ①先将幼嫩叶片在流水中冲洗10min，去除外部泥土，再用洗洁精清洗一下，流水冲洗干净；

[0009] ②将幼嫩叶片置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75％酒精消毒30s，无菌水反复冲洗5～6次；

[0010] ③再用0.1％升汞消毒3min，无菌水反复冲洗5～6次；

[0011] ④外植体置于无菌滤纸上吸干水分，切去叶片的边缘部分和主脉，切成1cm×1cm的大小接种于诱导培养基上，为避免交叉感染，每瓶接种3个叶片。

[0012] 本发明的有益效果体现在：

[0013] (1)本发明中芍药叶片出芽率最高可达85％，克服了芍药叶片经过愈伤组织分化不定芽困难的技术障碍。

[0014] (2)本发明中芍药叶片组织培养不经过愈伤组织阶段直接一步成芽，避免了因多次继代而耗费人力、物力的问题，缩短了芍药再生的时间，同时减少了转接过程中的污染危害。

[0015] (3)本发明中每张接种的叶片可以形成3-8个不定芽，提高了繁殖系数。

附图说明

[0016] 图1是接种于培养基上的芍药叶片。

[0017] 图2是不定芽形成过程。

具体实施方式

[0018] 实施例1

[0019] 以栽植于扬州大学园艺与植物保护学院芍药种质资源圃中的芍药托桂型品种‘紫凤羽’为试材来开展本研究工作：

[0020] (1)取材时间：2014年3月28日；

[0021] (2)选材：选取幼嫩的叶片；

[0022] (3)叶片的灭菌及接种：

[0023] 嫩叶采回来后，采用酒精与升汞相结合的灭菌方法，具体步骤如下：

[0024] ①先将幼嫩叶片在流水中冲洗10min，去除外部泥土，再用洗洁精(上海和黄白猫有限公司)清洗一下，流水冲洗干净；

[0025] ②将幼嫩叶片置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75％酒精消毒30s，无菌水反复冲洗5～6次；

[0026] ③再用0.1％升汞(上海中西化工厂)消毒3min，无菌水反复冲洗5～6次；

[0027] ④外植体置于无菌滤纸上吸干水分，切去叶片的边缘部分和主脉，切成1cm×1cm的大小接种于诱导培养基上，为避免交叉感染，每瓶接种3个叶片，共接种200瓶。

[0028] (4)培养基配方及培养方法：

[0029] ①培养基配方：改良MS基本培养基，添加TDZ 1.0mg·L-1+椰汁5％，附加蔗糖30g·L-1，水解络蛋白600mg·L-1，琼脂6.4g·L-1，pH为5.8。TDZ购于北京索莱宝科技有限公司、蔗糖购于上海实验试剂有限公司、水解酪蛋白购于生工生物工程(上海)股份有限公司、琼脂购于北京索莱宝科技有限公司、椰汁购于上海嘉果食品有限公司。

[0030] 本发明中改良MS基本培养基配方为：

[0031] 大量元素

[0032] 硝酸钾     KNO3 250mg/L

[0033] 硝酸铵     NH4NO3 500mg/L

[0034] 磷酸二氢钾  KH2PO4 550mg/L

[0035] 硫酸镁     MgSO4·7H2O 250mg/L

[0036] 硝酸钙     Ca(NO3)2·4H2O 500mg/L

[0037] 微量元素

[0038] 碘化钾     KI 0.83mg/L

[0039] 硼酸      H3BO3 6.2mg/L

[0040] 硫酸锰     MnSO4·4H2O 22.3mg/L

[0041] 硫酸锌     ZnSO4·7H2O 8.6mg/L

[0042] 钼酸钠     Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L

[0043] 硫酸铜   CuSO4·5H2O 0.025mg/L

[0044] 氯化钴   CoCl2·6H2O 0.025mg/L

[0045] 铁盐

[0046] 乙二胺四乙酸二钠  Na2·EDTA 37.3mg/L

[0047] 硫酸亚铁   FeSO4·7H2O 27.8mg/L

[0048] 有机成分

[0049] 肌醇    100mg/L

[0050] 甘氨酸     2mg/L

[0051] 盐酸硫胺素  VB10.1mg/L

[0052] 盐酸吡哆醇  VB60.5mg/L

[0053] 烟酸      VB50.5mg/L

[0054] 蔗糖      30g/L

[0055] 琼脂      6.4g/L。

[0056] ②培养条件：温度25±2℃，暗培养2个月。

[0057] (5)统计指标及方法：外植体在组培室培养60d后开始统计长芽和褐化情况。

[0058] 出芽率＝出芽的组织数/接种叶片总数×100％；

[0059] 褐化率＝褐化的组织数/接种叶片总数×100％。

[0060] (6)结果：将如图1所示1cm×1cm大小的叶片接种于芽分化培养基中进行暗培养，1.5～2个月可以观察到如图2所示形成的不定芽初，叶片出芽率可达84.60％，每张叶片可形成3-8个不定芽，褐化率仅为1.93％。