一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法

摘要

本发明提供了一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法，包括：细胞培养基0.7～0.9ml/ml；非必需氨基酸8～26mg/ml；海藻糖0.04～0.1ml/ml；维生素C0.5～10mg/ml；人血白蛋白10～50mg/ml；丙二醇0.04～0.12ml/ml；二甲基亚砜0.01～0.07ml/ml；香菇多糖0.5～3mg/ml。与现有技术相比，本发明冻存液中人血白蛋白可以替代胎牛血清在冻存中发挥的作用同时添加了非必需氨基酸、维生素C和香菇多糖以保证复苏后细胞增殖活力不受影响，而海藻糖和丙二醇可替代二甲基亚砜的保护作用，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶，上述成分相互作用可实现免疫细胞的冻存。

权利要求

1.一种细胞冻存液，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞培养基为DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，包括：

4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，包括

5.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，包括：

6.权利要求1～5任意一项所述的细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。

7.一种免疫细胞的冻存方法，其特征在于，用权利要求1～5任意一项所述的细胞冻存液冻存免疫细胞。

8.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，所述免疫细胞与细胞冻存液的比例为

1×106～5×107cell/ml。

9.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：A)免疫细胞培养；

B)将所述免疫细胞用缓冲液清洗，除去缓冲液后，与权利要求1～5任意一项所述的细胞冻存液混合，分装，冻存。

10.根据权利要求9所述的冻存方法，其特征在于，所述步骤A)具体为：A1)将生理盐水、Ficoll分离液与外周血或脐血混合，离心，吸取中间白膜层；

A2)将所述白膜层接种至含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，添加1000UI/ml的γ干扰素，24h后添加300UI/ml的白介素2与300UI/ml的CD3单抗，培养12～14天，得到免疫细胞。

说明书

一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法

技术领域

[0001] 本发明属于细胞工程技术领域，尤其涉及一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法。

背景技术

[0002] 免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

[0003] 随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者放疗、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。

[0004] 但免疫细胞的体外培养效果很大程度上取决于病人体内的免疫细胞的多少以及质量，但肿瘤病人体内的免疫细胞很来就较正常人要少，再加上放疗、化疗后免疫细胞的数量就更为稀少了，因此采集肿瘤病人体内的免疫细胞往往需要在化料之前进行，于是就产生了病人放化疗的时间和免疫细胞回输时间的冲突。

[0005] 如果能够提前将免疫细胞培养好并冻存起来，待到需要时立刻复苏并回输，则可解决时间冲突的问题，并且随时可以使用，对于医生选择治疗方案相当有利。

[0006] 细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险、为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤降至最低，必需进一步优化化学和温度操作过程，但需要在冻存前加入一种或一种以上的冻存保护剂，在溶解后又将其去除。目前最常用的冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)，这种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。由于高浓度DMSO对细胞由毒性，还必须添加其他的液体成分，如血清、细胞培养基，以降低DMSO的浓度，减少对细胞的伤害。

[0007] 现有细胞冻存液的配当多采用DMSO联合动物血清，大部分为10％的DMSO与90％的胎牛血清，但由于DMSO含量仍较高，具有相当的毒性，对病人身体不利，并且胎牛血清中含有大量的异种蛋白，既有传染病的危险，又很容易引起过敏反应或者免疫排斥，因此不能直接用于临床回输。

发明内容

[0008] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法，该细胞冻存液不含胎牛血清。

[0009] 本发明提供了一种细胞冻存液，包括：

[0010]

[0011] 优选的，所述细胞培养基为DMEM/F12培养基。

[0012] 优选的，包括：

[0013]

[0014] 优选的，包括

[0015]

[0016]

[0017] 优选的，包括：

[0018]

[0019] 本发明还提供了一种细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。

[0020] 本发明还提供了一种免疫细胞的冻存方法，用细胞冻存液冻存免疫细胞。

[0021] 优选的，所述免疫细胞与细胞冻存液的比例为1×106～5×107cell/ml。

[0022] 优选的，包括以下步骤：

[0023] A)免疫细胞培养；

[0024] B)将所述免疫细胞用缓冲液清洗，除去缓冲液后，与权利要求1～5任意一项所述的细胞冻存液混合，分装，冻存。

[0025] 优选的，所述步骤A)具体为：

[0026] A1)将生理盐水、Ficoll分离液与外周血或脐血混合，离心，吸取中间白膜层；

[0027] A2)将所述白膜层接种至含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，添加1000UI/ml的γ干扰素，24h后添加300UI/ml的白介素2与300UI/ml的CD3单抗，培养12～14天，得到免疫细胞。

[0028] 本发明提供了一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法，该细胞冻存液包括：细胞培养基0.7～0.9ml/ml；非必需氨基酸8～26mg/ml；海藻糖0.04～0.1ml/ml；维生素C0.5～10mg/ml；人血白蛋白10～50mg/ml；丙二醇0.04～0.12ml/ml；二甲基亚砜0.01～0.07ml/ml；香菇多糖0.5～3mg/ml。与现有技术相比，本发明冻存液中细胞培养基可保持渗透压、酸碱平衡和提供营养，人血白蛋白在一定程度上可以替代胎牛血清在冻存中发挥的作用同时添加了非必需氨基酸、维生素C和香菇多糖以保证复苏后细胞增殖活力不受影响，而海藻糖和丙二醇可替代二甲基亚砜的保护作用，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶，上述成分相互作用，从而使本发明在不含胎牛血清及DMSO含量低的情况下仍可实现免疫细胞的冻存。

[0029] 实验表明，采用本发明细胞冻存液冻存细胞复苏后的活性可达98.6％。

具体实施方式

[0030] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0031] 本发明提供了一种细胞冻存液，包括：

[0032]

[0033] 其中，所述细胞培养基的含量优选为0.75～0.9ml/ml，更优选为0.8～0.9ml/ml，再优选为0.85～0.9ml/ml；所述细胞培养基的种类为本领域技术人员熟知的细胞培养基即可，并无特殊的限制，本发明中优选为DMEM/F12培养基。细胞培养基具有保持细胞渗透压、酸碱平衡体系和提供营养等作用。

[0034] 所述非必需氨基酸的含量优选为10～20mg/ml，更优选为12～18mg/ml，再优选为14～16mg/ml；所述非必需氨基酸为本领域技术人员熟知的非必需氨基酸即可，并无特殊的限制，本发明优选为多种非必需氨基酸组合而成，更优选为购买自GIBCO试剂的非必需氨基酸。

[0035] 所述海藻糖的含量优选为0.05～0.08ml/ml；所述海藻糖的种类为本领域技术人员熟知的海藻糖即可，并无特殊的限制，本发明中优选为注射用海藻糖。

[0036] 所述维生素C的含量优选为1～8mg/ml，更优选为1～5mg/ml，再优选为1～3mg/ml。

[0037] 所述人血白蛋白的含量优选为15～40mg/ml，更优选为15～30mg/ml，再优选为20～30mg/ml。

[0038] 所述丙二醇的含量优选为0.06～0.1ml/ml；所述丙二醇的种类为本领域技术人员熟知的丙二醇即可，并无特殊的限制，本发明中优选为注射用丙二醇。

[0039] 所述二甲基亚砜的含量优选为0.02～0.05ml/ml，更优选为0.02～0.03ml/ml。

[0040] 所述香菇多糖的含量优选为1～2mg/ml。

[0041] 在本发明提供的一些实施例中，所述细胞冻存液由以下成分组成：细胞培养基0.86ml/ml；非必需氨基酸15mg/ml；海藻糖0.06ml/ml；维生素C1mg/ml；人血白蛋白25mg/ml；丙二醇0.06 ml/ml；二甲基亚砜0.02ml/ml；香菇多糖1mg/ml。

[0042] 在本发明提供的一些实施例中，所述细胞冻存液由以下成分组成：细胞培养基0.75ml/ml；非必需氨基酸8mg/ml；海藻糖0.04ml/ml；维生素C0.5mg/ml；人血白蛋白10mg/ml；丙二醇0.04ml/ml；二甲基亚砜0.01ml/ml；香菇多糖0.5mg/ml。

[0043] 在本发明提供的另外一些实施例中，所述细胞冻存液由以下成分组成：细胞培养基0.9ml/ml；非必需氨基酸26mg/ml；海藻糖0.1ml/ml；维生素C10mg/ml；人血白蛋白50mg/ml；丙二醇0.12ml/ml；二甲基亚砜0.07ml/ml；香菇多糖3mg/ml。

[0044] 本发明冻存液中细胞培养基可保持渗透压、酸碱平衡和提供营养，人血白蛋白在一定程度上可以替代胎牛血清在冻存中发挥的作用同时添加了非必需氨基酸、维生素C和香菇多糖以保证复苏后细胞增殖活力不受影响，而海藻糖和丙二醇可替代二甲基亚砜的保护作用，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶，上述成分相互作用，从而使本发明在不含胎牛血清及DMSO含量低的情况下仍可实现免疫细胞的冻存。

[0045] 本发明细胞冻存液既减少了DMSO的含量，同时又含有胎牛血清，从而保证了安全性，可直接进行临床回输。

[0046] 本发明还提供了一种上述细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用，所述细胞冻存液同上所述，在此不再赘述。

[0047] 本发明还提供了一种免疫细胞的冻存方法，用上述细胞冻存液冻存免疫细胞，所述细胞冻存液同上所述，在此不再赘述。

[0048] 按照本发明所述冻存方法优选包括以下步骤：A)免疫细胞培养；B)将所述免疫细胞用磷酸缓冲液清洗，除去缓冲液后，与细胞冻存液混合，分装，冻存。

[0049] 其中，所述免疫细胞培养具体按照以下方法进行：A1)将生理盐水、Ficoll与外周血或脐血混合，离心，吸取中间白膜层；A2)将所述白膜层接种至含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，添加1000UI/ml的γ干扰素，24h后添加300UI/ml的白介素2与300UI/ml的CD3单抗，培养12～14天，得到免疫细胞。

[0050] 将生理盐水、Ficoll分离液与外周血或脐血混合，所述生理盐水与外周血或脐血的体积比优选为1:1；所述所述生理盐水与外周血或脐血的体积和与Ficoll分离液的体积比优选为3:1。混合后，离心，吸取中间白膜层。

[0051] 将所述白膜层接种至含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，所述接种密度优选为1×106～1×107cell/ml，添加1000UI/ml的γ干扰素，24h后添加300UI/ml的白介素2与300UI/ml的CD3单抗，培养12～14天，优选每3天补液至密度为0.5×106～1.5×106cell/ml，并根据补液体积添加300UI/ml的白介素2，得到免疫细胞。

[0052] 将免疫细胞从培养瓶中倒出，优选离心后，用缓冲液清洗，然后除去缓冲液，再与细胞冻存液混合，分装，冻存。其中所述缓冲液优选为磷酸缓冲液(PBS)；所述免疫细胞与细胞冻存液的比例优选为1×106～5×107cell/ml。

[0053] 为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种细胞冻存液、应用及免疫细胞冻存方法进行详细描述。

[0054] 以下实施例中所用的试剂均为市售，所述非必需氨基酸购买自GIBCO。

[0055] 实施例1

[0056] 1.1取20ml外周血或脐血，添加等体积的生理盐水稀释，添加稀释液三分之一体积的Ficoll分离液，700g离心20～30min，升降速降为零，吸取中间白膜层。

[0057] 1.2将1.1中得到的白膜层用生理盐水清洗两遍，根据计数结果，接种密度1×106cell/ml，接种至含有10％FBS的RPMI1640培养基中，添加1000UI/ml的γ干扰素，24h后
5
添加300UI/ml的白介素2和300UI/ml的CD3单抗；第4天补液，补液密度5～10×10cell/ml，并根据补液体积添加300UI/ml的白介素2；后续每3天补液一次，补液后密度维持在1～1.5×106cell/ml，并根据补液体积添加对300UI/ml的白介素2；培养12～14天得到CIK细胞。

[0058] 1.3将1.2中得到的CIK细胞从培养瓶中倒出，400g离心5min，弃去上清后用PBS洗2遍，弃去PBS后，加入细胞冻存液(细胞冻存液的配方见表1)重悬细胞，细胞密度为3×107cell/ml；取一部分细胞悬液进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将余下的细胞悬液加入冻存管中，每管1ml分为10天、30天、60天三组，每组
3管细胞，总共9管细胞；将冻存管放入-80℃冰箱中冻存，24h后转移至液氮中保存。

[0059] 1.4免疫细胞复苏：将分别在液氮中保存10天、30天、60天的免疫细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，解冻时间控制在2min内；将解冻后的CIK细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，结果见表4与表5。

[0060] 表1实施例1中细胞冻存液的配方

[0061]

[0062]

[0063] 实施例2

[0064] 2.1将实施例1中得到的CIK细胞从培养瓶中倒出，400g离心5min，弃去上清后用PBS洗2遍，弃去PBS后，加入细胞冻存液(细胞冻存液的配方见表2)重悬细胞，细胞密度为3×107cell/ml；取一部分细胞悬液进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将余下的细胞悬液加入冻存管中，每管1ml分为10天、30天、60天三组，每组3管细胞，总共9管细胞；将冻存管放入-80℃冰箱中冻存，24h后转移至液氮中保存。

[0065] 2.2免疫细胞复苏：将分别在液氮中保存10天、30天、60天的免疫细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，解冻时间控制在2min内；将解冻后的CIK细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，结果见表表4与表5。

[0066] 表2实施例2中细胞冻存液的配方

[0067]

[0068] 实施例3

[0069] 3.1将实施例1中得到的CIK细胞从培养瓶中倒出，400g离心5min，弃去上清后用PBS洗2遍，弃去PBS后，加入细胞冻存液(细胞冻存液的配方见表3)重悬细胞，细胞密度为3×107cell/ml；取一部分细胞悬液进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将余下的细胞悬液加入冻存管中，每管1ml分为10天、30天、60天三组，每组3管细胞，总共9管细胞；将冻存管放入-80℃冰箱中冻存，24h后转移至液氮中保存。

[0070] 3.2免疫细胞复苏：将分别在液氮中保存10天、30天、60天的免疫细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，解冻时间控制在2min内；将解冻后的CIK细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，结果见表表4与表5。

[0071] 表3实施例3中细胞冻存液的配方

[0072]

[0073] 比较例1

[0074] 1.1将实施例1中得到的CIK细胞从培养瓶中倒出，400g离心5min，弃去上清后用PBS洗2遍，弃去PBS后，加入细胞冻存液(细胞冻存液的配方为体积分数10％DMSO+90％的胎牛血清)重悬细胞，细胞密度为3×107cell/ml；取一部分细胞悬液进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将余下的细胞悬液加入冻存管中，每管1ml分为10天、30天、60天三组，每组3管细胞，总共9管细胞；将冻存管放入-80℃冰箱中冻存，24h后转移至液氮中保存。

[0075] 1.2免疫细胞复苏：将分别在液氮中保存10天、30天、60天的免疫细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，解冻时间控制在2min内；将解冻后的CIK细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，结果见表表4与表5。

[0076] 表4细胞活性计算结果

[0077]

[0078] 表5细胞表面标记物表达率检测结果

[0079]