一种用于生物HE染色的染料组合物、应用及其使用方法

摘要

本发明公开一种医学生物形态学研究领域，具体涉及一种用于生物HE染色的染料组合物、应用及其使用方法。所述染料组合物由A液和B液混合组成；A液包括染色有效成分a、染色辅助成分以及水；其中染色有效成分a由苏木精、硫酸铝钾、氧化剂组成，染色辅助成分由柠檬酸、丙三醇中若干组分组成；B液由染色有效成分b和水组成，其中染色有效成分b为伊红和80‑85％酒精；所述A液与B液的混合比例为体积比3:(18‑25)。本发明所述用于生物HE染色的染料组合物其可以有效的缩减现有HE染色技术的染色步骤，简化染色过程，较易掌握。

权利要求

1.一种用于生物HE染色的染料组合物的使用方法，其特征在于：首先将生物组织固定于FAA固定液中，经流水洗后，放入染料组合物中进行染色，然后逐步经脱水、石蜡包埋、切片、烘干封固即可；

所述染料组合物由A液和B液混合组成：

A液由染色有效成分a、染色辅助成分以及水组成，其中染色有效成分a、染色辅助成分以及水的重量份数比为(1.5-2.5)：(4-5.5)：(90-100)；其中染色有效成分a由重量份数比分别为0.3-0.5份苏木精、1.2-1.8份硫酸铝钾、0.02-0.08份任一选自碘酸钠、高锰酸钾的氧化剂组成，染色辅助成分由柠檬酸、丙三醇中若干组分组成；

B液由染色有效成分b和水组成，其中染色有效成分b为伊红和80-85％酒精，并且伊红、水、80-85％酒精的重量份数比为1：(3-5)：(95-100)；

所述A液与B液的混合比例为体积比3：(18-25)；

所述生物为生物组织。

2.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述A液中染色有效成分a、染色辅助成分以及水的重量份数比为2.05:5.02:95。

3.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述A液中染色有效成分a由重量份数比分别为0.4份苏木精、1.6份硫酸铝钾、0.05份任一选自碘酸钠、高锰酸钾的氧化剂组成。

4.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述氧化剂为碘酸钠。

5.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述A液中染色辅助成分由重量份数比为0.02份柠檬酸和5份丙三醇组成。

6.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述B液中伊红、水、85％酒精的重量份数比为1:5:100。

7.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述A液与B液的混合比例为体积比3:

20。

8.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于：所述FAA固定液是由体积比为1:1：(18-20)的40％甲醛溶液、冰醋酸、70％酒精组成。

说明书

一种用于生物HE染色的染料组合物、应用及其使用方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种医学生物形态学研究领域，具体涉及一种用于生物HE染色的染料组合物、应用及其使用方法。

背景技术

[0002] 医学生物形态学研究领域通常需要对生物组织内的细胞器等形态结构进行染色，以利于达到可视化观察，限定并对其进行检查。为了达到更有利的可视化观察效果，对生物组织的染色技术在不断的发展，通常采用HE染色技术，H指苏木精(Hemaltoxylm)、E指伊红(eosin)，其化学式分别如下：

[0003]

[0004] 苏木精是最早用于生物学的天然染料之一，是生物形态学实验室中最常用的染料，它来源于苏木树的树心木提炼出而获得，呈淡黄褐色的粉末状，易溶于酒精，也可溶于热水。从伊红的化学结构中，可看到它的酸性着色基团为羟基(—OH)和羧基(—COOH)，它能与NaOH作用生成钠盐(—COONa)。而钠盐经电离后，它的有色离子为阴离子的过程，可使细胞质和细胞外基质中的成分染成红色。

[0005] HE染色技术通常分为两种，一是传统的经典石蜡切片HE染色方法，二是现有常用的普通整块苏木精伊红染色方法。由于传统的石蜡组织切片染色都是采取单片片染的方法，它是一种传统而最常用的石蜡切片技术。其基本程序：(i)取材和固定；(ii)脱水和包埋；(iii)切片、染色和封固。这种方法在医学形态学领域中广泛应用而被人们熟知。但是，这种制作法具有一定的弊端和局限性，比如在制作做大批量连续教学切片时；同时，也可耗费制作者大量的时间和精力。普通整块苏木精伊红染色方法的操作程序通常为：取材→固定→脱色→媒染→苏木精染色液染色→分色→还原→流水冲洗→蒸馏水洗→伊红染色液染色→常规脱水→透明→石蜡包埋、切片→贴片及烤片→透明→树胶封固。但这方法同样也存在一定弊端，染色液染色步骤较多，不易掌握等缺点，若染色技术掌握不到位，就容易导致所取材的组织结构出现差别以及出现染色结果不均匀一致的现象，而且还经过媒染→苏木精染色液染色→分色→还原→水洗→伊红染色液染色等过程。

[0006] 不论是传统石蜡方法还是整块HE染色方法，染色过程都较为复杂，染色步骤较多，不易掌握。

发明内容

[0007] 本发明人经过多年的研究发现，由于现有染料成份苏木精和伊红在染色过程中所配置而成的染色液通常只能单独分别进行染色，即需要在某一染色成份染色后，对染色对象进行一定处理后才可进行另一染色成份的染色步骤，否则染色出来的生物组织的细胞器形态结构无法可视化观察，即细胞核和细胞质的染色效果区分不够明显，有待于进一步改进。

[0008] 有鉴于此，本发明提供一种用于生物HE染色的染料组合物、应用及其使用方法，其可以有效的缩减现有HE染色技术的染色步骤，简化染色过程，较易掌握。

[0009] 为解决以上技术问题，本发明的技术方案是采用一种用于生物HE染色的染料组合物，所述染料组合物由A液和B液混合组成；

[0010] A液包括染色有效成分a、染色辅助成分以及水，其中染色有效成分a、染色辅助成分以及水的重量份数比为(1.5-2.5):(4-5.5):(90-100)；其中染色有效成分a由重量份数比分别为0.3-0.5份苏木精、1.2-1.8份硫酸铝钾、0.02-0.08份任一选自碘酸钠、高锰酸钾的氧化剂组成，染色辅助成分由柠檬酸、丙三醇中若干组分组成；

[0011] B液由染色有效成分b和水组成，其中染色有效成分b为伊红和80-85％酒精，并且伊红、水、80-85％酒精的重量份数比为1:(3-5):(95-100)；

[0012] 所述A液与B液的混合比例为体积比3:(18-25)。

[0013] 优选的，所述A液中染色有效成分a、染色辅助成分以及水的重量份数比为2.05:5.02:95。

[0014] 优选的，所述A液中染色有效成分a由重量份数比分别为0.4份苏木精、1.6份硫酸铝钾、0.05份任一选自碘酸钠、高锰酸钾的氧化剂组成。

[0015] 优选的，所述氧化剂为碘酸钠。

[0016] 优选的，所述A液中染色辅助成分由重量份数比为0.02份柠檬酸和5份丙三醇组成。

[0017] 优选的，所述B液中伊红、水、85％酒精的重量份数比为1:5:100。

[0018] 优选的，所述A液与B液的混合比例为体积比3:20。

[0019] 本申请还提供第二种技术方案，即前述任一所述的染料组合物作为生物HE染色时染料的应用，其特征在于：所述生物主要指生物组织。

[0020] 本申请还提供第三种技术方案，即前述任一所述的染料组合物在用于生物HE染色时的使用方法，其特征在于：首先将生物组织固定于FAA固定液中，经流水洗后，放入权利要求1-7任一所述的染料组合物中进行染色，然后逐步经脱水、石蜡包埋、切片、烘干封固即可。

[0021] 优选的，所述FAA固定液是由体积比为1:1:(18-20)的40％甲醛溶液、冰醋酸、70％酒精组成。

[0022] 本申请所述用于生物HE染色的染料组合物的基本说明如下：

[0023] 本发明人通过长时间的研制得出，本申请所述的染料组合物可以有效的对生物组织进行染色，所得染色效果为细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，颜色分明，有利于对细胞结构进行有效的观察。同时本申请所述染料组合物可以有效的缩减现有HE染色技术的染色步骤，简化染色过程，较易掌握。

附图说明

[0024] 图1-3为实施例一中染液5分别对应的肝、脾、肾组织切片效果示意图。

具体实施方式

[0025] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0026] 下面将列举一些与本申请相关的用于生物HE染色的染料组合物。

[0027] 染液1：

[0028] 该染液1的染料组合物由A液和B液混合组成；

[0029] A液由染色有效成分a、染色辅助成分以及水组成，其中染色有效成分a、染色辅助成分以及水的重量份数比为1.5:5.5:100；其中染色有效成分a由重量份数比分别为0.3份苏木精、1.8份硫酸铝钾、0.08份高锰酸钾组成，染色辅助成分由柠檬酸组成；

[0030] B液由染色有效成分b和水组成，其中染色有效成分b为伊红和80％酒精，并且伊红、水、80％酒精的重量份数比为1:3:95；

[0031] 所述A液与B液的混合比例为体积比3:18。

[0032] 染液2：

[0033] 该染液2的染料组合物由A液和B液混合组成；

[0034] A液由染色有效成分a、染色辅助成分以及水组成，其中染色有效成分a、染色辅助成分以及水的重量份数比为1.5:5.5:100；其中染色有效成分a由重量份数比分别为0.3份苏木精、1.8份硫酸铝钾、0.08份碘酸钠组成，染色辅助成分由丙三醇组成；

[0035] B液由染色有效成分b和水组成，其中染色有效成分b为伊红和80％酒精，并且伊红、水、80％酒精的重量份数比为1:3:95；

[0036] 所述A液与B液的混合比例为体积比3:18。

[0037] 染液3：

[0038] 该染液3的染料组合物由A液和B液混合组成；

[0039] A液由染色有效成分a、染色辅助成分以及水组成，其中染色有效成分a、染色辅助成分以及水的重量份数比为2.5:4:90；其中染色有效成分a由重量份数比分别为0.5份苏木精、1.2份硫酸铝钾、0.02份高锰酸钾组成，染色辅助成分由柠檬酸组成；

[0040] B液由染色有效成分b和水组成，其中染色有效成分b为伊红和85％酒精，并且伊红、水、85％酒精的重量份数比为1:5:100；

[0041] 所述A液与B液的混合比例为体积比3:25。

[0042] 染液4：

[0043] 该染液4的染料组合物由A液和B液混合组成；

[0044] A液由染色有效成分a、染色辅助成分以及水组成，其中染色有效成分a、染色辅助成分以及水的重量份数比为2.5:4:90；其中染色有效成分a由重量份数比分别为0.5份苏木精、1.2份硫酸铝钾、0.02份碘酸钠组成，染色辅助成分由丙三醇组成；

[0045] B液由染色有效成分b和水组成，其中染色有效成分b为伊红和85％酒精，并且伊红、水、85％酒精的重量份数比为1:5:100；

[0046] 所述A液与B液的混合比例为体积比3:25。

[0047] 染液5：

[0048] 该染液5的染料组合物由A液和B液混合组成；

[0049] A液由染色有效成分a、染色辅助成分以及水组成，其中染色有效成分a、染色辅助成分以及水的重量份数比为2.05:5.02:95；其中染色有效成分a由重量份数比分别为0.4份苏木精、1.6份硫酸铝钾、0.05份碘酸钠组成，染色辅助成分由0.02份柠檬酸和5份丙三醇组成；

[0050] B液由染色有效成分b和水组成，其中染色有效成分b为伊红和85％酒精，并且伊红、水、85％酒精的重量份数比为1:5:100；

[0051] 所述A液与B液的混合比例为体积比3:20。

[0052] 实施例一

[0053] 本申请上述染液1-5分别用于对兔的肝、脾、肾组织进行染色实验即实施例一，首先经过FAA固定液固定、苏木精伊红稀释染色液染色、组织脱水、石蜡包埋、切片、烘干程序，从而实现对所选用的组织结构及细胞成分的显示目的。

[0054] 现将具体技术方法程序介绍如下：

[0055] 1.取材选用兔肝、脾、肾三种组织样品作为制片材料，取材大小以组织厚2～3mm，长宽0.5cm×0.5cm为佳。

[0056] 2.固定把组织样品放入FAA固定液(40％甲醛液5ml、冰醋酸5ml、70％酒精90ml)的广口瓶中固定20～24小时。

[0057] 3.浸洗经去离子水洗8～12小时。

[0058] 4.染色将获取组织分别浸入染液1-5中进行染色，可根据组织结构特点来确定染色时间，一般为5～12小时。

[0059] 5.浸洗用去离子水冲洗10～20小时，再用蒸馏水稍洗。

[0060] 6.脱水与透明经70％、80％、95％酒精各1小时，无水酒精Ⅰ、Ⅱ脱水各30分钟，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各30～40分钟。

[0061] 7.浸蜡与包埋经石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各30分钟～1小时，用石蜡(熔点54℃)进行包埋。

[0062] 8.切片与展片用切片机切片厚度5～6μm(精度±1μm)，再放入40～45℃的水温中展片。

[0063] 9.贴片与烘干贴片后放入50～55℃温箱中进行烤片10～15小时。

[0064] 10.脱蜡与封固脱蜡用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30分钟，使用永久封片介质(如中性树胶)进行封固。

[0065] 实验结果显示：利用上述染液1-5所实验的动物兔组织切片显示出苏木精伊红染色，显微镜下观察得出，细胞核呈蓝色，核仁清楚；细胞质呈红色，染色质颗粒清晰可见。

[0066] 同时，本申请人发现，上述实施例一中采用染液5相较于其他染液1-4所得染色效果更为突出，具体体现在以下方面。

[0067] 表1、染液1-5对应的组织切片染色效果-1

[0068]

[0069] 从表1中可见，相比于其它l～4组染色液，经第5组染色液染色后，更能清晰的观察到几种组织的细胞膜和核膜的边缘，核质更加分明。

[0070] 在第5组染色液中，对组织样品肝、脾、肾的切片，在显微镜下观察染色效果，认为在第1组-第5组均保持其独特的染色性质，第5组染色液是效果最清楚的。对于这些染色结果可以进一步说明苏木精、氧化剂、媒染剂之间的搭配比例及染液的浓度与染色效果，对于研制这些染色液都有着直接的关系。

[0071] 另外，图像分析系统中的光度学参数定量分析的常用指标为光密度(OD)又称吸光度，它是指光线通过溶液或物质前的入射光强度Ia与该光线通过后的透射光强度Ib比值的对数，即：OD＝1g(Ia/Ib)。理论上已经证实A＝OD(吸光度等于光密度)。OD值愈大，则光线被吸收程度就愈大，物质的颜色就越深；反之吸光度值越小，则光线被吸收的程度就愈小，物质的颜色就越浅，可反映出所含物质的量就愈低的状况。它能反应所测目标的颜色深浅程度。采用吸光度测定法能更好的客观反正细胞中某种物质的显色强度以及反映出所测定细胞中某种物质的含量；它是根据细胞内不同化学成分的染色反应具有不同的吸收波长，并且这些吸收值和细胞化学含量间存在一定的化学剂量学关系，它是一种可见光吸光度术；同时，加入细胞核与细胞质着色的吸光度比的测定以及应用。

[0072] 选取图像分析(Image analysis,IA)技术，对1～5组染液对应的肝、脾、肾组织的吸光度进行测定以及定量分析。通过IA对分别代表兔肝、脾、肾组织的吸光度细胞浆、细胞核及细胞核与细胞浆着色的吸光度比值进行测定以及分析，从而探讨几种组织在IA下的染色结果。

[0073] 首先采用图象采集系统(OLYMPOSB×51)，切片在光镜下按统一放大倍数(10×20倍)，对每张切片进行图片拍摄；再用美国Media Cybertics公司生产的Image-Pro Plus图像分析软件(Version  6.0)，对图片进行综合形态测量分析，选择光密度(Optical density)，对选中阳性染色区域进行测定，数据结果直接登录至Excel表中，进行统计处理。最后将所得数据从Excel表转入SPSS16.0版统计软件，先进行方差齐性分析，当方差齐时，进行One-Way ANOVA检验，并且P<0.05时，计为差异具有统计学意义，统计数据用 表示。

[0074] 将5组染色液中的每种溶液对肝、脾、肾进行染色获得的结果，分别进行了细胞核与质颜色吸光度比比值，细胞核颜色吸光度以及细胞质颜色吸光度的测定，所得测定结果见下表。

[0075] 表2、染液1-5对应的组织切片染色效果-2

[0076]

[0077] 通过对肝、脾、肾组织的统计学分析处理以及比较，可进一步表明本方法对兔的肝、脾、肾组织进行一次性整块HE染色方法的结果的可靠性，尤其是第5组染色液最宜适用于这种方法染色。染色后染液5组着色的鲜艳程度、清晰程度和重复使用率均优于染液第1～4组。

[0078] 经染色效果分析，可以看出经染液1～5获得的染色效果相近似，均能达到本申请方案所述的目的；染液1和2的染色液更适宜用于显示细胞核的情况，而经染液3和4的染色液染色后的组织细胞核和胞质染色均偏深，造成核染色和胞质染色的对比度差，组织结构的观察相对染液5的染色效果来说不是很清晰；染液5的染色效果最佳，细胞核呈鲜艳的蓝色，核仁、核膜及核染色质颗粒清晰可见，分辨良好，胞浆粉红色，胞核、胞浆对比鲜明，最适于一次性整块HE染色方法的制作，可参见表1，与光镜下观察的细胞染色效果一致；它既能更清晰地显示组织结构，又能区分细胞的形态特点，可达到提高实验教学和科研质量的目的。

[0079] 从上述表格中可以看出，染液5对应的组织切片的染色效果中核-质颜色对比度以及细胞核颜色饱和度、细胞质颜色饱和度均优于染液1-4的切片组织染色效果。图1-3为实施例一中染液5分别对应的肝、脾、肾组织切片效果示意图；图1为肝切片染色效果，图2为脾切片染色效果，图3为肾切片染色效果。

[0080] 另外，本申请人也同样发现调整A液与B液的配比成为较为关键的因素，可通过以下实验证实：

[0081] 实施例二：取兔肝、脾、肾各3块，将组织切成0.8cm×0.6cm×0.2cm，放入FAA固定液中固定12～20小时，经流水冲洗后15～20小时，放于按下面方法配制成的苏木精伊红稀释染色液中染色1～3小时。

[0082] 苏木精伊红稀释染色液配制方法：取苏木精染色液(A液：染液1-5中任一A液配比)10毫升，再取伊红染色液(B液：染液1-5中任一B液配比)100毫升，将A液与B液按1:10体积比例混合配成苏木精伊红稀释染色液，即可使用。

[0083] 经染色后，经流水冲洗20～24小时，蒸馏水洗涤，逐级从70％、80％、90％各液酒精经过2小时。再将组织块入95％、100％酒精脱水各2小时，放入二甲苯透明16小时后，放入软蜡浸2次，每次60分钟，共2小时。硬蜡浸2次，每次60分钟，共2小时，常规石蜡包埋。用切片机将蜡块切成5～6微米厚的蜡带。将蜡带分剪成一张一张的蜡片贴到载玻片上，贴片后经二甲苯脱蜡2次，各30分钟，中性树胶封固。显微镜下观察其结果：细胞着色浅淡，伊红对比着色也十分浅淡，细胞间的界限尚可分辨，细胞轮廓尚可明了。另一种情况是细胞核染色不清，细胞质的伊红对比染色完全无效或着色淡红，细胞边界难以辨认，可见有的细胞形态不够完整。

[0084] 实施例三：取兔肝、脾、肾各3块，将组织切成0.8cm×0.6cm×0.5cm，放入FAA固定剂中固定15～20小时，取出组织经流水冲洗20～24小时，再放入按下列方法配制的苏木精伊红稀释染色液中染色1～2天。

[0085] 苏木精伊红稀释染色液配制方法：取苏木精染色液(A液：染液1-5中任一A液配比)30毫升，再取伊红染色液(B液：染液1-5中任一B液配比)100毫升，将A液与B液按3:10体积比例混合配成苏木精伊红稀释染色液，即可使用。

[0086] 再经流水冲洗20小时，蒸馏水稍洗，逐级从70％、80％、90％各级酒精脱水各2～3小时，再放入95％、100％酒精脱水各1～2小时，放入二甲苯透明10～15小时后，放入软蜡浸2次，每次30～40分钟。硬蜡浸2次，每次50～60分钟，常规石蜡包埋。用切片机将蜡块切成6微米厚的蜡带，将蜡带分剪成一张一张的蜡片贴在载玻上，贴片后经二甲苯脱蜡2次，各20～30分钟，中性树胶封固。显微镜下观察结果：细胞着色稍深，细胞结构模糊，细胞边界不清，可见呈密集的深黑色细胞核，细胞质呈深红色，而且多弥散变形。

[0087] 实施例四：取兔肝、脾、肾各3块，将组织切成0.8cm×0.6cm×0.8cm，放入FAA固定剂中，固定6～8小时后，经流水冲洗20～24小时，再放入按下面方法配制的苏木精伊红稀释染色液中染色5～8天。

[0088] 苏木精伊红稀释染色液的配制方法：取苏木精染色液(A液：染液1-5中任一A液配比)40毫升，再取伊红染色液(B液：染液1-5中任一B液配比)100毫升，将A液与B液按4:10体积比例混合配成苏木精伊红稀释染色液，即可使用。

[0089] 再经流水冲洗20～24小时，蒸馏水稍洗，逐级70％酒精、80％酒精、90％酒精脱水各2小时，入95％、100％酒精脱水各2小时，再入二甲苯透明16小时后入软蜡浸2次，每次30～40分钟。硬蜡浸2次，每次60分钟，常规石蜡包埋。用切片机将蜡块切成5～6微米厚的蜡带，将蜡带分剪成一张一张的蜡片贴到载玻片上，贴片后经二甲苯脱蜡2次，各20～30分钟，中性树胶封固。显微镜下观察结果：细胞核、细胞质均染色偏深，细胞核核膜也难以分辨，细胞边界模糊不清，细胞质呈现蒙蒙的红黑色状态。

[0090] 上述实施例二-四对于动物兔组织的染色效果均不符合本申请所述的要求。而本申请所述的A液与B液的配比比例采用本申请所述的体积比为3:18-25则可以得到本申请所述的生物组织的染色效果的细胞核与细胞质可有效的进行可视化分辨，同时可以有效的缩减现有HE染色技术的染色步骤，简化染色过程，较易掌握。

[0091] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。