本发明公开了一种制备硫代异鼠李糖甘油二酯的方法，将干燥的藻粉在常压和室温的情况下用提取液I进行溶解搅拌4～5h，利用离心机分离收集有机相I，添加到提取液II中，再利用离心机分离收集有机相II，经低压色谱柱进行纯化，通过减压浓缩至恒重，得到总甘油酯；分别用Q Sepharose柱层析分离与洗脱峰进行薄层层析检测，收集洗脱液减压浓缩至恒重，得到SQDG粗品；用疏水柱层析分离与洗脱峰进行薄层层析检测，将SQDG的洗脱液减压浓缩至恒重，得到SQDG纯品用水溶解，通过超滤后经冷冻干燥制得SQDG干粉。本发明制备SQDG工艺流程简单，操作安全，选择的提取液利于提高SQDG得率；采用柱层析和疏水柱组合分离总甘油脂，可直接得到较纯的SQDG，而且避免了其他甘油酯类对SQDG的污染。
1.一种制备硫代异鼠李糖甘油二酯的方法，其特征在于：具体包括有制备总甘油酯阶段、SQDG的Q Sepharose柱层析分离阶段、SQDG的纯化阶段和SQDG干粉制备阶段，各个阶段具体步骤如下：(1)制备总甘油酯阶段
将干燥的藻粉在常压和室温的情况下用提取液I进行溶解，藻粉的质量与提取液1的体积数值之比为1：3～6，所述提取液I为含有氯仿、甲醇和氯化钾水溶液的混合液，其中氯仿：甲醇：氯化钾水溶液的体积数值之比为3～5：1～3：1，将藻粉和提取液I的溶液搅拌4～5h，利用离心机分离收集有机相I，将有机相I添加到提取液II中，有机相I与提取液II的体积数值之比为1：2～4，所述提取液II为含有氯仿和氯化钾水溶液的混合液，其中氯仿与氯化钾水溶液的体积数值之比为
1～2:1，再利用离心机分离收集有机相II，将有机相II用低压色谱柱进行纯化，收集得到极性总甘油酯，通过减压浓缩至恒重，去除极性总甘油酯中的有机溶剂；
(2)SQDG的Q Sepharose柱层析分离阶段
将步骤(1)中制备的总甘油酯分别用Q Sepharose柱层析分离与洗脱峰进行薄层层析检测，收集含有SQDG的洗脱液，将洗脱液减压浓缩至恒重，得到SQDG粗品；
将步骤(2)中所获得的SQDG粗品分别用疏水柱层析分离与洗脱峰进行薄层层析检测，收集含有SQDG的洗脱液，将SQDG的洗脱液减压浓缩至恒重，得到SQDG纯品；
将步骤(3)中制备的SQDG纯品用水溶解，通过20kD～50kD万截留分子量的超滤膜超滤，把超滤后的滤液经冷冻干燥制得SQDG干粉。
2.根据权利要求1所述的一种制备硫代异鼠李糖甘油二酯的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的低压色谱柱层析的具体条件如下：将硅胶用体积比值为2：2～5的四氯化碳与二氧六环匀浆混匀后装入柱内，然后依次用洗脱液A、洗脱液B、洗脱液C进行淋洗，直至基线恒定；其中所述的洗脱液A是体积比值为50：5：1～40：5：1的氯仿、甲醇及甲酸的混合溶液，洗脱液B是体积比值为30：5：1～20：5：1的氯仿、甲醇及甲酸的混合溶液，洗脱液C是体积比值为30：6：1～25：4：1的氯仿、甲醇及甲酸的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的一种制备硫代异鼠李糖甘油二酯的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的Q Sepharose柱层析分离的具体步骤如下：
22)将柱床体积4～5倍的总甘油酯溶液按照400～450ml/h流速上样，并用柱床体积5～
10倍的洗脱液D以800～1000ml/h流速进行淋洗；
23)再分别用柱床体积5～10倍的洗脱液D和洗脱液E进行梯度洗脱；
其中，所述洗脱液D是体积比值为4～5：6～8：1的氯仿、甲醇及水的混合溶液，洗脱液E是体积比值为4～5：6～8：1的氯仿、甲醇及0.4M乙酸钠-乙酸的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的一种制备硫代异鼠李糖甘油二酯的方法，其特征在于：步骤
21)中所述Q Sepharose柱进行处理的步骤为：将装填Q Sepharose的空柱用柱床体积10～
20倍的0.4M乙酸钠-乙酸溶液淋洗并浸泡过夜，然后用柱床体积10～20倍洗脱液E淋洗，再用柱床体积5～10倍的洗脱液D淋洗，直至基线恒定。
5.根据权利要求1所述的一种制备硫代异鼠李糖甘油二酯的方法，其特征在于：步骤(3)中所述SQDG的纯化步骤是：将SQDG溶液上样至疏水柱，SQDG溶液与柱体积数值比为1：1～3，其中SQDG溶液的溶剂为1M乙酸钠-乙酸缓冲液，然后分别用柱床体积5～10倍的1M乙酸钠-甲醇溶液和0.005M乙酸钠-甲醇溶液进行梯度洗脱。
一种制备硫代异鼠李糖甘油二酯的方法
技术领域
[0001] 本发明属于功能性油脂制备领域，特别涉及一种制备硫代异鼠李糖甘油二酯的方法。
背景技术
[0002] 硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)是一种含硫的糖酯，具有抗病毒和抗肿瘤功能，其能抑制人类免疫缺陷病毒反转录酶HIV-RT活性，并且这些抑制效应是依赖剂量的。Gustafson等从人工培养的蓝绿藻L.lagerheimii和P.tenue细胞提取物中分离出含磺酸基的甘油糖脂，能抑制HIV的复制，可以作为一种新型的抗HIV药物的先导化合物。从五种蓝藻中分离的11种，能不同程度的抑制HIV-1逆转酶活性，其中四种能有效抑制HIV-1和HIV-2逆转录酶活性，当浓度为10μmol/L时，几乎100％抑制逆转录酶的DNA聚合酶活性，但对RNA酶抑制活性很低；脂肪酸侧链对其抗病毒能力起决定性作用，水解侧链脂肪酸将使SQDG失去大部分抑制HIV-RT活性的能力。海藻硫酸甘油糖脂化合物的体外抗肿瘤活性研究表明，SQDG对正常细胞Vero和MC的毒性很小，其IC50值大于500μg/mL，对人乳腺癌细胞MCF-27的生长抑制效果最明显，能选择性地有效抑制体外培养的乳腺癌细胞的生长；在质量浓度为
125μg/mL时能完全抑制MCF-7细胞生长。流式细胞术检测发现，SQDG能扰乱MCF-7的细胞周期，促使细胞凋亡或坏死，从而产生有效的生长抑制效果，是一种有发展潜力的抗肿瘤药物。
[0003] 天然的SQDG一般是从高等植物、藓类植物、蕨类植物或藻类植物以及大多数光合细菌中提取，其在藻类中的含量最多，可高达总脂含量的70％。而SQDG的提取方法的技术步骤为：采用Bligh-Dyer法制备总酯，通过硅胶柱层析法，从总酯中分离提取出SQDG，再利用高压液相色谱分离纯化SQDG。这类方法存在的不足之处是：1，采用高压液相色谱纯化分离制备，工艺繁琐，不利于规模化制备；2，采用Bligh-Dyer法制备的总酯率低，总酯中混入大量的其他甘油酯，降低了SQDG丰度，不利于SQDG的下游纯化。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于突破现有SQDG制备技术中的不足，提供一种简单且易于生产的硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)的制备方法，同时增加了SQDG在样品中的丰度。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明通过以下方式来实现：
[0006] 一种制备硫代异鼠李糖甘油二酯的方法，具体包括有制备总甘油酯阶段、SQDG的Q Sepharose柱层析分离阶段、SQDG的纯化阶段和SQDG干粉制备阶段，各个阶段具体步骤如下：
[0007] (1)制备总甘油酯阶段
[0008] 将干燥的藻粉(藻粉以克或千克计量)在常压和室温的情况下用提取液(提取液以毫升或升计量)I进行溶解，藻粉的质量与提取液1的体积数值之比为1：3～6，所述提取液1为含有氯仿、甲醇和氯化钾水溶液的混合液，其中氯仿：甲醇：氯化钾水溶液的体积数值之比为3～5：1～3：1，将藻粉和提取液I的溶液搅拌4～5h，利用离心机分离收集有机相I，[0009] 将有机相I添加到提取液II中，有机相I与提取液II的体积数值之比为1：2～4，所述提取液II为含有氯仿和氯化钾水溶液的混合液，其中氯仿与氯化钾水溶液的体积数值之比为1～2:1，再利用离心机分离收集有机相II，将有机相II用低压色谱柱进行纯化，收集得到极性总甘油酯，通过减压浓缩至恒重，去除极性总甘油酯中的有机溶剂；
[0010] (2)SQDG的Q Sepharose柱层析分离阶段
[0011] 将步骤(1)中制备的总甘油酯分别用Q Sepharose柱层析分离与洗脱峰进行薄层层析(TLC)检测，收集含有SQDG的洗脱液，将洗脱液减压浓缩至恒重，得到SQDG粗品；
[0012] (3)SQDG的纯化阶段
[0013] 将步骤(2)中所获得的SQDG粗品分别用疏水柱层析分离与洗脱峰进行薄层层析检测，收集含有SQDG的洗脱液，将SQDG的洗脱液减压浓缩至恒重，得到SQDG纯品；
[0014] (4)SQDG干粉制备阶段
[0015] 将步骤(3)中制备的SQDG纯品用水溶解，通过20kD～50kD万截留分子量的超滤膜超滤，把超滤后的滤液经冷冻干燥制得SQDG干粉。
[0016] 步骤(1)中所述的低压色谱柱层析的具体条件如下：将硅胶用体积比值为2：2～5的四氯化碳与二氧六环匀浆混匀后装入柱内，然后依次用洗脱液A、洗脱液B、洗脱液C进行淋洗，直至基线恒定；其中所述的洗脱液A是体积比值为50：5：1～40：5：1的氯仿、甲醇及甲酸的混合溶液，洗脱液B是体积比值为30：5：1～20：5：1的氯仿、甲醇及甲酸的混合溶液，洗脱液C是体积比值为30：6：1～25：4：1的氯仿、甲醇及甲酸的混合溶液。
[0017] 步骤(2)中所述的Q Sepharose柱层析分离的具体步骤如下：
[0018] 21)对Q Sepharose柱进行处理；
[0019] 22)将柱床体积4～5倍的总甘油酯溶液按照400～450ml/h流速上样，并用柱床体积5～10倍的洗脱液D以800～1000ml/h流速进行淋洗；
[0020] 23)再分别用柱床体积5～10倍的洗脱液D和洗脱液E进行梯度洗脱；
[0021] 其中，所述洗脱液D是体积比值为4～5：6～8：1的氯仿、甲醇及水的混合溶液，洗脱液E是体积比值为4～5：6～8：1的氯仿、甲醇及0.4M乙酸钠-乙酸的混合溶液。
[0022] 进一步优选的，步骤21)中所述Q Sepharose柱进行处理的步骤为：将装填Q Sepharose的空柱用柱床体积10～20倍的0.4M乙酸钠-乙酸溶液淋洗并浸泡过夜，然后用柱床体积10～20倍洗脱液E淋洗，再用柱床体积5～10倍的洗脱液D淋洗，直至基线恒定。
[0023] 步骤(3)中所述SQDG的纯化步骤是：将SQDG溶液上样至疏水柱，SQDG溶液与柱体积数值比为1：1～3，其中SQDG溶液的溶剂为1M乙酸钠-乙酸缓冲液，然后分别用柱体积5～10倍的1M乙酸钠-甲醇溶液和0.005M乙酸钠-甲醇溶液进行梯度洗脱。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
[0025] 1、制备SQDG步骤不仅工艺流程简单，操作安全，易于放大，而且所选择的提取液配方有利于提高SQDG的得率；
[0026] 2、采用Q Sepharose柱层析和疏水柱组合分离总甘油脂，可直接得到较纯的SQDG，而且避免了MGDG、DGDG等甘油脂类对SQDG的污染。
具体实施方式
[0027] 下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0028] 实施例1
[0029] 将干燥的藻粉在常压、室温下用提取液I溶解，藻粉以克或公斤计量，提取液以毫升或升计量，藻粉的质量与提取液I的体积数值之比为1：3，所述提取液I为氯仿、甲醇和氯化钾水溶液的混合液，氯仿体积：甲醇体积：氯化钾水溶液＝1：1：1，将藻粉溶液搅拌4h～5h，然后离心分离并收集有机相I，将上述制备的有机相I加入提取液II，有机相I：提取液II的体积＝1：2，所述提取液II为氯仿和氯化钾水溶液的混合液，氯仿体积：氯化钾水溶液＝
1：1，然后离心分离并收集有机相II，将有机相II用低压色谱柱进行纯化，收集得到极性总甘油酯，通过减压浓缩至恒重，去除极性总甘油酯中的有机溶剂。
[0030] 低压色谱柱层析条件如下：将硅胶用四氯化碳-二氧六环按(四氯化碳体积：二氧六环体积＝2：5～1：1)匀浆混匀后装入柱内(1×30～50cm)，然后依次用洗脱液A、洗脱液B、洗脱液C淋洗，直至基线恒定；其中洗脱液A为氯仿体积：甲醇体积：甲酸体积＝50：5：1的氯仿-甲醇-甲酸溶液，洗脱液B为氯仿体积：甲醇体积：甲酸体积＝20：5：1的氯仿-甲醇-甲酸溶液，洗脱液C为氯仿体积：甲醇体积：甲酸体积＝25：4：1的氯仿-甲醇-甲酸溶液。
[0031] 将制备的总甘油酯用Q Sepharose柱层析分离，首先对Q Sepharose柱进行处理，Q Sepharose柱体积为50ml，然后将4倍柱床体积的总甘油脂溶液以400ml/h流速上样，用5倍柱床体积的洗脱液D以800ml/h流速进行淋洗，分别以5倍柱床体积的洗脱液D和洗脱液E进行梯度洗脱。
[0032] Q Sepharose柱处理为：将空柱装填Q Sepharose，以10倍柱床体积的0.4M乙酸钠-乙酸溶液淋洗并浸泡过夜，然后用10倍柱床体积的洗脱液E淋洗，再用5倍柱床体积的洗脱液D淋洗，直至基线恒定；所述洗脱液D的配方为氯仿体积：甲醇体积：水体积＝4：6：1，洗脱液E的配方为氯仿体积：甲醇体积：0.4M乙酸钠-乙酸溶液体积＝4：6：1。
[0033] 洗脱峰分别进行薄层层析(TLC)检测，收集含有SQDG的洗脱液，减压浓缩至恒重，得SQDG粗品；将所获SQDG粗品用疏水柱层析分离，将SQDG溶液上样疏水柱，SQDG溶液体积：柱体积＝1：3，然后分别用5倍柱体积的洗脱液F和洗脱液G进行梯度洗脱；所述SQDG溶液的溶剂为1M乙酸钠-乙酸缓冲液，所述洗脱液F为1M乙酸钠-甲醇溶液，所述洗脱液G为0.005M乙酸钠-甲醇溶液。洗脱峰分别进行薄层层析(TLC)检测，收集含有SQDG的洗脱液，减压浓缩至恒重，得到硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)。
[0034] 将制备的SQDG用水溶解，SQDG溶液通过20kD～50kD万截留分子量的超滤膜超滤，所得滤液经冷冻干燥制得呈乳白色的SQDG干粉。
[0035] 实施例2
[0036] 将干燥的藻粉在常压、室温下用提取液I溶解，藻粉以克或公斤计量，提取液以毫升或升计量，藻粉的质量与提取液I的体积数值之比为1：6，所述提取液I为氯仿、甲醇和氯化钾水溶液的混合液，氯仿体积：甲醇体积：氯化钾水溶液＝1：1：1，将藻粉溶液搅拌4h～5h，然后离心分离并收集有机相I，将上述制备的有机相I加入提取液II，有机相I：提取液II的体积＝1∶2，所述提取液II为氯仿和氯化钾水溶液的混合液，氯仿体积：氯化钾水溶液＝
1：1，然后离心分离并收集有机相II，将有机相II用低压色谱柱进行纯化，收集得到极性总甘油酯，通过减压浓缩至恒重，去除极性总甘油酯中的有机溶剂。
[0037] 低压色谱柱层析条件如下：将硅胶用四氯化碳-二氧六环按(四氯化碳体积：二氧六环体积＝2：5～1：1)匀浆混匀后装入柱内(1×30～50cm)，然后依次用洗脱液A、洗脱液B、洗脱液C淋洗，直至基线恒定；洗脱液A为氯仿体积：甲醇体积：甲酸体积＝40：5：1的氯仿-甲醇-甲酸溶液，洗脱液B为氯仿体积：甲醇体积：甲酸体积＝30：5：1的氯仿-甲醇-甲酸溶液，洗脱液C为氯仿体积：甲醇体积：甲酸体积＝28：5：1的氯仿-甲醇-甲酸溶液。
[0038] 将制备的总甘油酯用Q Sepharose柱层析分离，首先对Q Sepharose柱进行处理，Q Sepharose柱体积为50ml，然后将5倍柱床体积的总甘油脂溶液以450ml/h流速上样，用5倍柱床体积的洗脱液D以1000ml/h流速进行淋洗，分别以5倍柱床体积的洗脱液D和洗脱液E进行梯度洗脱。
[0039] Q Sepharose柱处理为：将空柱装填Q Sepharose，以10倍柱床体积的0.4M乙酸钠-乙酸溶液淋洗并浸泡过夜，然后用10倍柱床体积的洗脱液E淋洗，再用5倍柱床体积的洗脱液D淋洗，直至基线恒定；所述洗脱液D的配方为氯仿体积∶甲醇体积∶水体积＝5∶8∶1，洗脱液E的配方为氯仿体积∶甲醇体积∶0.4M乙酸钠-乙酸溶液体积＝5∶8∶1。
[0040] 洗脱峰分别进行薄层层析(TLC)检测，收集含有SQDG的洗脱液，减压浓缩至恒重，得SQDG粗品；将所获SQDG粗品用疏水柱层析分离，将SQDG溶液上样疏水柱，SQDG溶液体积∶柱体积＝1∶1，然后用10倍柱体积的洗脱液F和洗脱液G进行梯度洗脱；所述SQDG溶液的溶剂为1M乙酸钠-乙酸缓冲液，所述洗脱液F为1M乙酸钠-甲醇溶液，所述洗脱液G为0.005M乙酸钠-甲醇溶液。洗脱峰分别进行薄层层析(TLC)检测，收集含有SQDG的洗脱液，减压浓缩至恒重，得到硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)。
[0041] 将制备的SQDG用水溶解，SQDG溶液通过20kD～50kD万截留分子量的超滤膜超滤，所得滤液经冷冻干燥制得呈乳白色的SQDG干粉。
[0042] 以上所述仅是本发明的实施方式，再次声明，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进，这些改进也列入本发明权利要求的保护范围内。
