3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用，该3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明通过提取灰树花子实体总RNA，逆转录合成cDNA，并通过RT‑PCR技术克隆灰树花的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(Gfhg)，得到了3669bp的完整基因序列；还构建了真核表达载体pCAMBIA1302‑Gfhg‑hyg，应用樟芝菌丝体系统，对克隆获得的pCAMBIA1302‑Gfhg‑hyg进行了功能性验证，灰树花3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(Gfhg)能够提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量以及下游次级代谢产物，使植物产生或提高三萜的含量、提高植物的抗病性。

权利要求

1.一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种编码权利要求1所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

4.一种包含权利要求2或3所述的基因的表达盒。

5.一种包含权利要求2或3所述的基因的重组载体。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，原始载体为pGEM-T或pCAMBIA1302。

7.一种包含权利要求2或3所述的基因的转化子。

8.如权利要求7所述的转化子，其特征在于，宿主为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或樟芝菌丝体细胞。

9.如权利要求7所述的转化子在生产樟芝三萜中的应用。

说明书

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 植物萜类的生物合成途径有两条：甲戊二羟酸途径甲戊二羟酸途径(mevalonic pathway，MVA)和脱氧木糖磷酸酯途径(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway，DXP)。MVA途径位于细胞质和内质网中，萜类化合物主要是以MVA途径在细胞质中合成。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)催化HMG-CoA形成甲羟戊酸(mevalonate，MVA)，MVA的生成是一个不可逆的过程，所以3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶被认为是MVA途径中的限速酶。

[0003] 萜类化合物广泛存在于高等动、植物及真核生物体内。它是由三十个碳结合成六角形或五角形的天然有机化合物的总称。其在医疗卫生、工农业生产、能源等领域均有重要作用。研究发现，三萜类化合物具有多种生物活性，包括调节免疫、抑制血管新生、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等。

[0004] 药理研究表明，三萜类化合物是极具开发潜力的天然资源，如从红豆杉中发现的紫杉醇可用于肿瘤的治疗，来自于黄花蒿的青蒿素是治疗疟疾的特效药，丹参酮对心血管系统疾病有良好的疗效并被制成多个剂型供临床使用，大戟属植物中的松香烷内酯型成分具有抗炎抗肿瘤和致炎致癌的双重生理活性等。

[0005] 目前，随着应用范围的不断扩大，三萜类化合物需求量急剧上升；但植物中三萜类化合物含量较低，化学合成虽然条件成熟，但由此产生的活性成分含量和质量极不稳定。现代生物工程与生物技术的发展，使得多种三萜类化合物合成途径中的关键酶基因被克隆、分离、鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产三萜类化合物提供了新途径。

[0006] 灰树花是食、药兼用蕈菌，其属于非褶菌目、多孔菌科、树花属，含有多种功能性成分，如多糖、萜类、氨基酸等，具有良好的防癌抗癌、抗衰老、抗病毒等功能，目前，以拟南芥、烟草、辣椒、穿心莲、人参、铁皮石斛、灵芝中已克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，但未见以灰树花为材料克隆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的报道。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用，该3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶可显著提高植物三萜类化合物的合成量。

[0008] 一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

[0009] 本发明还提供了一种编码所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因。

[0010] 优选地，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

[0011] 本发明还提供了一种包含所述的基因的表达盒。

[0012] 本发明又提供了一种包含所述的基因的重组载体。所述的重组载体的原始载体为pGEM-T或pCAMBIA1302。

[0013] 本发明还提供了一种包含所述的基因的转化子。宿主为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或樟芝菌丝体细胞。

[0014] 本发明还提供了一种所述的转化子在生产三萜类化合物中的应用。作为优选，所述三萜类化合物为樟芝三萜。

[0015] 本发明所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因可提高植物中三萜的合成量，提高植物的抗病性和抗逆性，可应用于植物基因工程，制备转基因植物品种、转基因食用真菌品种，如：转基因水稻、拟南芥、人参、灵芝等植物和食用真菌。

[0016] 本发明通过提取灰树花子实体的总RNA，逆转录后构建cDNA文库，二代测序数据分析发现了一个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，通过RT-PCR技术克隆了灰树花的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(Gfhg)，得到了3669bp的完整基因序列；构建了真核表达载体pCAMBIA1302-Gfhg-hyg转化樟芝菌丝体表达系统，对克隆的Gfhg基因功能进行了验证，Gfhg基因能够在樟芝菌丝体中正常表达，产生樟芝三萜及其衍生物。灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(Gfhg)能够提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量以及下游次级代谢产物，使植物产生或提高三萜的含量、提高植物的抗病性。

附图说明

[0017] 图1为本发明pGEM-T-Gfhg载体的示意图；

[0018] 图2为本发明pCAMBIA1302-Gfhg-hyg载体的示意图；

[0019] 图3为本发明pCAMBIA1302-Gfhg-hyg载体的酶切结果；

[0020] 左为DNA ladder(碧云天，D0107)，右为pCAMBIA1302-Gfhg-hyg载体酶切结果；

[0021] 图4为本发明转基因樟芝子实体阳性克隆的PCR检测结果；

[0022] M为DNA Marker III(TIANGEN)，1-7为转基因樟芝子实体阳性克隆，CK为未转基因对照；

[0023] 图5为本发明樟芝菌丝体对照及转基因克隆中、其他物种中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性检测结果；

[0024] 从左至右分别为未转基因对照、转基因樟芝菌丝体、灵芝、烟草、人参、拟南芥中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性测定结果。

[0025] 图6为本发明樟芝菌丝体对照及转基因克隆中樟芝三萜的含量检测结果；

[0026] CK1、CK2为未转基因对照中樟芝三萜的含量，1、2、4、5、6、7为转基因PCR阳性克隆中樟芝三萜的含量。

具体实施方式

[0027] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0028] 实施例1 灰树花总RNA的抽提

[0029] 抽提步骤如下：

[0030] (1)样品的裂解：取灰树花子实体50～100mg置于研钵中，加入液氮快速研成粉末，移入已经加入1ml Trizol的离心管中，用移液器吹打混匀；

[0031] (2)室温静置5min，4℃，12000rpm离心10min；

[0032] (3)将上清液移入另一离心管中，加入200μL氯仿，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000rpm离心15min；

[0033] (4)转移上层水相，将其移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置5～10min；

[0034] (5)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

[0035] (6)加入500μL的75％乙醇，混匀片刻后，4℃，7500rpm，离心5min，小心弃上清；

[0036] (7)室温静置10min左右，干燥RNA沉淀，加入适量无RNase的水溶解，电泳检测RNA质量。

[0037] 实施例2 灰树花的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(Gfhg)的克隆

[0038] 取1μg总RNA，以random hexamers为引物，按照SuperScript III First-Strand Synthesis System说明操作，反转录生成第一链。

[0039] 根据灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因CDS序列设计引物如下：

[0040] 上游引物SEQ ID NO.1Gfhg-F：ga aga tct atg cgt gcg ata ctt cgc ccg c；

[0041] 下游引物SEQ ID NO.2Gfhg-R：cc cac gtg tca ctt cgt ctc cac agc ata gc；

[0042] 取灰树花总RNA反转录生成的第一链cDNA为模板做PCR扩增。

[0043] PCR反应体系如下：

[0044]

[0045] PCR扩增程序如下：

[0046]

[0047] 参考Quick Gel Extraction Kit(康为世纪)说明书对扩增产物进行切胶回收。

[0048] 实施例3 克隆载体pGEM-T-Gfhg的构建

[0049] 参考pGEM-T Vector Systems(Promega)，采用试剂盒中的T4 DNA Ligase将切胶回收的Gfhg基因片段(SEQ ID NO.5)与T载体连接起来。

[0050] 参考pGEM-T Vector Systems(Promega)说明书，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞。在转化产物中加入400μL LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养2h后，均匀涂布于含X-Gal，IPTG，AMP的LB固体培养皿上，正置1h晾干，37℃倒置培养28-24h形成单菌落。

[0051] 以上述引物Gfhg-F和Gfhg-R对10个单克隆进行PCR鉴定，PCR条件：93℃，3min；93℃，30s；56℃，30s；72℃，3min，30个循环；72℃，10min。PCR产物电泳验证，选择电泳条带正确的克隆送上海生工测序，测序结果与灰树花二代转录组测序组装数据库进行比对，克隆载体图谱见图1。

[0052] 实施例4 真菌表达载体pCAMBIA1302-Gfhg-hyg的构建

[0053] 将克隆载体pGEM-T-Gfhg和pCAMBIA1302真菌表达空载体，用Bgl II，Pml I(Promega)分别酶切，真核表达载体图谱见图2。

[0054] 其反应体系为：

[0055]

[0056] 37℃温浴3h。

[0057] 1％琼脂糖凝胶电泳检测条带后，参考琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Invitrogen)说明书对Gfhg片段和pCAMBIA1302真菌表达空载体进行回收，参考T4连接酶反应试剂盒说明书(takara)对回收产物进行连接，连接产物转化Ecoli DH5α，涂布于含卡那霉素50mg/mL的LB平板。挑选单克隆，于5mL含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。将菌液倒入1.5mL的EP管中，12000rpm离心1min，收集菌体，用于质粒抽提，参考柱式质粒小量提取试剂盒(Invitrogen)说明书抽提质粒。以质粒为模板，以Gfhg基因上下游引物Gf-F和Gf-R进行PCR反应，以检验表达载体pCAMBIA1302-Gfhg-hyg是否构建成功。

[0058] PCR反应体系如下：

[0059]

[0060] PCR扩增程序如下：

[0061]

[0062] PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对PCR阳性克隆进行酶切鉴定，进一步验证是否连接成功，如图3酶切电泳图。结果表明载体pCAMBIA1302-Gfhg-hyg构建正确。

[0063] 实施例5 用于真菌转基因的农杆菌工程菌EHA105/pCAMBIA1302-Gfhg的构建[0064] 1、农杆菌感受态细胞制备

[0065] (1)从LB培养基平板上挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于5mL液体LB(含50mg/L利福平)中，28℃，200rpm培养过夜；

[0066] (2)取1mL菌液接种于50mL液体LB(含50mg/L利福平)中扩大培养，28℃，200rpm培养至OD600＝0.5；

[0067] (3)冰浴30min，4℃，4000rpm，离心10min收集菌体，菌体重悬于10mL 0.15mol/L的NaCl中；

[0068] (4)4℃，4000rpm，离心10min收集菌体，菌体重悬于1mL 20mM CaCl2中，每管分装200μL，液氮速冻后-70℃保存。

[0069] 2、真核表达载体的转化

[0070] (1)取纯化的pCAMBIA1302-Gfhg-hyg质粒DNA 2μg，加入200μL感受态细胞中混匀；

[0071] (2)冰浴5min，转入液氮冷冻1min，迅速置于37℃水浴5min；

[0072] (3)加入800μL的LB液体培养基，28℃，200rpm，4h；

[0073] (4)4000rpm，10min离心收集菌体，200μL的LB重悬，涂布于含相应抗生素的LB选择培养基中；

[0074] (5)28℃培养2d，挑取单菌落培养，用碱裂解法提取质粒进行PCR验证。

[0075] 实施例6 农杆菌介导法转化樟芝菌丝体

[0076] 1、菌丝体原生质体制备

[0077] (1)将圆形菌丝块置于PDA平板上，待长满菌丝后，用打孔器打孔接种于PDA液体培养基中，28℃，150rpm培养5d；

[0078] (2)培养物用组织粉碎机无菌条件下粉碎，以10％接种量接种于100L PDA液体培养基中；

[0079] (3)28℃静置培养3.5d，期间间或摇匀；

[0080] (4)6000rpm离心10min，去除培养基；

[0081] (5)用0.6mol/L甘露醇溶液洗漆2次，4000rpm离心10min离心除去甘露醇；

[0082] (6)每300mg湿菌丝加入1mL 2％溶壁酶酶液。30℃酶解3.5h，每隔30min轻微轻摇一次；

[0083] (7)将酶解液过滤以除去细胞碎片，过滤液4000rpm离心10min；

[0084] (8)收集沉淀，用渗透压稳定剂洗涤一次，得到纯化原生质体。

[0085] 2、农杆菌介导的菌丝体原生质体转化

[0086] (1)EHA105(含质粒)在LB平板上(50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素)划线培养，28℃培养2天；

[0087] (2)挑单菌落于5mL LB(50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素)，28℃，200rpm培养至OD600＝0.5-0.6；

[0088] (3)取ImL菌液，4000rpm离心收集菌体，重悬于5mL IM培养基中。28℃，200rpm培养至OD600＝0.5-0.6；

[0089] (4)每107个原生质体与300μL农杆菌于IM培养基中混合；

[0090] (5)28℃静置共培养36h后，3000rpm，离心10min收集菌体，潮霉素(Hygromycin)洗涤一次并涂布于含潮霉素抗性培养基上；

[0091] (6)28℃，培养7-15天，挑取转化子。

[0092] 实施例7 转基因菌丝体DNA的PCR检测

[0093] 1、CTAB法提取菌丝体总DNA

[0094] (1)取悬浮培养的樟芝菌丝体约100mg，放入到EP管中，用液氮研磨成粉末，加入600μL DNA提取液，65℃水浴1h，期间每10min上下颠倒一次。

[0095] (2)加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，涡旋振荡，静置5min，12000rpm，离心10min。

[0096] (3)取上清转至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，放置5min，12000rpm，10min室温离心，去上清。

[0097] (4)用75％乙醇洗涤沉淀2次，室温下晾干后，加入50μL重蒸水。

[0098] (5)取1μLDNA样品在0.8％琼脂糖凝胶、电泳缓冲液1×TAE、电压为120v的条件下电泳20min，紫外观察，其余-20℃保存备用。

[0099] (6)以菌丝体基因组DNA为模板进行PCR检测，引物如序列表所示：SEQ ID NO.3:GATACTTCGCCCGCTCTCTA和SEQ ID NO.4:ACCTCGACCATGACAGTCAA，扩增目的基因1200bp片段。反应条件：93℃，3min；93℃，30s；56℃，30s；72℃，1min，30个循环。72℃，10min。取PCR产物5μL电泳检测，如图4，说明Gfhg基因已经成功转入樟芝菌丝体。

[0100] 实施例8 转基因樟芝菌丝体中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性的测定[0101] 1、转基因樟芝菌丝体中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的提取

[0102] (1)新鲜菌丝体以1:3(w/v)加入匀浆缓冲液(100mmol/L蔗糖+50mmol/L KCl+40mmol/L K2HPO4+30mmol/L EDTA，pH 7.2)，匀浆。

[0103] (2)室温12000rpm离心20min，取上清。

[0104] (3)上清100000rpm超速离心60min，沉淀用含10mmol/L DTT的上述匀浆缓冲液重悬。

[0105] (4)加入1/6体积的甘油，37℃温浴60min，12000rpm离心20min，取上清，即为蛋白液。

[0106] (5)BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)测定总蛋白含量。并用缓冲液稀释至1mg/mL的蛋白浓度。

[0107] 2、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性测定

[0108] 往反应缓冲液中(0.2mol/L KCl+0.16mol/L K2HPO4+4mmol/L EDTA+10mol/L DTT，pH 7.0)加入100μmol/L的NADPH及待测还原酶200μg。加入底物HMG-COA 50μmol/L，使总反应体积为1ml，37℃温浴60min，紫外分光光度计测定OD340改变。根据以下公式得到HMG-COA还原酶的活性：酶活性[mmol/(mg·min)]＝(测定管ΔOD340-空白管ΔOD340)/(6.22*0.2*60)

[0109] 通过测定转基因樟芝菌丝体中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，发现其明显高于野生型对照，并高于拟南芥、烟草、人参、灵芝中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，这说明该基因在樟芝菌丝体中进行表达，且具有较强的生物活性(图5)。

[0110] 实施例9 转基因樟芝菌丝体中樟芝三萜含量的检测

[0111] 1、转基因樟芝菌丝体中樟芝三萜的提取

[0112] 采用加热回流法提取转化子中的樟芝三萜：取100mg转基因樟芝菌丝体，加入95％乙醇溶液5ml，50℃恒温水浴锅中浸泡1.5h，过滤取上清，测定提取液中三菇类化合物含量。

[0113] 2、标准曲线的制备

[0114] (1)以齐墩果酸(Oleanic acid)为标准品绘制标准曲线。精确称取105度下干燥至恒重的齐墩果酸2.5mg，定容至25mL；

[0115] (2)以A245nm为纵坐标，齐墩果酸含量为横坐标(七个点为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg)，绘制标准曲线。

[0116] 3、样品中樟芝三萜含量的检测

[0117] 精密吸取樟芝三萜样品制备液0.1mL，加入10mL具塞试管中，加香草酸0.2mL，高氯酸0.5mL，混匀后于60℃水浴保温30min，取出并置于冷水中15min，加冰醋酸5mL，混匀后于A245nm处测定并记录其吸光值样品，然后利用标准曲线或回归方程求出样品三萜含量。

[0118] 通过测定转基因樟芝菌丝体中樟芝三萜含量，发现其明显高于野生型对照，说明该基因在樟芝菌丝体中进行表达，并使樟芝菌丝体积累了樟芝三萜(图6)。