一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用

摘要

本发明公开了一种植物生物技术领域的基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，能够调控目的基因在植物非分泌型腺毛中特异表达。同时本发明还涉及前述基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。由于利用植物腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作时，不会对植物的生长发育造成危害。因此，本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

权利要求

1.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为诱导型启动子。

3.一种如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在青蒿生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

4.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的用途，其特征在于，所述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物非分泌型腺毛中特异表达,所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种载体，其特征在于，所述载体连接有如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。

6.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述制备方法包括以下步骤：步骤一、培养青蒿无菌苗；

步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；

步骤三、分析调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；

步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；

步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；

步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；

步骤七、PCR检测转基因植株；

步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。

7.如权利要求6所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。

8.如权利要求6所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤三中调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件包括：TATA box、CAAT box、G-box、ARE、GA-motif、ATCT-motif、GARE-motif或HES。

9.如权利要求6所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下所示：

1391z-proADH2-F：AACTGCAGAGTCATTGCACATGATGCTCTAAGA

1391z-proADH2-R：CATGCCATGGCTTGAGCCACTGCACCTGATTCT。

10.如权利要求6所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤六具体包括：

1)外植体的预培养；

2)农杆菌与外植体的共培养；

3)抗性再生植株的筛选。

说明书

一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种启动子，尤其涉及一种一种利用分子生物学手段获得的在植物非分泌型腺毛中特异表达的萜类合成酶基因启动子(proADH2)及其在转基因植物中的应用。

背景技术

[0002] 青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，其植株中含有许多次级代谢产物：青蒿素、挥发油、α-蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此外还含有黄酮类化合物。青蒿素(Artemisinin)是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，作为世界卫生组织(WHO)推荐的抗疟疾药物联合治疗(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)的主要有效成分。目前青蒿素的主要来源是从青蒿的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。

[0003] 青蒿的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛(Glandular secretory trichome，GST)和非分泌型腺毛(T shape trichome，TST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。因此急需找到在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。因此，本发明致力提供一种克隆到植物腺毛组织特异表达的启动子。

发明内容

[0004] 有鉴于现有技术的上述缺陷，同时为深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控。本发明提供一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的启动子，能引导基因在转基因植物非分泌型腺毛中特异表达。所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0005] 进一步地，所述启动子为诱导型启动子。

[0006] 本发明还提供一种如上所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，可应用在在植物生产代谢产物的基因工程育种中。

[0007] 进一步地，所述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物非分泌型腺毛中特异表达。

[0008] 本发明还提供一种载体连接有如上述所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。

[0009] 本发明还提供一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，包括以下步骤：

[0010] 步骤一、培养青蒿无菌苗；

[0011] 步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；

[0012] 步骤三、分析调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；

[0013] 步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；

[0014] 步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；

[0015] 步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；

[0016] 步骤七、PCR检测转基因植株；

[0017] 步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。

[0018] 进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。

[0019] 进一步地，所述步骤三中调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件包括：TATA box、CAAT box、G-box、ARE、GA-motif、ATCT-motif、GARE-motif或HES。

[0020] 启动子序列中调控元件见下表1：

[0021] 表1：启动子序列中调控元件分析

[0022]

[0023] 进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下所示：

[0024] 1391z-proADH2-F：AACTGCAGAGTCATTGCACATGATGCTCTAAGA

[0025] 1391z-proADH2-R：CATGCCATGGCTTGAGCCACTGCACCTGATTCT

[0026] 进一步地，所述步骤六具体包括：

[0027] 1)外植体的预培养；

[0028] 2)农杆菌与外植体的共培养；

[0029] 3)抗性再生植株的筛选。

[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用有效的青蒿表皮毛组织特异性启动子代替组成型启动子可以用于构建在分子生物学中在青蒿非分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作以获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。

附图说明

[0031] 图1是本发明的一个实施例的AaADH2基因启动子序列及其顺式作用元件；

[0032] 图2为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；

[0033] 图3是为利用AaADH2基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z-proADH2通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中GUS组织染色图。

具体实施方式

[0034] 下面结合具体实例对本发明进行详尽说明，以下实例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明而不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

[0035] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0036] 本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105，质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

[0037] 实施例

[0038] 本实施例涉及AaADH2基因启动子的获得，具体包括如下步骤：

[0039] 步骤一、培养青蒿无菌苗

[0040] 青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；

[0041] 步骤二、基因组DNA中启动子序列的克隆

[0042] 步骤一、培养青蒿无菌苗

[0043] 青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无任何激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；

[0044] 步骤二、基因组DNA中启动子序列的克隆

[0045] 1.基因组DNA的提取

[0046] 在1.5mL离心管中加入2粒钢珠，在其中放一片青蒿叶片(1cm2左右大小，用冰盒盛取)。加入300μL TPS buffer(通风橱内操作，TPS中含有2％巯基乙醇)，55-60Hz，震荡90秒。再加入300μL TPS buffer(通风橱)。65℃水浴1h(每隔20min摇一摇)，可适当延长时间，最长1.5h。冷却至室温，4℃12000rpm离心15min。取300μL-400μL上清液。等体积加入300μL-
400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷)。混合后在-20℃冰箱中放置10-15min(可延长至1h)。取出4℃12000rpm离心10min，吸去上清，在通风橱中倒置10-15min。加入75％乙醇500-600μL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37℃中烘干，直到沉淀变为透明。加入50μLddH2O回溶，4℃保存。

[0047] 2.PCR扩增

[0048] 以基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR(Nested PCR)扩增，根据本实验室基因组测序得到的AaADH2基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表2所示，首轮PCR反应体系如表3所示。PCR条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。

[0049] 表2 巢式PCR引物设计

[0050]

[0051] 表3 第一轮PCR反应体系

[0052]

[0053] 将首轮PCR的产物稀释100倍，作为模板进行第二轮PCR，第二轮PCR反应体系见表4。PCR条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物，切胶回收目的片段，纯化DNA。然后连接到pMD18-T(购自TaKaRa公司)载体用于测序，将该片段的序列与基因序列进行拼接，获得AaADH2基因上游约530bp的片段。

[0054] 表4 第二轮PCR反应体系

[0055]

[0056] 步骤三、分析得到的AaADH2基因启动子的顺式作用元件，确定AaADH2基因启动子的类型

[0057] 本发明中得到的AaADH2基因启动子序列长度为919bp。为了寻找启动子上面的顺式作用元件，用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaADH2基因的启动子进行分析。分析发现多克隆到的启动子上面具有除了TATA box和CAAT box，还具有很多顺式作用元件：G-box、ARE、GA-motif、ATCT-motif、GARE-motif、HES等；G-box在很多植物启动子中都有发现，它是很多应激响应启动子行使功能所必须的元件，在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到很重要的作用；此外，GA-motif受光调控，GARE-motif在植物中能够响应赤霉素；以上结果分析表明，AaADH2基因启动子是一个诱导型的启动子，能受多种激素和自然因素诱导。

[0058] 步骤四、将得到的启动子连入pCAMBIA-1391z载体，融合GUS报告基因。

[0059] 为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将AaADH2基因的启动子proADH2连接pCAMBIA-1391z载体融合GUS报告基因，为了实现对表达载体的构建，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下表5所示：

[0060] 表5 pCAMBIA1391z-proADH2载体构建PCR引物

[0061]

[0062] 步骤五、将构建好的pCAMBIA1391z-proADH2载体转化根癌农杆菌并检测。

[0063] 将含有构建完成的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(EHA105)，并进行PCR验证。结果表明：含有基因启动子片段的植物双元表达载体成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含基因启动子和GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391z-proADH2的根癌农杆菌菌株中。

[0064] 步骤六、将带有pCAMBIA1391z-proADH2载体的根癌农杆菌转化青蒿

[0065] 1)外植体的预培养

[0066] 青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化；

[0067] 2)农杆菌与外植体的共培养

[0068] 将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含DEL0到DEL8基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；

[0069] 3)抗性再生植株的筛选

[0070] 将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/L Kan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株；

[0071] 步骤七，PCR检测转基因植株

[0072] 根据目的基因所在表达盒promoter-GUS序列promoter和GUS分别设计正向引物(proADH2:AGTCATTGCACATGATGCTCTAAGA)和反向引物(GUSR:GACATCGGCTTCAAATGGCGTA)对GUS基因进行检测；结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，如图2所示；

[0073] 步骤八，启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定

[0074] 对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图3所示，结果表明，染色部位在青蒿的非分泌型腺毛中特异性表达，说明AaADH2基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的proADH2基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。

[0075] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。