一种辅助筛选抗条锈病小麦的引物组及其应用

摘要

本发明公开了一种辅助筛选抗条锈病小麦的引物组及其应用。本发明提供了一种引物组合，为Xwmc382引物对和Xgwm636引物对。所述Xwmc382引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。所述Xgwm636引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。本发明所提供的引物对和分子标记可用于小麦抗条锈病分子育种和抗条锈病基因的克隆。本发明的专用引物和分子标记将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

权利要求

1.一种辅助鉴定待测小麦的抗条锈病性状的方法，包括如下步骤：

以待测小麦的基因组DNA为模板，分别采用Xwmc382引物对和Xgwm636引物对进行PCR扩增；

如果采用所述Xwmc382引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中不具有169bp的特异片段且采用所述Xgwm636引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中具有98bp的特异片段，待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；如果采用所述Xwmc382引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中具有169bp的特异片段且采用所述Xgwm636引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中不具有98bp的特异片段，待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；

所述Xwmc382引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述Xgwm636引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列

4所示的单链DNA分子组成；

所述待测小麦为如下小麦或它们的后代：小麦品种“中麦175”、小麦材料“CA13152”、小麦品种“京411”、小麦品种“轮选987”、小麦品种“中国春”、小麦品种“Avocet S”、小麦材料“CA12107”、小麦品种“铭贤169”、小麦品种“永刚2号”、小麦品种“周麦26”、小麦品种“济麦

22”、小麦品种“济麦23”、小麦品种“扬麦21”、小麦品种“扬麦14”、小麦品种“郑麦366”、小麦材料“92恢94-1-12”、小麦材料“99-19-10”或小麦品种“兰天21”；

所述条锈病为条锈菌小种CYR29引起的条锈病。

2.一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法，包括如下步骤：按照权利要求1所述方法鉴定待测小麦的抗条锈病性状，筛选具有抗条锈病性状的小麦。

说明书

一种辅助筛选抗条锈病小麦的引物组及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种辅助筛选抗条锈病小麦的引物组及其应用。

背景技术

[0002] 小麦条锈病是一种世界性的叶部真菌病害，对小麦产量和品质造成严重影响。小麦条锈病由条形柄锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起，喜阴好凉，几乎在全球所有的小麦种植区均有发生，一般年份损失10-70％，严重年份甚至绝产。在我国，小麦条锈病主要在西北和西南地区(如甘肃、四川等省)发生，最近几年在陕西、湖北等省也有加重趋势。1950、1964、1980和2002年该病害在我国曾一度大面积流行，给小麦生产带来巨大损失；过去10年，条锈病每年发生面积大约6000万亩。近年来，农业措施和化学药剂有效减少了小麦条锈病的流行和危害，但费时费力，污染环境，因而培育和推广抗条锈病品种是防治小麦条锈病最为经济有效环保的途径。

[0003] 目前有67个抗条锈病基因(Yr1-Yr67)已被正式命名，其中大多数为苗期抗性基因，具有生理专化性，抗性较强，但往往会因病原菌小种的变异而丧失抗性。历史上，已知的抗条锈病基因Yr9、Yr24/Yr26、Yr10等由于新小种CYR29、CYR32、CYR33、v26的相继出现，失去了抗性，造成小麦条锈病大面积流行，导致巨大的产量损失。对我国小麦条锈菌小种来说，迄今仅有Yr17、Yr18、Yr5和Yr15仍然保持着较好的抗性。由于单一基因存在潜在危害，通过多基因聚合、基因布局和多系品种等手段延长苗期抗病基因的寿命显得尤其重要。要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须有丰富的抗源基因。因此，寻找和发掘新的抗条锈病基因，开发与其紧密连锁的标记对分子标记辅助选择育种提供很大方便。

[0004] 在寻找和发掘新的基因过程中，分子标记应用十分广泛，尤其在小麦基因定位、数量性状位点作图、标记辅助选择育种和图位克隆等方面。常用的分子标记包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、DArT、SCAR和SNP，利用这些标记定位了多个小麦抗条锈病基因。其中SSR标记多态性高、稳定性好，共显性，染色体位置明确，操作过程简单，成本低廉，所以在分子标记辅助选择和聚合育种中得到广泛应用。利用紧密连锁的分子标记进行抗病基因鉴定和辅助选择育种，特异性的标记及引物是关键。

[0005] 普通小麦品种中麦175由中国农业科学院作物科学研究所育成，2008年通过国家审定，其综合农艺性状优良，苗期和田间均高抗小麦条锈病，可能含有新的抗条锈病基因。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种辅助筛选抗条锈病小麦的引物组及其应用。

[0007] 本发明提供了一种引物组合，为如下(a)或(b)或(c)：

[0008] (a)Xwmc382引物对和Xgwm636引物对；

[0009] (b)所述Xwmc382引物对；

[0010] (c)所述Xgwm636引物对；

[0011] 所述Xwmc382引物对为能扩增片段A的引物对；所述片段A为以小麦基因组DNA为模板采用序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增得到的片段；

[0012] 所述Xgwm636引物对为能扩增片段B的引物对；所述片段B为以小麦基因组DNA为模板采用序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增得到的片段。

[0013] 所述Xwmc382引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。

[0014] 所述Xgwm636引物对由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。

[0015] 所述引物组合(a)中，每个引物对单独包装。所述引物组合(a)中，每条引物单独包装。所述引物组合(b)中，每条引物单独包装。所述引物组合(c)中，每条引物单独包装。

[0016] 所述引物组合的用途为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)辅助筛选抗条锈病植物；(Ⅱ)辅助鉴定植物的抗条锈病性状。

[0017] 本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)辅助筛选抗条锈病植物；(Ⅱ)辅助鉴定植物的抗条锈病性状。

[0018] 本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)辅助筛选抗条锈病植物；(Ⅱ)辅助鉴定植物的抗条锈病性状。

[0019] 本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物组合中的每条引物独立包装的步骤。

[0020] 以上任一所述抗条锈病植物可为抗条锈病小麦，具体可为小麦品种“中麦175”或小麦材料“CA13152”。以上任一所述植物可为小麦，具体可为小麦品种“中麦175”、小麦品种“京411”、小麦品种“轮选987”、小麦品种“中国春”、小麦品种“Avocet S”、小麦材料“CA12107”、小麦材料“CA13152”、小麦品种“铭贤169”、小麦品种“永刚2号”、小麦品种“周麦26”、小麦品种“济麦22”、小麦品种“济麦23”、小麦品种“扬麦21”、小麦品种“扬麦14”、小麦品种“郑麦366”、小麦材料“92恢94-1-12”、小麦材料“99-19-10”或小麦品种“兰天21”。

[0021] 以上任一所述条锈病具体可为条锈菌小种CYR29引起的条锈病。

[0022] 本发明还保护一种辅助鉴定待测小麦的抗条锈病性状的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，分别采用所述Xwmc382引物对和所述Xgwm636引物对进行PCR扩增；如果采用所述Xwmc382引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中不具有169bp的特异片段且采用所述Xgwm636引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中具有98bp的特异片段，待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；如果采用所述Xwmc382引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中具有169bp的特异片段且采用所述Xgwm636引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中不具有98bp的特异片段，待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦。

[0023] 本发明还保护一种辅助鉴定待测小麦的抗条锈病性状的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述Xwmc382引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中不具有169bp的特异片段，待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；如果PCR扩增产物中具有169bp的特异片段，待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦。

[0024] 本发明还保护一种辅助鉴定待测小麦的抗条锈病性状的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述Xgwm636引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中具有98bp的特异片段，待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；如果PCR扩增产物中不具有98bp的特异片段，待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦。

[0025] 本发明还保护一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法，包括如下步骤：按照以上任一所述方法鉴定待测小麦的抗条锈病性状，筛选具有抗条锈病性状的小麦。

[0026] 采用Xwmc382引物对时的PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min、61℃复性1min、72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。

[0027] 采用Xgwm636引物对时的PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性1min、50℃复性1min、72℃延伸2min，共36个循环；最后72℃延伸10min。

[0028] 以上任一所述方法中，具体可通过6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色检测PCR扩增产物。

[0029] 以上任一所述抗条锈病小麦为侵染型IT＝0-2的小麦。以上任一所述感条锈病小-麦为侵染型IT＝3-4的小麦。以上任一所述具有抗条锈病性状的小麦为侵染型IT＝0-2的小麦。以上任一所述具有感条锈病性状的小麦为侵染型IT＝3--4的小麦。

[0030] 以上任一所述具有抗条锈病性状的小麦具体可为小麦品种“中麦175”或小麦材料“CA13152”。以上任一所述具有感条锈病性状的小麦具体可为小麦品种“京411”、小麦品种“轮选987”、小麦品种“中国春”、小麦品种“Avocet S”、小麦材料“CA12107”、小麦品种“铭贤169”、小麦品种“永刚2号”、小麦品种“周麦26”、小麦品种“济麦22”、小麦品种“济麦23”、小麦品种“扬麦21”、小麦品种“扬麦14”、小麦品种“郑麦366”、小麦材料“92恢94-1-12”、小麦材料“99-19-10”或小麦品种“兰天21”。以上任一所述条锈病具体可为条锈菌小种CYR29引起的条锈病。

[0031] 所述引物组合、所述试剂盒、所述方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围。

[0032] 本发明所提供的引物对和分子标记可用于小麦抗条锈病分子育种和抗条锈病基因的克隆。本发明的专用引物和分子标记将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

附图说明

[0033] 图1为Xwmc382引物对抗感亲本、抗感池和F2群体单株的扩增结果。

[0034] 图2为Xgwm636引物对抗感亲本、抗感池和F2群体单株的扩增结果。

[0035] 图3为5个SSR标记、1个EST标记和2个KASP标记与该抗病基因的遗传连锁图。

具体实施方式

[0036] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中所有用到的小麦材料均来自中国农业科学院国家小麦改良中心。

[0037] 提及条锈菌小种CYR29的文献：小麦条锈菌条中29小种的检测及致病性，李艳芳、原宗英、任海宝，《山西农业科学》1992年第2期。

[0038] 提及小麦品种“中麦175”的文献：小麦新品种中麦175的选育，王德森，陈新民，王秀红，何中虎，张艳，张勇，崔淑兰，张运宏，作物杂志，2007(3)；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

[0039] 提及小麦品种“京411”的文献：利用京411为骨干亲本培育高产小麦新品种，陈新民，何中虎，王德森，庄巧生，张运宏，张艳，张勇，夏先春，作物杂志，2009(4)；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

[0040] 提及小麦品种“轮选987”的文献：小麦新品种轮选987的选育及性状表现，杨丽，王山荭，刘秉华，作物杂志，2003(3)；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

[0041] 小麦品种“中国春”、小麦品种“Avocet S”、小麦材料“CA12107”、小麦材料“CA13152”，均可从中国农业科学院作物科学研究所获得。小麦品种“铭贤169”、小麦品种“永刚2号”，均可从国家作物种质资源库获得。小麦品种“周麦26”可从周口市农业科学院获得。小麦品种“济麦22”、小麦品种“济麦23”，均可从山东省农科院获得。小麦品种“扬麦21”，可从江苏金土地种业有限公司获得。小麦品种“扬麦14”，可从江苏里下河地区农科所获得。小麦品种“郑麦366”，可从河南省农业科学院小麦研究所获得。小麦材料92恢94-1-12”、小麦材料“99-19-10”、小麦品种“兰天21”，均可从兰州商学院小麦研究所获得。

[0042] 侵染型分级标准采用6级标准(即IT＝0、0；、1、2、3或4)，并以+和-表示偏重和偏轻(Bariana和McIntosh 1993)，详见表1。

[0043] 表1 小麦条锈病苗期侵染型分级标准

[0044]浸染型(IT) 症状
0 叶片上不产生任何可见的症状
0； 叶片上产生小型坏死斑，零星分布，不产生夏孢子堆
0；+ 叶片上坏死斑连片，不产生夏孢子堆
1 叶片上产生坏死斑，坏死斑上零星的散生很小的夏孢子堆
2 叶片上产生坏死斑，坏死斑上着生较多的很小的夏孢子堆
3﹣ 夏孢子堆中等大小且较多，孢子堆之间叶片褪绿或坏死
3 叶片连片褪绿，孢子堆大型且数量多
3+ 叶片偶有褪绿，孢子堆大型且数量多
4 叶片不褪绿，上面着生大量夏孢子堆

[0045] 注：0-2级为抗病型(R)，3--4为感病型(S)。

[0046] 检测抗病性的方法如下：将待测小麦种植于9cm×9cm×9cm的塑料钵中，当麦苗长至一心一叶时，采用扫抹法将条锈菌小种CYR29的孢子均匀接种至小麦叶片(接种方法：将附着有新鲜孢子的铭贤169小心的移至待测小麦的上方，然后将其叶片上的孢子均匀的扫抹于每片待测小麦的叶片)，接种后第14天(作为感病对照的铭贤169植株已充分发病，侵染型IT＝4)时记载待测小麦植株的侵染型。

[0047] 实施例1、抗条锈病基因的分子标记Xwmc382和Xgwm636及其专用引物的获得[0048] 用我国条锈菌小种CYR29对小麦材料中麦175(抗病品种)和轮选987(感病品种)及其F1、F2和F3代群体进行苗期抗性鉴定，结果如表2所示。

[0049] 表2 中麦175、轮选987及其后代的抗性遗传分析

[0050]

[0051] 亲本中麦175全部抗病，亲本轮选987全部感病，F1全部抗病，F2群体中抗病型252株，感病型92株，符合3:1的比例(χ2＝0.56，P1df＝0.46)。147个F3家系中，29个家系表现纯合抗病，78个家系表现杂合抗病，40个家系表现纯合感病，F3家系分离比例为纯合抗病:抗感分离:纯合感病符合1:2:1(χ2＝2.19，P2df＝0.33)。以上结果表明，中麦175对CYR29的抗病性由1个显性基因控制，暂命名为YrZM175。

[0052] 从中麦175/轮选987的F2群体中选用20个典型抗病株(IT＝0；)和20个典型感病株(IT＝4)分别组成抗病池和感病池。使用小麦90K芯片对抗病池和感病池检测，发现抗感池间有差异的SNP标记主要集中在2A染色体上。将2A染色体上有差异的SNP标记转化成KASP标记，并利用2A染色体上的SSR标记和EST标记，以中麦175、轮选987、抗病池和感病池的基因组DNA为模板进行PCR检测。对于KASP标记的扩增及检测，均采用英国LGC公司的KASP技术说明书，标记Kasp-2A-3和Kasp-2A-4在亲本和抗感池间具有一致的多态性。对SSR标记和EST标记的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色，位于2AS染色体上的5个SSR标记、Xbarc124、Xwmc407、Xwmc382、Xgwm636、Xwmc388、和1个EST标记BE404841在亲本和抗感池间表现一致的多态性，初步表明这些标记和抗条锈病基因YrZM175连锁。

[0053] 用Xwmc382引物对和Xgwm636引物对对抗感亲本、抗感池和F2群体单株的PCR扩增产物进行检测，结果如图1和图2所示(M为Marker，Pr为中麦175，Ps为轮选987，Br为抗病池，Bs为感病池，R为抗病单株，S为感病单株)。用Xwmc382引物对扩增，出现了2种电泳带型，分别称为带型A1(不具有169bp的特异条带)和带型A2(具有169bp的特异条带)，中麦175、抗病池和抗病单株显示为带型A1，轮选987、感病池和感病单株显示为带型A2。用Xgwm636引物对扩增，出现了2种电泳带型，分别称为带型B1(具有98bp的特异条带)和带型B2(不具有98bp的特异条带)，中麦175、抗病池和抗病单株显示为带型B1，轮选987、感病池和感病单株显示为带型B2。将PCR扩增产物进行测序验证，与电泳结果一致。

[0054] 用8个标记、Xbarc124、Xwmc407、Xwmc382、Xgwm636、Xwmc388、BE404841、Kasp-2A-3、Kasp-2A-4对F2群体分别进行扩增(反应体系和反应条件同上)，采用MapMaker3.0b计算遗传距离，MapDrawV2.1绘制遗传连锁图，如图3所示，8个标记都与抗病基因连锁。进一步对中麦175进行遗传分析发现，中麦175的2AS染色体上携带一个显性抗条锈病基因，暂命名为YrZM175，抗条锈病基因YrZM175介于SSR标记Xwmc382和Xgwm636之间，与两个标记间的距离分别为8.1cM和4.9cM。

[0055] Xwmc382引物对如下：

[0056] 上游引物(序列表的序列1)：5'-CATGAATGGAGGCACTGAAACA-3'；

[0057] 下游引物(序列表的序列2)：5'-CCTTCCGGTCGACGCAAC-3'。

[0058] Xgwm636引物对如下：

[0059] 上游引物(序列表的序列3)：5'-CGGTAGTTTTTAGCAAAGAG-3'；

[0060] 下游引物(序列表的序列4)：5'-CCTTACAGTTCTTGGCAGAA-3’。

[0061] 实施例2、小麦抗条锈病新基因的来源和抗病性鉴定

[0062] 中麦175的系谱为BPM27/京411。

[0063] 分别鉴定京411和中麦175的抗病性，京411为高感(侵染型IT＝4)，中麦175为高抗(侵染型IT＝0；)。

[0064] 分别对各个待测小麦(中麦175、京411或轮选987)进行如下分子鉴定：提取待测小麦叶片的基因组DNA；以基因组DNA为模板，分别采用Xwmc382引物对和Xgwm636引物对进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。

[0065] 京411的带型与轮选987的带型一致(用Xwmc382引物对扩增，显示为带型A2；用Xgwm636引物对扩增，显示为带型B2)。结果表明，中麦175中的抗条锈病新基因YrZM175不是来源于亲本京411，很可能来源于另一亲本BPM27。

[0066] 将PCR扩增产物进行测序验证，与电泳结果一致。

[0067] 实施例3、用Xwmc382引物对和Xgwm636引物对筛选抗条锈病小麦

[0068] 待测小麦品种(材料)为：中麦175、京411、轮选987、中国春、铭贤169、Avocet S、永刚2号、周麦26、济麦22、济麦23、扬麦21、扬麦14、郑麦366、92恢94-1-12、99-19-10、CA12107、CA13152和兰天21。

[0069] 1、提取待测小麦叶片的基因组DNA。

[0070] 2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用Xwmc382引物对和Xgwm636引物对进行PCR扩增。

[0071] PCR反应体系：基因组DNA 1.5μl(50-100ng/μl)，上、下游引物(4μmol·L-1)各1μl，2×Taq PCR Mix(北京汇天东方科技有限公司，Cat：HT201)7.5μl，用无菌超纯水补充至15μl。

[0072] 采用Xwmc382引物对时的PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min、61℃复性1min、72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸10min；10℃保存。

[0073] 采用Xgwm636引物对时的PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性1min、50℃复性1min、72℃延伸2min，共36个循环；最后72℃延伸10min；10℃保存。

[0074] 将PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。

[0075] 采用Xwmc382引物对进行PCR扩增：京411、中国春、铭贤169、Avocet S、永刚2号、周麦26、济麦22、济麦23、扬麦21、扬麦14、郑麦366、92恢94-1-12、99-19-10、CA12107和轮选987的带型一致，显示为A2带型；CA13152、兰天21和中麦175的带型一致，显示为A1带型。

[0076] 采用Xgwm636引物对进行PCR扩增：京411、中国春、铭贤169、Avocet S、永刚2号、周麦26、济麦22、济麦23、扬麦21、扬麦14、郑麦366、92恢94-1-12、99-19-10、CA12107、兰天21和轮选987的带型一致，显示为B2带型；CA13152和中麦175的带型一致，显示为B1带型。

[0077] 将PCR扩增产物进行测序验证，与电泳结果一致。

[0078] 结果表明，使用与YrZM175基因紧密连锁的标记Xwmc382和Xgwm636扩增，仅CA13152与中麦175的带型完全一致，为候选的抗条锈病小麦。

[0079] 分别检测各个待测小麦的抗病性。中麦175、CA13152为抗病型。京411、轮选987、中国春、铭贤169、Avocet S、永刚2号、周麦26、济麦22、济麦23、扬麦21、扬麦14、郑麦366、92恢94-1-12、99-19-10、CA12107和兰天21为感病型。