一株植物乳杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GLM101及其在制备饲料添加剂中的应用。该菌株已于2015年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11156。本发明植物乳杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、创伤弧菌和嗜水气单胞菌具有很强的抑制能力，并具有良好的耐酸、胆盐的能力。可用于调节动物肠内微生态平衡，具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、促进动物生长和提高饲料转化率。

权利要求

1.植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），其分类命名为Lactobacillus plantarum GLM101，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 11156。

2.权利要求1所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GLM101在抑菌中的应用。

3.权利要求1所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GLM101在制备饲料添加剂中的应用。

4.一种制备植物乳杆菌固体发酵产品的方法，其特征在于：该方法为将权利要求1所述的植物乳杆菌菌种按2～4％的接种量接种到高密度固态发酵培养基中，于30～37℃的条件下密闭发酵，再将发酵产物于45～60℃烘干，即可；

所述高密度固态发酵培养基的配方为麦麸15%～25%，豆粕19%～29%，甘蔗糖蜜1%～3%，活性炭1%～3%，碳酸钙2%～4%，β-环状糊精2%～6%和水40%～50%，其中百分号为质量百分比。

5.根据权利要求4所述的一种制备植物乳杆菌固体发酵产品的方法，其特征在于：所述高密度固态发酵培养基的配方为麦麸20%，豆粕24%，甘蔗糖蜜2%，活性炭2%，碳酸钙3%，β-环状糊精4%和水45%，其中百分号为质量百分比。

6.一种植物乳杆菌固体发酵产品，其特征在于：其制备方法为权利要求4所述的方法。

7.权利要求6所述的一种植物乳杆菌固体发酵产品在制备饲料添加剂中的应用。

说明书

一株植物乳杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株新菌种及其应用，具体涉及一株植物乳杆菌GLM101的分离鉴定，及其在抑菌剂及饲料添加剂中的应用。

背景技术

[0002] 在养殖技术领域中，抗生素的使用能够有效地预防动物疾病，降低动物死亡率，减少肉品污染的风险。但是，其在动物饲料中的滥用造成动物性食品抗生素残留超标，使动物和人体存在对抗生素产生耐药性的风险。欧盟自2006年起将全面禁止食品动物食用抗生素促生长饲料添加剂，而且，抗生素对动物和人类的健康造成的风险也已引起我国农业部门的重视。加强管理养殖环节抗生素的合理使用和畜禽食品中抗生素残留超标，成为食品安全领域关注的热点。

[0003] 益生菌是动物肠道内的正常菌群，对动物体没有毒副作用。其附着在动物肠道内，一方面产生一些抑制病原菌生长的物质，另外在生长代谢过程中，可以分泌多种酶类，促进动物对饲料的消化吸收，提高料肉比，促进动物健康生长。因此益生菌制剂成为国内外业界研究的热点。

[0004] 植物乳酸杆菌属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，最适生长温度为30～37℃，兼性厌氧，最适pH6.5左右。植物乳杆菌与人类的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用。它对肠道微生物有重要影响，无论在食品发酵，还是在工业乳酸发酵以及饲料添加剂等领域，都有着广泛的应用。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GLM101。

[0006] 本发明的另一目的在于提供上述植物乳杆菌在制备饲料添加剂中的应用。

[0007] 本发明所采取的技术方案是：

[0008] 申请人将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏中心于2015年7月23日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CGMCC No.11156，建议的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，已于2015年7月23日鉴定保藏的菌株是存活的。

[0009] 本发明的有益效果是：

[0010] 本发明提供了一株植物乳杆菌GLM101，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、创伤弧菌和嗜水气单胞菌具有显著的抑制作用；具有较好的耐酸性，可在pH 2.0的条件下生存；具有耐胆盐能力，在1～3‰胆盐条件下能够生长。

[0011] 本发明的提供的一株植物乳杆菌可用于制备饲料添加剂，并适合应于畜禽、水产养殖的全过程。菌株GLM101能够有效的提高保育猪的生产性能，也能明显提高猪群的健康水平，减少抗生素及其他药物的使用，节省成本。

[0012] 本发明植物乳杆菌可用于调节动物肠内微生态平衡，具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、促进动物生长和提高饲料转化率。

具体实施方式

[0013] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

[0014] 实施例1植物乳杆菌GLM101的分离、筛选、鉴定及保存

[0015] 1.1菌株的分离

[0016] 取健康仔猪粪便样品，用无菌水分别进行10、100、1000倍稀释，取200μL涂布于MRS固体培养基，37℃培养48小时，挑取菌落，划线MRS培养基，经4次纯化后，挑取单菌落至MRS肉汤中培养至对数期，加入终浓度20％甘油，-80℃下保存备用。经革兰氏染色、触酶试验、硝酸盐还原试验和16S rDNA测序。

[0017] 1.2菌株形态学特征鉴定

[0018] 取纯化菌株(命名为GLM101)的单菌落，转接到MRS固体培养基(琼脂)上，于37℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株GLM101在MRS固体培养基上形成边缘整齐，光滑，粘稠，表面光泽，不透明的菌落。在显微镜下观察，为杆状。

[0019] 1.3菌株的生理生化特征

[0020] 挑取菌株GLM101在MRS固体培养基(琼脂)上培养24h的新鲜培养物，进行生理生化测试。结果显示，GLM101为革兰氏阳性杆菌。

[0021] 1.3.1 API 20NE鉴定特征

[0022] 利用法国梅里埃API20NE标准鉴定系统测定菌株GLM101利用碳源及产酸情况，API 20NE试验条是由20个含干燥底物或培养基的小管所组成。

[0023] 1)API 20NEAUX培养基成分：(NH4)2SO42g，琼脂1.5g，无机盐基础82.8mg，氨基酸250mg，维生素和营养物底物35.9mg，磷酸缓冲液0.04M加至1000ml，最终pH为7.0～7.2；

[0024] NaCl0.85％培养基：NaCl8.5g，H2O1000mL。

[0025] 2)在平板上培养菌株，以接种针从分离物的平板上挑取1～4份纯单个菌落至2ml含0.85％NaCl的培养基中，仔细研匀以达到均一的细菌悬液，所需浓度为0.5麦氏单位标准浊度。打开AUX培养基的安瓿管加入200μL(6～8滴)剩下的生理盐水菌悬液至安瓿，仔细混匀，但要避免有气泡产生。

[0026] 3)盐水菌悬液和接种的AUX培养基分别加入相应的试验条小管，GLU，ADH和CIRE则用矿物油覆盖。

[0027] 4)盖上培养盒，于30℃培养24小时后观察现象，结果如表1所示。

[0028] 表1.菌株GLM101生化鉴定结果

[0029]

[0030] 注：+：表示反应为阳性；-：表示反应为阴性；

[0031] 从表1中可以看出，本发明菌株可以葡萄糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、硝酸钾、七叶灵、对硝基-D-甲基半乳糖为碳源。

[0032] 1.3.2 API ZYM鉴定特征

[0033] 利用法国梅里埃API ZYM系统，可系统和快速地研究菌株GLM101产酶能力，API ZYM试验条是由20个小管所组成，它的底部是一个专门设计含有酶底物和缓冲液的支持物。步骤如下：

[0034] 1)用2ml无菌蒸馏水挑新鲜细菌培养物制备一个菌悬液，其混浊度在McFarland No 5和No 6之间。

[0035] 2)用吸管接种，于试验条的每个杯中接入2滴标本(65微升)。

[0036] 3)接种后，于37℃培养箱培养4小时。

[0037] 4)培养后，加1滴ZYMA试剂和1滴ZYM B试剂。观察颜色并记录结果如表2所示：

[0038] 表2.菌株GLM101生化鉴定结果

[0039]

[0040] 注：+：表示反应为阳性；-：表示反应为阴性；w:表示反应较弱。

[0041] 从表2中可以看出，本发明菌株GLM101具有产白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、β-半乳糖甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶等功能。

[0042] 1.4菌株的分子生物学鉴定

[0043] 1)利用天跟细菌基因组提取试剂盒(TIANAMP Bacteria DNA Kit)提取菌株GLM101的基因组DNA，步骤按厂家说明书要求所述。利用细菌通用引物27F，1492R扩增菌株16S rDNA片段。

[0044] 2)如上所述的引物对序列为，1492R：TACCTTGTTACGACTT，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

[0045] 3)菌株的16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO.1。在NCBI上比对后发现其与模式菌株Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ATCC 14917(T)的相似性达到为99.93％，综合菌株GLM101有关生理生化指标和分子生物学鉴定结果，结合其形态学特征，我们将其命名为Lactobacillus plantarum GLM101，于2015年年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.11156。

[0046] 1.5菌株的功能筛选

[0047] 1.5.1耐酸性试验。

[0048] 实验选取前期从健康仔猪肠道、植物、奶酪、市售同类产品等来源分离纯化到乳酸菌菌株作为对照，经革兰氏染色、触酶试验、硝酸盐还原试验和16S rDNA测序等鉴定，这些乳酸菌菌株分别属于粪肠球菌4株、屎肠球菌2株、发酵乳杆菌2株、干酪乳杆菌2株、戊糖乳杆菌2株、植物乳杆菌5株、罗伊氏乳杆菌3株、鼠李糖乳杆菌3株、唾液乳杆菌2株、嗜酸乳杆菌1株。16S rDNA测序比对分析结果见下表3。

[0049] 表3.相关分离所得乳酸菌菌株的鉴定结果

[0050]

[0051]

[0052] 实验方法：用HCl调节液体培养基至pH 2.0。将菌种以的5％(V/V)的接种量分别接种上述各处理，37℃静置培养。在接种初始及接种后120min取上述各处理中培养菌液，进行平板计数，从而计算出细菌的存活率，以pH 6.0的菌液为对照。存活率(％)＝待测pH的菌液活菌数/pH6.0的菌液活菌数×100％。实验结果见表4。

[0053] 实验结果：

[0054] 表4.GLM101与其它分离菌株耐酸实验对比结果

[0055]

[0056] 由实验结果可知，所分离的菌株在pH 2.0条件下时的存活率分别为1.2％～76.3％，其中菌株GLM101的存活率最高，达到76.3％。

[0057] 进一步对菌株GLM101进行耐酸性检测，实验方法为：

[0058] 设4个不同pH值处理，分别用HCl调节液体培养基至pH值为1.5、2.5、3.5、4.5。将菌种以的5％(V/V)的接种量分别接种上述各处理，37℃静置培养。在接种初始及接种后30、60、90、120、150min取上述各处理中培养菌液，进行平板计数，从而计算出细菌的存活率，以pH 6.0的菌液为对照。存活率(％)＝待测pH的菌液活菌数/pH6.0的菌液活菌数×100％。实验结果见表5。

[0059] 表5菌株GLM101耐酸实验结果

[0060]

[0061] 由实验结果可知，所分离的菌株在pH 1.5、2.5、3.5、4.5时的存活率分别为2.1％、66.9％、88.0％、95.1％，说明该菌具有较强的耐酸性，最低可以耐受pH范围为1.5～2.5。

[0062] 1.5.2抑菌试验

[0063] 实验菌株选取实验室前期分离自植物、仔猪肠道、市售同类产品等来源的植物乳杆菌，指示菌株选取大肠杆菌(Escherichia coliATCC 8739)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi CMCC(B)50071)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus ATCC 27562)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosaATCC 9027)。采用牛津杯法，将指示菌株分别涂布于MRS琼脂平板上，每杯加入
0.2mL培养24h的乳酸菌培养液，恒温培养箱中培养，观察培养结果，测定平皿内抑菌圈直径大小，实验结果见表6。

[0064] 实验结果：

[0065] 表6.菌株GLM101抑菌实验对比结果

[0066]

[0067]

[0068] 注：实验重复3次，结果为三次平均值。

[0069] 由实验结果可知，所分离的菌株对常见致病指示菌有良好的抑制作用，其中菌株GLM101对指示菌的抑菌能力都好与其它来源植物乳杆菌。

[0070] 在抑菌试验中，还检测了本发明菌株GLM101对绿脓杆菌的抑制作用，操作方法同上所述的牛津杯法，实验结果显示，菌株GLM101组产生了直径为17.5mm的抑菌圈，而对照组无抑菌圈出现，进一步说明本发明分离的菌株GLM101对常见致病指示菌有良好的抑制作用。

[0071] 1.5.3耐受胆盐试验。

[0072] 实验菌株选取实验室前期分离自植物、仔猪肠道等来源的乳酸菌菌株(表3)，菌株培养16h后，在4℃12000g离心4分钟后收集菌体，用PBS溶液冲洗2次。加入含有胆盐0.7％(w/v)的PBS溶液中，37℃培养4h后，稀释至10-4浓度涂布MRS平板，37℃厌氧培养48h后，观察MRS平板上菌落生长情况。

[0073] 结果显示，在所有的实验平板中，仅GLM101、GLM271、GLM274、GLM280、GLM321、GLM322、GLM344、GLM347菌落数超过长出1.0*108CFU/ml，其中菌株GLM101的存活量最高，达到3.8*108CFU/ml，具体结果见表7。

[0074] 表7.各菌株经胆盐0.7％(w/v)处理4h后的存活菌量

[0075]

[0076]

[0077] 注：----表示存活乳酸菌菌落数≦1.0*106CFU/ml。

[0078] 实施例2菌株GLM101固体发酵产品的制备方法

[0079] 1)菌种及其种子液制备

[0080] 乳酸菌菌株GLM101在MRS琼脂平板活化，挑取单菌落接种于MRS液体试管，37℃培养24h后，以2％接种量转接于MRS液体培养基，培养24后作为种子液。

[0081] MRS培养基主要成分是蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰
0.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6。最适pH 6.0，最适温度37℃，兼性厌氧。

[0082] 2)接种

[0083] 以3％v/v接种量将制备的种子液接种到配置的高密度固态培养基(含麦麸20％，豆粕24％，甘蔗糖蜜2％，活性炭2％，碳酸钙3％，β-环状糊精4％和水45％，其中百分比均为质量百分比)。麦麸20％，豆粕24％，甘蔗糖蜜2％，活性炭2％，碳酸钙3％，β-环状糊精4％和水45％

[0084] 3)发酵

[0085] 将接好菌种的培养基在30～37℃下密闭发酵48h。然后将发酵产物在55℃下烘干4.1h，即得菌株GLM101固体发酵产品。

[0086] 取上述发酵烘干产品，梯度稀释，涂布MRS培养基，厌氧培养48h后，计算菌落数，实验结果显示本发明发酵烘干产品中的活菌含量为3.6*1010CFU/g。

[0087] 实施例3菌株GLM101固体发酵产品对保育猪生产性能的影响

[0088] 3.1实验动物与分组

[0089] 选取32日龄断奶仔猪216头为实验对象，其中实验组、对照组各108头，饲喂至77日龄。实验从2013年3月4日开始至2013年4月18日结束，历期45天。

[0090] 3.2实验设计

[0091] 对照组1：基础日粮不添加菌株GLM101固体发酵产品；

[0092] 对照组2：基础日粮添加0.1％市场某同类产品；

[0093] 实验组：基础日粮中添加0.1％(质量百分比)菌株GLM101固体发酵产品，实验详细设计如表8所示。

[0094] 表8.日粮结构

[0095]

[0096]

[0097] 3.3、结果与分析

[0098] (1)发酵菌株对保育猪体重增加的影响

[0099] 体重增加情况如表9所示，实验组初重8.99kg/头，末重25.41kg/头，日增重364.89g；对照组初重9.08kg/头，末重25.14kg/头，日增重356.89g。实验组日增重比对照组
1多8.00g，在实验期间头均净增重多0.36kg。

[0100] 表9.发酵菌株对保育猪体重增加的影响

[0101]

[0102] (2)菌株GLM101对保育猪育成率的影响

[0103] 保育猪育成率情况如表10所示，实验组选取108头仔猪，实验期间淘汰4头，死亡1头，实验结束时存栏103头，育成率为95.37％；对照组选取108头断奶仔猪，实验期间淘汰4头，死亡5头，实验结束时存栏99头，育成率为91.67％。实验组比对照组育成率明显提高。

[0104] 表10发酵菌株对保育猪育成率的影响

[0105]

[0106] (3)菌株GLM101对保育猪料肉比的影响

[0107] 保育阶段的耗料情况如表11所示，在保育阶段，实验组的头均增重为16.42kg，头均耗料为30.37kg，料肉比为1.85。实验组比对照组的料肉比相比显著下降。

[0108] 表11发酵菌株对保育阶段料肉比的影响

[0109]

[0110] 3.4、效果讨论与说明

[0111] 本实验表明实验组每头保育猪较基础饲料对照组平均体重提高了0.36kg，平均日增重提高了8.0g，死亡淘汰率降低了3.70％，料肉比降低了0.47。实验证明，菌株GLM101能够有效的提高保育猪的生产性能，且显著优于对比的市场同类产品。另外菌株GLM101的使用能明显提高猪群的健康水平，可减少抗生素及其他药物的使用，同样可以节省成本。

[0112] 综上所述，本发明植物乳杆菌可用于调节动物肠内微生态平衡，具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、促进动物生长和提高饲料转化率。

[0113] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。