分泌因子GREM2在制备肥胖疾病筛选试剂中的应用

摘要

本发明涉及一种疾病筛选的试剂的制备，特别涉及分泌因子GREM2在制备肥胖疾病筛选试剂中的应用。本发明首先从正常人和肥胖患者血清检测中发现随着BMI水平上升、胰岛素抵抗指数增加、代谢综合征组分的增加，血清GREM2水平也越高。进一步多元线性回归结果显示，血清GREM2水平与体重指数、腰围呈正相关，校正了一系列混杂因数后，该相关性仍然显著独立存在。体外研究结果显示，GREM2可以明显抑制白色脂肪棕色化过程。所以，脂肪分泌因子GREM2可以作为肥胖的血清学标志物，应用于预测肥胖及其相关慢性并发症，为临床上评估肥胖及代谢综合征风险提供了理论依据。

权利要求

1.分泌因子GREM2作为血清标志物在制备肥胖疾病筛选试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述疾病为肥胖症或肥胖症相关慢性并发症。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述分泌因子GREM2与肥胖症呈显著正相关。

说明书

分泌因子GREM2在制备肥胖疾病筛选试剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种疾病筛选的试剂的制备，特别涉及分泌因子GREM2在制备肥胖疾病筛选试剂中的应用。

背景技术

[0002] 超重和肥胖的广泛流行及其作为多种慢病如2型糖尿病、心血管疾病、肿瘤的危险因素，使得肥胖已经成为首要的公共卫生问题。中国正处于社会经济快速发展时期，肥胖及其相关慢性疾病并发症问题也日益突出。根据上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海市内分泌代谢病研究所与中国疾病预防控制中心慢性非传染性疾病预防治中心合作开展的2010年中国慢病监测暨糖尿病专题调查报告显示，按照中国人群超重(BMI≥24.0kg/m2)及肥胖(BMI≥28.0kg/m2)的标准，中国2010年18岁以上成人的超重患病率为30.6％，肥胖的患病率为12％。因此，我国的肥胖形势也非常严峻，肥胖的防治工作任重道远。

[0003] 大量证据表明，脂肪组织的功能异常可导致肥胖。脂肪组织具有显著的代谢调节作用及细胞可塑性。改变脂肪组织细胞的形态结构为肥胖干预提供了潜在的治疗靶点，而影响脂肪组织结构的因素可能是肥胖的重要原因之一。

[0004] 棕色脂肪通过非震颤的形式产热。部分白色脂肪组织在冷冻刺激或肾上腺素刺激下可以转变为棕色脂肪样组织，高表达解偶联蛋白UCP1，这一过程即白色脂肪棕色化。目前已经发现一系列的因子可以作用于脂肪细胞促进白色脂肪棕色化过程如BMP4、BMP7、BMP8B等。BMP4促进白色脂肪前体细胞棕色化；BMP7明显促进棕色脂肪细胞形成并增加能量消耗；BMP8B增加棕色脂肪组织能量消耗。这些结果表明BMP家族在脂肪细胞分化，尤其是棕色脂肪细胞分化过程中发挥着重要作用。由于其可分泌入血，因此有可能成为理想的生物标志物或干预手段。有意思的是，BMP家族在体内存在天然的拮抗剂，其中同样为分泌因子的拮抗剂GREM2引起了我们的关注。迄今为止，并无研究报道GREM2在代谢中的作用。

[0005] GREM2是一种分泌的糖基化蛋白，属于BMP拮抗剂家族中的CAN(cerberus and dan)亚家族，其C端含有8个胱氨酸环。该家族包含GREM1、GREM2两个成员，其中GREM2在代谢相关组织表达远高于其他组织。GREM2基因位于人1号染色体1q43区段，包含2个外显子，全长4,170bps，编码168个氨基酸。GREM2能够与相应的BMP结合，最终抑制BMP信号通路的激活。既往报道GREM2与骨形成相关，而目前对于GREM2生物学功能所知甚少，尤其在能量代谢方面尚无涉及。GREM2是否与肥胖发生存在关联，是否在米色脂肪组织中发挥作用，其通过拮抗何种BMP发挥作用？最为重要的是，在其他研究中尚无GREM2与能量代谢相关研究，未见任何有关GREM2血清水平检测报道，未能对其临床意义开展相关研究。基于上述原因，需进一步对GREM2的生物学功能和临床意义进行研究。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供分泌因子GREM2在制备肥胖疾病筛选试剂中的应用，尤其是分泌因子GREM2在制备肥胖症筛选试剂中的应用及肥胖症相关慢性并发症筛选试剂中的应用，为临床上评估肥胖及代谢相关并发症风险，并对其进行及时治疗提供了可靠的依据。

[0007] 所述分泌因子GREM2与肥胖症呈显著正相关。

[0008] 本发明首先从正常人和肥胖患者血清检测中发现随着BMI水平上升、胰岛素抵抗指数增加、代谢综合征组分的增加，血清GREM2水平也越高。进一步多元线性回归结果显示，血清GREM2水平与BMI、腰围呈正相关，校正了一系列混杂因数后，该相关性仍然显著独立存在。体外研究结果显示，GREM2可以明显抑制白色脂肪棕色化过程。所以，脂肪分泌因子GREM2可以作为肥胖的血清学标志物，应用于预测肥胖及代谢相关综合征，为临床上评估肥胖及其代谢并发症风险提供了理论依据。

[0009] 有益效果：本发明为研究了分泌因子GREM2与肥胖患者的关系，通过研究表明，分泌因子GREM2可用于预测肥胖及代谢相关综合征，为临床上分泌因子GREM2对肥胖症的筛选提供了理论依据和实验数据。

附图说明

[0010] 图1为正常对照和肥胖患者血清GREM2水平的对比图。

[0011] 图2为血清GREM2水平与肥胖指标显著相关对比图。

[0012] 图3为血清GREM2在内脏脂肪中表达对比图。

[0013] 图4为冷冻模型和给予促进棕色化的药物模型中GREM2的表达变化图。

[0014] 图5为GREM2对于前体脂肪细胞棕色化的抑制对比图。

具体实施方式

[0015] 下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

[0016] 实施例

[0017] 1.肥胖患者血清GREM2水平较正常对照明显升高

[0018] 本研究从2013年6月至2014年8月间在瑞金医院内分泌科肥胖专病门诊接诊肥胖患者中，纳入符合指征并在本院治疗的肥胖患者167例，同时招募正常志愿者147例。肥胖患者纳入标准为：BMI≥30.0kg/m2，年龄在14-34岁之间。排除标准：1)继发性肥胖；2)应用内分泌激素类药物(包括口服避孕药，糖皮质激素)；3)服用降糖药或降低血脂药物；4)妊娠或哺乳期患者；5)严重的肝肾功能异常患者；6)神经或精神疾病患者。

[0019] 另外，我们从上海交通大学医学院在校学生中招募了147例正常志愿者。正常人招募纳入标准为：BMI≤23.0kg/m2，年龄14-34岁之间。排除标准为：1)高血压，心脏病；2)血脂异常，糖调节异常；3)肝肾功能异常；4)有糖尿病、肥胖及心血管疾病家族史。

[0020] 研究方法：

[0021] 1)、问卷调查和体格检查

[0022] 所有问卷调查员进行统一的技术培训，使用统一设计的调查表。调查内容包括：一般情况(性别、年龄、身高、体重、臀围、腰围、颈围、体脂含量、血压、生活习惯、饮食习惯、锻炼情况、是否足月顺产、是否母乳喂养、出生体重、代谢性疾病家族史等，针对女性进一步询问月经及生育情况)，并在后期进行临床检测指标的登记。

[0023] 2)、采用空腹静脉血浆标本检测空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(insulin0)和HbA1c，采用OGTT-2h静脉血浆标本检测餐后血糖(PPG)。使用葡萄糖激酶法经自动生化仪(ADVIA-1650Chemistry System,Erlangen,Germany)检测FPG和PPG，采用电化学发光法(Roche-Diagnostics,Basel,Switzerland)检测insulin，采用高效液相色谱法(Bio-Rad,Hercules,CA)检测HbA1c。

[0024] 表1、正常人和肥胖病人临床资料

[0025]

[0026] 从表1结果表明，与正常对照相比，肥胖患者除了性别年龄外，其它指标BMI、Waist circumference、ALT、AST、TC、FBG和PBG等都明显升高，HDL-c则明显降低。肥胖患者GREM2水平明显高于正常对照(图1A)。

[0027] 进一步按肥胖严重程度将研究对象分为四组：体重正常组(BMI<23.0kg/m2)、轻度肥胖组(BMI<35.0kg/m2)、中度肥胖组(35.0≤BMI<40.0kg/m2)、重度肥胖组(BMI≥40.0kg/m2)，如图1B所示，随着BMI水平上升，血清GREM2水平也越高，GREM2与肥胖严重程度密切相关。另外，HOMA-IR代表胰岛素抵抗程度，我们按HOMA-IR水平四分位，将研究对象分为四组，如图1C所示，胰岛素抵抗指数越高，血清GREM2水平也越高。肥胖的严重后果是导致代谢综合征进而引起心脑血管风险。我们将研究人群按代谢综合征的组分进行分组，如图1D所示，随着代谢综合征组分的增加，血清GREM2也呈现上升趋势。

[0028] 定义：胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)

[0029] 应用稳态模型评估方法，计算方法为HOMA-IR＝空腹胰岛素(μIU/ml)*空腹血糖(mmol/L)/22.5。

[0030] 定义：代谢综合征

[0031] 依据NCEP/ATPIII标准以及调整后的亚洲标准，以下五项满足三项或以上即：1)中心性肥胖：男性腰围≥90cm，女性腰围大于≥80cm；2)高TG血症：空腹TG≥1.69mmol/L；3)低HDL血症：女性空腹HDL＜1.29mmol/L(50mg/dl)，男性空腹HDL<1.04mmol/L(40mg/dl)；4)血糖升高：空腹血糖≥5.6mmol/L或已诊断为2型糖尿病；5)高血压：SBP≥130mmHg或DBP≥85mm Hg，或正在接受降压药物治疗。

[0032] 2.研究人群按照血清GREM2水平分组的基本特征。

[0033] 为进一步研究GREM2与肥胖的相关性，我们根据血清GREM2水平四分位将人群分为四组：Quartile 1组：GREM2<517.32pg/ml；Quartile 2组：517.32pg/ml709.58pg/ml。结果表明随着血清GREM2水平增加，该人群的BMI、腰围逐渐升高。进一步分析不同血清GREM2水平下体脂含量的差异。我们发现，随着血清GREM2水平的增加，体脂含量百分比的平均水平也依次增加，线性趋势检验发现有显著的统计学意义。结果如图2显示，血清GREM2水平越高肥胖指标BMI、Waist circumference、Fat mass也越高。

[0034] 3.血清GREM2水平与BMI、腰围呈正相关。

[0035] 为了探讨血清GREM2水平与肥胖的相关性是否独立于其他影响因素，我们进一步采用多元线性回归分析的方法，对血清GREM2水平与全身性肥胖指标BMI和腹型肥胖指标腰围进行多因素分析。该模型以BMI或腰围为多元回归模型因变量，以对数转换后的血清GREM2水平为自变量。多元线性回归分析显示(表2)，在校正了年龄、性别后，血清GREM2水平与BMI及腰围呈显著正相关。在以上模型的基础上，进一步校正了血肌酐水平、甘油三酯、高密度脂蛋白、高敏C反应蛋白、糖化血红蛋白、收缩压、谷丙转氨酶水平、谷草转氨酶水平、空腹胰岛素水平后，该相关性依然显著独立存在。

[0036] 表2.多元线性回归分析lgGREM2与BMI和腰围之间的关系

[0037]

[0038] Model 1:校正了年龄、性别

[0039] Model 2:校正了年龄、性别、血肌酐水平、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、高敏C反应蛋白、糖化血红蛋白、收缩压、谷丙转氨酶水平、谷草转氨酶水平、空腹胰岛素水平。

[0040] 结果表明，血清GREM2水平与BMI及腰围呈显著正相关，且该相关性独立于一系列已知或潜在的混杂因素。

[0041] 4.GREM2主要表达于成熟的内脏脂肪细胞

[0042] 利用小鼠模型来研究升高的GREM2的来源及与肥胖发生的关系。我们首先检测了Grem2的小鼠组织表达谱，共选取小鼠全身16个组织，包括主要代谢相关组织腹股沟皮下、附睾旁内脏脂肪、肩胛间棕色脂肪、肝脏、肌肉以及重要脏器心、肾、肺等。结果(图3A)表明Grem2在内脏脂肪中表达最高，其次是肝脏，提示GREM2可能在代谢过程中发挥重要作用。脂肪组织包括成熟脂肪细胞和前体脂肪细胞(SVF)，GREM2究竟在那种细胞中表达最高呢？我们进一步分离了正常饮食情况下腹股沟皮下(IWAT)、附睾旁内脏(EWAT)和棕色脂肪(BAT)组织的前体脂肪细胞SVF及对应的成熟脂肪细胞(MA)。

[0043] 如图3B所示，GREM2在内脏脂肪的成熟脂肪细胞中表达最高，且明显高于相应的SVF，皮下脂肪GREM2表达则相对较低。

[0044] 5.小鼠冷冻模型和促进棕色化的药物模型。

[0045] 研究表明BMPs家族在白色脂肪棕色化中发挥重要作用。那么，我们推测作为BMPs的拮抗剂，GREM2也可能在白色脂肪棕色化过程中发挥重要作用。我们建立了两个常用的白色脂肪棕色化模型即冷冻模型和给予促进白色脂肪棕色化药物模型(T3，Rosiglitazone和CL316243)，检测GREM2变化情况。冷冻情况下能量消耗增加，脂肪组织棕色化增强，甲状腺素、罗格列酮、CL316243(β3肾上腺素受体激动剂)，这三种药物都明显促进白色脂肪棕色化促进能量消耗。结果显示(图4A)，小鼠冷冻10天后，血清GREM2水平明显下降。在给予促进白色脂肪棕色化药物后，小鼠皮下、内脏脂肪GREM2表达水平明显下降(图4B，4C)。这些结果提示GREM2可能参与白色脂肪细胞棕色化、参与能量代谢过程。

[0046] 6.GREM2抑制白色脂肪棕色化。

[0047] 为了研究GREM2在白色脂肪棕色化中的参与作用，我们分离小鼠腹股沟皮下脂肪SVF(Inguinal SVF，ISVF)和附睾旁内脏脂肪SVF(epididymal SVF，ESVF)，体外向棕色脂肪诱导分化。检测ISVF诱导不同阶段的脂肪细胞Grem2的变化。如图5A所示，与前体细胞相比，在诱导两天后，GREM2水平急剧下降，随着脂肪细胞的分化成熟，GREM2的表达持续低水平，提示GREM2可能抑制皮下白色脂肪细胞棕色化。

[0048] 研究表明，皮下白色脂肪棕色化的能力远远高于内脏脂肪。为了进一步阐明GREM2对白色脂肪棕色化的影响，我们分别给予ISVF和ESVF不同剂量的GREM2蛋白作用3天，继而向棕色脂肪细胞诱导分化，诱导成熟后检测标志基因表达。结果如图5B、5C所示，GREM2明显抑制棕色脂肪特异性基因UCP1的表达。尤其在皮下脂肪前体细胞中，随着GREM2剂量的增大，对UCP1的抑制作用也更强。GREM2在内脏脂肪前体细胞中也发挥着抑制棕色化的作用，但其抑制作用只在高剂量时明显。

[0049] 之后，我们用慢病毒下调皮下脂肪前体细胞中GREM2基因表达，再用棕脂诱导方案进行诱导分化。如图5D所示，GREM2基因表达下调后，皮下脂肪细胞棕色化能力明显增强。

[0050] 以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。