一种利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法

摘要

本发明公开了一种利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于：首先将肠膜状明串珠菌的种子液接种到含质量浓度为2％～5％的蔗糖的发酵培养基中发酵，并在发酵过程中补加质量浓度为15％的蔗糖溶液，在肠膜状明串珠菌发酵的0～36h接入棘孢青霉菌的种子液继续进行混菌发酵，所得发酵液经膜分级过滤后得到右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。本发明的方法相对于单独使用肠膜状明串珠菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶，混菌发酵能够解决右旋糖酐蔗糖酶分离困难的问题，并且能够以更低成本、更少能耗获得更高酶活力；相对于使用工程菌制备右旋糖酐蔗糖酶，混菌发酵所获得的酶稳定性较高且操作简单方便，对菌的生长条件以及酶的制备设施要求不高。

权利要求

1.一种利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于：首先将肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的种子液接种到含质量浓度为2％～5％的蔗糖的发酵培养基中发酵，并在发酵过程中补加质量浓度为15％的蔗糖溶液，在肠膜状明串珠菌发酵的

24h接入棘孢青霉菌(Penicillium aculeatum)的种子液继续进行混菌发酵，总发酵时间

48h，所得发酵液经膜分级过滤后得到右旋糖酐蔗糖酶粗酶液；

在发酵过程中补加质量浓度为15％的蔗糖溶液的方法是：在发酵的前10小时内补加2次，18小时后补加一次，每次补加蔗糖溶液的体积占所述发酵培养基体积的40％。

2.根据权利要求1所述的利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于：所述发酵培养基中各成分的质量百分含量为：蔗糖2％-5％，蛋白胨0.2％-0.5％，硫酸镁0.01％-0.05％，氯化钾0.01％-0.05％，磷酸氢二钾0.02％-0.1％，硝酸钠0.1％-0.2％，余量为水；

所述发酵培养基pH为7.0-7.5。

3.根据权利要求1所述的利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于：所述肠膜状明串珠菌的种子液的体积为所述发酵培养基体积的1％-3％，发酵条件为：温度25℃-30℃，转速120r/min。

4.根据权利要求1所述的利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于：所述棘孢青霉菌的种子液的体积为所述发酵培养基体积的3％-5％。

5.根据权利要求1所述的利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于：所述肠膜状明串珠菌和所述棘孢青霉菌为野生型菌株或通过基因工程技术手段改造野生型菌株所获得的工程菌。

6.根据权利要求1或5所述的利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于：所述肠膜状明串珠菌为肠膜状明串珠菌-0326，所述棘孢青霉菌为棘孢青霉菌F1008。

说明书

一种利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用混菌发酵生产右旋糖酐蔗糖酶的方法。

背景技术

[0002] 右旋糖酐蔗糖酶又名葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase)和葡聚糖蔗糖酶(Glucansucrases)，它能够以蔗糖为底物合成不同结构的右旋糖酐。该酶多由肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和链球菌(Streptococcus sp.)及乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)产生。右旋糖酐蔗糖酶目前主要用来制备右旋糖酐，而右旋糖酐广泛应用于医药、食品、化工等行业。此外，利用固定化右旋糖酐蔗糖酶可以合成一些功能性低聚糖，这些糖常作为益生元广泛应用于食品行业。右旋糖酐蔗糖酶还可以以不同的糖为底物，经过反应合成一些有特殊作用的产物。

[0003] 葡聚糖的高质量生产和不同分子量葡聚糖的生成是多糖类产品的核心技术。提高产品的质量和产量主要是减少杂质和增加纯度，而这一步最关键的是对酶的分离和纯化，所以得到高效酶活的右旋糖酐蔗糖酶是非常重要的。制备右旋糖酐蔗糖酶的菌有工程菌株和原始菌株，工程菌株在制备右旋糖酐蔗糖酶的过程中对菌的培养条件和酶的制备设施要求较高，步骤繁琐复杂，不便于工业使用。目前工业上制备右旋糖酐蔗糖酶主要采用的是肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的发酵。但是因为发酵液中的右旋糖酐蔗糖酶是以一种复合物的形式(右旋糖酐-右旋糖酐蔗糖酶)存在而且发酵液的粘度较大，不仅导致了右旋糖酐蔗糖酶的分离困难，而且也造成了所制备的右旋糖酐氮源超标。因此降解右旋糖酐蔗糖酶复合物中的右旋糖酐是一种纯化酶的新方法，它不仅使右旋糖酐蔗糖酶游离于发酵液中，而且能够使发酵液的粘度大大降低，有利于酶的分离纯化。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，旨在克服传统制备右旋糖酐蔗糖酶酶活力低、步骤多、成本高的不足。

[0005] 本发明解决技术问题，采用如下技术方案：

[0006] 本发明利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特点在于：首先将肠膜状明串珠菌的种子液接种到含蔗糖的质量浓度为2％～5％的发酵培养基中发酵，并在发酵过程中补加质量浓度为15％的蔗糖溶液，在肠膜状明串珠菌发酵的0～36h内接入棘孢青霉菌的种子液继续进行混菌发酵，所得发酵液经膜分级过滤后得到右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。

[0007] 其中所述的发酵培养基为即适合棘孢青霉生长又适合肠膜状明串珠菌生长的优选发酵培养基，各成分的质量百分含量为：蔗糖2％-5％，蛋白胨0.2％-0.5％，硫酸镁0.01％-0.05％，氯化钾0.01％-0.05％，磷酸氢二钾0.02％-0.1％，硝酸钠0.1％-0.2％，余量为水；所述发酵培养基pH为7.0-7.5，0.1MPa灭菌20min。

[0008] 接入发酵培养基的肠膜状明串珠菌和棘孢青霉菌为本领域常规的各自的种子液，优选处于菌体生长指数期。

[0009] 肠膜状明串珠菌的种子液的培养基中各成分的质量百分含量为：蔗糖10％，蛋白胨0.4％，硫酸镁0.05％，氯化钾0.05％，磷酸氢二钾0.1％，硝酸钠0.2％，余量为水；肠膜状明串珠菌的种子液的培养基pH＝7.3，0.1MPa灭菌20min。

[0010] 棘孢青霉菌的种子液的培养基中各成分的质量百分含量为：1.5％右旋糖酐T70，0.5％蛋白胨，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％KCl，0.1％K2HPO4·3H2O，0.001％FeSO4·7H2O，余量为水；棘孢青霉菌的种子培养基pH＝5.5，0.1MPa灭菌20min。

[0011] 其中在把握肠膜状明串珠菌生长特点的前提下，在该菌发酵期间，补加蔗糖溶液来调节蔗糖浓度以便诱导右旋糖酐蔗糖酶大量产生。补加蔗糖的质量浓度为15％，发酵的前10小时补加2次，发酵18小时后补加1次，每次补加蔗糖溶液的体积占所述发酵培养基体积的40％。

[0012] 棘孢青霉菌的接入不仅能够刺激肠膜状明串珠菌的生长，而且所产的右旋糖酐酶能够降解右旋糖酐，解除产物对肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)产右旋糖酐蔗糖酶的抑制。此外，右旋糖酐酶降解大分子的过程中，使包裹在右旋糖酐内部的右旋糖酐蔗糖酶暴露并释放出来，便于该酶在发酵液中制备。棘孢青霉菌(Penicillium aculeatum)在肠膜状明串珠菌发酵0-36小时后接入继续混菌培养12-72小时。

[0013] 本发明利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的发酵过程如下：

[0014] 首先将肠膜状明串珠菌的种子液按照发酵培养基体积的1％-3％(优选3％)接入到含质量浓度为2％～5％的蔗糖的发酵培养基中，在25℃-30℃、120r/min发酵；在肠膜状明串珠菌发酵的前10小时分两次补加质量浓度为15％的蔗糖溶液，在肠膜状明串珠菌发酵18小时后再次补加质量浓度为15％的蔗糖溶液，在肠膜状明串珠菌发酵0-36小时，将占发酵培养基体积比3％-5％的棘孢青霉菌的种子液接入发酵培养基，25℃-30℃、120r/min继续进行混菌发酵，混菌发酵的优选温度为26℃；棘孢青霉菌的接入时间优选为肠膜状明串珠菌发酵24时，混菌发酵的优选时间为24小时(即总发酵时间48h)。

[0015] 本发明中采用的肠膜状明串珠菌和棘孢青霉菌可以是野生型菌株，也可以是通过基因工程技术手段改造野生型菌株所获得的工程菌。更优选的是野生型的菌株肠膜状明串珠菌-0326(Leuconostoc mesenteroides-0326)和棘孢青霉菌F1008(Penicillium aculeatum F1008)。

[0016] 本发明采用混菌发酵来分离制备右旋糖酐蔗糖酶，肠膜状明串珠菌发酵液中的右旋糖酐能够诱导棘孢青霉菌产右旋糖酐酶，进而降解发酵液中的右旋糖酐蔗糖酶复合物中的右旋糖酐，经膜分级过滤达到分离右旋糖酐蔗糖酶的目的。

[0017] 肠膜状明串珠菌能够利用高浓度的蔗糖发酵产右旋糖酐蔗糖酶，右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为底物合成高分子右旋糖酐，并释放出果糖。根据实验经验，肠膜状明串珠菌在2-10小时主要是生长阶段，通过测定生长曲线得到。18-24小时主要是菌产酶阶段，此时发酵液中的蛋白含量达到最高。24-36小时主要是右旋糖酐蔗糖酶合成大分子右旋糖酐阶段，此时果糖变化率较大。为了制备右旋糖酐蔗糖酶，所采取的措施是在2-10小时内，通过补加蔗糖的量来调节蔗糖浓度，使肠膜状明串珠菌生长达到最大量。在18小时后，继续补加蔗糖诱导肠膜状明串珠菌大量产酶。在一定时期接入棘孢青霉菌共同培养，使棘孢青霉所产的右旋糖酐酶降解右旋糖酐，从而发酵液中大量的右旋糖酐蔗糖酶会游离于发酵液中，经膜分级过滤后得到右旋糖酐蔗糖酶粗酶。

[0018] 肠膜状明串珠菌和棘孢青霉混合发酵，不仅在高效制备右旋糖酐蔗糖酶提供一个新方法，而且为制备可控分子的右旋糖酐奠定基础。

[0019] 与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

[0020] 本发明在把握肠膜状明串珠菌生长代谢特点的前提下，通过不同时间段补加蔗糖溶液以达到右旋糖酐蔗糖酶酶的最大表达量；棘孢青霉菌接入后不仅能够刺激肠膜状明串珠菌快速生长，所产的右旋糖酐酶可以降解右旋糖酐-右旋糖酐蔗糖酶复合物中的右旋糖酐，使右旋糖酐蔗糖酶游离出来且降低发酵液粘度；此种方法经膜分级过滤后能够有效的把右旋糖酐蔗糖酶与大分子的右旋糖酐以及菌体分开，更利于提纯，且操作简便，成本低，所获酶活力不仅高而且很稳定。

[0021] 本发明的方法相对于单独使用肠膜状明串珠菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶，混菌发酵能够解决右旋糖酐蔗糖酶分离困难的问题，并且能够以更低成本、更少能耗获得更高酶活力；相对于使用工程菌制备右旋糖酐蔗糖酶，混菌发酵所获得的酶稳定性较高且操作简单方便，对菌的生长条件以及酶的制备设施要求不高。

附图说明

[0022] 图1为肠膜状明串珠菌-0326的生长曲线；

[0023] 图2为肠膜状明串珠菌-0326生长代谢过程中蛋白含量变化曲线；

具体实施方式

[0024] 本发明通过对肠膜状明串珠菌和棘孢青霉二者独自的生长代谢特点长期而广泛的研究，发现在二者混菌发酵过程中，右旋糖酐蔗糖酶能够很容易从粘度较高的发酵液中分离出来。

[0025] 本发明通过对肠膜状明串珠菌和棘孢青霉菌二者种子培养基以及混菌发酵培养基具体参数进行优化，比如培养基的初始pH，发酵温度，发酵时间，接种量，接种时间差等因素做了大量实验，包括单因素实验，Plackett-Burman实验确定主要因素，响应面实验和分析确定最优参数。在本发明的技术方案下，得到的右旋糖酐蔗糖酶适合大规模制备右旋糖酐。

[0026] 下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

[0027] 实施例1

[0028] 所用菌种：肠膜状明串珠菌-0326(Leuconostoc mesenteroides-0326)，棘孢青霉菌F1008(Penicillium aculeatum F1008)。

[0029] 1、棘孢青霉菌种子液的制备

[0030] 棘孢青霉菌的种子培养基中各成分的质量百分含量为：1.5％右旋糖酐T70，0.5％蛋白胨，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％KCl，0.1％K2HPO4·3H2O，0.001％FeSO4·7H2O，余量为水；棘孢青霉菌的种子培养基pH＝5.5，0.1MPa灭菌20min。

[0031] 棘孢青霉菌的种子液的制备：从保存棘孢青霉菌(Penicillium aculeatum)的培养皿中挑取菌落于培养基中，28℃下、200r/min培养5天，所得发酵液即为棘孢青霉菌的种子液，4℃保存备用。

[0032] 2、肠膜状明串珠菌的种子液的制备

[0033] 肠膜状明串珠菌的种子培养基中各成分的质量百分含量为：蔗糖10％，蛋白胨0.4％，硫酸镁0.05％，氯化钾0.05％，磷酸氢二钾0.1％，硝酸钠0.2％，余量为水，pH 7.3，
0.1MPa灭菌20min。

[0034] 肠膜状明串珠菌的种子液的制备：从保存肠膜状明串珠菌的培养皿中挑取菌落与培养基中，26℃、120r/min培养24小时，所得发酵液即为肠膜状明串珠菌的种子液，4℃保存备用。

[0035] 3、肠膜状明串珠菌-0326生长曲线的绘制：从肠膜状明串珠菌的种子液中取占发酵培养基体积3％的肠膜状明串珠菌接入含100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在26℃下120r/min下培养，每4小时取样测OD600值，根据时间值和OD600的关系，绘制出肠膜状明串珠菌生长曲线，如图1，可以看出肠膜状明串珠菌在0～10h为生长停滞期，12～24h为生长指数期，30～40h为生长平稳期。

[0036] 4、肠膜状明串珠菌-0326生长代谢过程中蛋白含量变化曲线的绘制：培养条件同上，每4小时取样。利用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，本实验测定波长在595处的吸收值作为相对值，不计算出具体数值。蛋白含量变化曲线间接反映右旋糖酐蔗糖酶在发酵液中的变化，如图2，在10h内发酵液中的蛋白含量是减少的，18～24h期间，发酵液中蛋白含量相对增加迅速。间接反映此时为主要产酶阶段。因此可选用此时间来制备右旋糖酐蔗糖酶。

[0037] 5、发酵培养基的配制：蔗糖5％，蛋白胨0.5％，硫酸镁0.05％，氯化钾0.05％，磷酸氢二钾0.1％，硝酸钠0.2％，余量为水。

[0038] 实施例2、肠膜状明串珠菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶

[0039] 作为对照组，将肠膜状明串珠菌的种子液按照培养基体积的3％接入到含100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，26℃下、120r/min发酵培养48小时，离心后所得上清液经膜分级过滤获得右旋糖酐蔗糖酶的粗酶液。

[0040] 通过DNS法检测所得右旋糖酐蔗糖酶的酶活力，具体步骤为：将粗酶液2mL与质量浓度为10％的蔗糖溶液2mL混合得反应液，取出500μL反应液加入DNS试剂375μL，在沸水中保持5min，待冷却至室温后加入5.375mL蒸馏水摇匀，在波长为520nm处测吸光度。以灭菌后的酶液与底物反应作为对照，每分钟催化底物蔗糖产生的1μmol果糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。

[0041] 经DNS法检测，本实施例所得右旋糖酐蔗糖酶的酶活力为6U/mL。

[0042] 实施例3、

[0043] 本实施例所用肠膜状明串珠菌的种子液、棘孢青霉菌的种子液及发酵培养基与实施例1相同。

[0044] 本实施例按如下步骤混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶：

[0045] 首先将肠膜状明串珠菌的种子液按照发酵培养基体积的3％接入到含50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，同时将占发酵培养基体积3％的棘孢青霉菌的种子液接入，26℃下、120r/min混菌发酵培养，在发酵的5h、10h及20h各加入质量浓度为15％的蔗糖溶液20mL，混菌发酵培养48小时后结束发酵，离心后所得上清液经膜分级过滤获得右旋糖酐蔗糖酶的粗酶液约100mL。经DNS法检测，本实施例所得右旋糖酐蔗糖酶的所得酶活力为8.7U/mL。

[0046] 实施例4

[0047] 本实施例所用肠膜状明串珠菌的种子液、棘孢青霉菌的种子液及发酵培养基与实施例1相同。

[0048] 本实施例按如下步骤混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶：

[0049] 首先将肠膜状明串珠菌的种子液按照发酵培养基体积的3％接入到含50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在26℃下、120r/min发酵培养，在肠膜状明串珠菌发酵的5h、10h及20h各加入质量浓度为15％的蔗糖溶液20mL；在肠膜状明串珠菌发酵12h时，将占发酵培养基体积比3％的棘孢青霉菌的种子液接入，继续混菌培养，在肠膜状明串珠菌发酵的48小时结束发酵，离心后所得上清液经膜分级过滤获得右旋糖酐蔗糖酶的粗酶液约100mL。经DNS法检测，本实施例所得右旋糖酐蔗糖酶的所得酶活力为23.4U/mL。

[0050] 实施例5

[0051] 本实施例所用肠膜状明串珠菌的种子液、棘孢青霉菌的种子液及发酵培养基与实施例1相同。

[0052] 本实施例按如下步骤混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶

[0053] 首先将肠膜状明串珠菌的种子液按照发酵培养基体积的3％接入到含50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在26℃下、120r/min发酵培养，在肠膜状明串珠菌发酵的5h、10h及20h各加入质量浓度为15％的蔗糖溶液20mL；在肠膜状明串珠菌发酵24h时，将占发酵培养基体积比3％的棘孢青霉菌的种子液接入，继续混菌培养，在肠膜状明串珠菌发酵的48小时结束发酵，离心后所得上清液经膜分级过滤获得右旋糖酐蔗糖酶的粗酶液约100mL。经DNS法检测，本实施例所得右旋糖酐蔗糖酶的所得酶活力为29.2U/mL。

[0054] 将本实施例所制备的右旋糖酐蔗糖酶用于制备右旋糖酐：用乙酸-乙酸钙缓冲液(pH5.40.02mol/L)配制浓度为10％的蔗糖溶液200mL，置于25℃条件下保温，然后加入右旋糖酐蔗糖酶至终浓度为2U/mL，120r/min反应4小时后保温20小时。反应结束后，将反应液置于80℃保温20min后终止反应。随后加入1倍体积的无水乙醇醇沉高分子右旋糖酐，将高分子右旋糖酐烘干，采用品氏粘度计检测产品分子量大小，结果表明，所制备的右旋糖酐粘均分子量是2000kDa。

[0055] 实施例6

[0056] 此外，本发明还考察了在肠膜状明串珠菌发酵的8h、16h、30h后接入棘孢青霉菌继续培养至48h后结束发酵，所得右旋糖酐蔗糖酶的酶活力的测定结果如表1，可以看出在肠膜状明串珠菌发酵24h后接入棘孢青霉菌混合发酵产右旋糖酐蔗糖酶所获得酶活力最高。

[0057] 表1棘孢青霉菌接入时间对产右旋糖酐蔗糖酶的影响

[0058]