氟苯尼考现场检测试纸及其制备、使用方法

摘要

本发明具体涉及现场检测试纸及其制备、使用方法，属于免疫学领域。包括：保藏号为CCTCC—C201575杂交瘤细胞FFA-C所分泌的抗氟苯尼考胺、胶体金标记的单克隆抗体C，带有不干胶的载体板，载体板的两端设有加样端吸水层和手持端吸水层，在该载体板中部设有检测层，在该检测层与加样端吸水层交界处设有载有金标单抗C的玻璃纤维层块，玻璃纤维层块的一端设置在加样端吸水层之下，另一端设置在检测层之上，在与玻璃纤维层块延续的检测层上设有检测线和质控线，检测线和质控线处分别包被有抗氟苯尼考胺多克隆抗体和羊抗小鼠IgG。本发明能够现场快速、简便、准确检测氟苯尼考和其代谢产物氟苯尼考胺，可用于现场对氟苯尼考药物残留的粗筛检测。(56)对比文件孙法良等.氟苯尼考人工抗原的合成与鉴定《. 福建农业学报》.2009,第24卷(第1期),Pengjie Luo等.development of anenzyme-linked immunosorbent assay for thedetection of florfenicol in fish feed.《food and agricultural immunology》.2009,第20卷(第1期),

权利要求

1.氟苯尼考现场检测试纸，其特征在于包括：保藏号为CCTCC-C201575杂交瘤细胞FFA-C所分泌的抗氟苯尼考胺、胶体金标记的单克隆抗体C(简称金标单抗C)，抗氟苯尼考胺多克隆抗体和羊抗小鼠IgG，带有不干胶的载体板(3)，在载体板(3)的两端部，分别设有加样端吸水层(1)和手持端吸水层(7)，在该载体板(3)中部设有由硝酸纤维膜制成的检测层(6)，在该检测层(6)与加样端吸水层(1)交界处设有载有金标单抗C的玻璃纤维层块(2)，玻璃纤维层块(2)的一端设置在加样端吸水层(1)之下，另一端设置在检测层(6)之上，在与玻璃纤维层块(2)延续的检测层(6)上设有检测线(4)和质控线(5)，检测线(4)和质控线(5)处分别包被有抗氟苯尼考胺多克隆抗体和羊抗小鼠IgG。

2.根据权利要求1所述的氟苯尼考现场检测试纸，其特征在于所述金标单抗C是由碱水解法制备氟苯尼考胺半抗原与牛血清白蛋白通过戊二醛法偶联合成完全抗原FFA-BSA作为免疫原而制备的抗氟苯尼考胺单克隆抗体，经胶体金标记后而制备。

3.根据权利要求1所述的氟苯尼考现场检测试纸，其特征在于所述抗氟苯尼考胺多克隆抗体是由碱水解法制备氟苯尼考胺半抗原与卵清白蛋白通过戊二醛法偶联合成完全抗原作为免疫原免疫兔子而制备的兔血清。

4.根据权利要求1所述的氟苯尼考现场检测试纸，其特征在于所述金标单抗C的制备方法如下：(1)以公知的胶体金的制备工艺制备胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为10-

20nm；

(2)将单克隆抗体C，按150-500μl加入到上述的100ml胶体金溶液中，慢搅混匀；

(3)向混合溶液中加入PEG20000，使其终浓度为1-5％，静置过夜；

(4)离心8000-10000转/分，1-1.5小时，弃上清；

(5)取离心沉淀，用含有1-5％PEG20000、0.05-0.25％吐温-20、0.02％叠氮化钠的

0.01mol/L磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗C。

5.按照权利要求4所述的氟苯尼考现场检测试纸，其特征在于步骤(1)中所述胶体金溶液的制备方法为按一定的配比将氯金酸与柠檬酸三钠混合并加热制备成胶体金溶液。

6.按照权利要求4所述的氟苯尼考现场检测试纸，其特征在于步骤(2)中单克隆抗体C与胶体金溶液慢搅混匀30-60min。

7.氟苯尼考现场检测试纸的使用方法，其特征在于包括以下步骤：将该试纸的加样端吸水层(1)插入或在其上滴加被检测样品，5-10min在位于检测层(6)下端的检测线(4)和在位于检测层(6)上端的质控线(5)处显示红色，即双红线，表示样品中残有氟苯尼考或是氟苯尼考胺；检测线处无红线，表示样品表示检测不到氟苯尼考、氟苯尼考胺或是两者浓度低于10μg/ml，质控线处显示红色，表示该试纸有效；质控线处不显示红色，表示该试纸无效。

说明书

氟苯尼考现场检测试纸及其制备、使用方法

技术领域

[0001] 本发明涉及抗生素检测技术的改进，具体涉及现场检测试纸条及其制备、使用方法，属于免疫学领域。

背景技术

[0002] 氟苯尼考(Florfenico,FF)中文名称:氟洛芬、氟甲砜霉素，化学名称:d(+)-苏-1-对甲基苯基-2-二氯乙酰氨基-3-氟丙醇，是二十世纪八十年代后期由美国Schering-Plough研制成功的一种兽类专用氯霉素类的广谱抗菌药，是第三代氯霉素类抗生素，该药1990年首次在日本上市，作为新氯霉素的替代品，主要抑制50s亚基的结合从而抑制细菌肽酰基转氨酶的活性，是新型抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及甲砜霉素耐药菌的广谱抗生素，可用于治疗猪、牛、禽及水产养殖动物的细菌性疾病。

[0003] 氯霉素(Chloramphenicol,CAP)作为第一代氯霉素类抗生素，其结构上的-NO2基团与抑制造血功能有关，因此CAP具有脊髓造血功能抑制毒性，可引起可逆性的血细胞减少，引发不可逆再生障碍性贫血的几率为1:30000。FF用-CH3SO2基团取代了-NO2基团，无潜在再生障碍性贫血危险。同时FF对耐氯霉素和甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)的耐药菌株仍有抗菌作用。氟苯尼考作为靶向药物来发挥生物效应，用药剂量小见效快，半衰期延长，血药浓度高，可长时间维持血药，广泛用于动物疾病的预防和控制。2000年我国批准氟苯尼考为国家二类新兽药，在水产养殖上可用于治疗鳗鲡爱德华氏病和赤鳍病。

[0004] 在动物体内FF代谢较快，主要代谢产物为氟苯尼考草氨酸、氟苯尼考胺(Florenicol amine,FFA)、氟苯尼考醇等,但是FFA是大部分可食动物组织中最主要的代谢产物，因此FFA被作为休药期计算的标志残留物。虽然郭桂芳等认为FF注射液无明显的急性毒性和亚慢性毒性，但是有研究表明高剂量的FF可以小鼠胸腺、脾脏的重量降低，国外的研究也表明FF可以抑制小鼠的体液免疫和细胞免疫，这郭桂芳得出的结论相互印证，表明FF具有较强的免疫毒性。FF在养殖业中的大量应用会导其在动物性食品中的残留，为了保障公众健康，我国对动物组织中氟苯尼考的最大残留量做了规定，要求的肌肉残留限量为200μg/Kg、肝脏残留限量为3000μg/Kg、肾脏残留限量为300μg/Kg。

发明内容

[0005] 本发明针对氟苯尼考残留的现状，以及其对人体的危害，设计发明提供一种能够现场快速、简便、准确检测氟苯尼考和其代谢产物氟苯尼考胺的检测试纸及其制备、使用方法。

[0006] 本发明的技术方案实现如下

[0007] 氟苯尼考现场检测试纸，其特殊之处在于包括：保藏号为CCTCC—C201575杂交瘤细胞FFA-C所分泌的抗氟苯尼考胺、胶体金标记的单克隆抗体C(简称：金标单抗C)，抗氟苯尼考胺多克隆抗体(简称：多抗)和羊抗小鼠IgG(简称：羊抗鼠IgG)，带有不干胶的载体板3，在载体板3的两端部，分别设有加样端吸水层1和手持端吸水层7，在该载体板3中部段设有由硝酸纤维膜制成的检测层6，在该检测层6与加样端吸水层1交界处设有载有金标单抗C的玻璃纤维层块2，玻璃纤维层块2的一端设置在加样端吸水层1之下，另一端设置在检测层6之上，在与玻璃纤维层块2延续的检测层6上设有检测线4和质控线5，检测线4和质控线5处分别包被有多抗和羊抗鼠IgG；

[0008] 所述金标单抗C是由碱水解法制备氟苯尼考胺(FFA)半抗原与牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛法偶联合成的氟苯尼考胺-牛血清白蛋白(FFA-BSA)完全抗原，将其作为免疫原而制备的抗氟苯尼考胺单克隆抗体，经胶体金标记后而致；

[0009] 所述抗氟苯尼考胺多克隆抗体：是由碱水解法制备氟苯尼考胺(FFA)半抗原与卵清白蛋白(OVA)通过戊二醛法偶联合成完全抗原(FFA-OVA)作为免疫原免疫兔子而制备的兔血清。

[0010] 所述的胶体金标记的单克隆抗体C的制备步骤如下：

[0011] 1、以公知的胶体金的制备工艺制备胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为10-20nm；

[0012] 2、将单克隆抗体C(0.5-1g/L抗体蛋白)，按150-500μl加入到上述的100ml胶体金溶液中，慢搅混匀；

[0013] 3、向混合溶液中加入PEG20000，使其终浓度为1-5％，静置过夜；

[0014] 4、离心8000-10000转/分，1-1.5小时，弃上清；

[0015] 5、取离心沉淀，用含有1-5％PEG20000、0.05-0.25％吐温-20、0.02％叠氮钠的0.01mol/L磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗C；

[0016] 所述磷酸盐缓冲液的PH值为7.4，其中含有KCI 0.2g、NaCI 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、蒸馏水1000ml；

[0017] 所述步骤2中单克隆抗体C与胶体金溶液慢搅混匀30-60min。

[0018] 氟苯尼考现场检测试纸的使用方法，其特殊之处在于包括以下步骤：

[0019] 将该试纸的加样端吸水层1插入或在其上滴加被检测样品，5-10min在位于检测层6下端的检测线4和在位于检测层6上端的质控线5处显示红色，即双红线，表示样品中残有氟苯尼考或是氟苯尼考胺；检测线处无红线，表示样品表示检测不到氟苯尼考、氟苯尼考胺或是两者浓度低于10ug/ml，质控线处显示红色，表示该试纸有效。

[0020] 本发明的优点在于：本发明以现有技术的实际特点，研制了一种氟苯尼考残留快速现场检测试纸及其制备、使用方法，采用动物血液或是内脏如肝脏加适量的生理盐水碾碎制备成检测样品液，对其进行检测，原理是采用夹心免疫层析原理，即由金标单抗C同检测样品液中的抗原反应,形成由金标单抗C-氟苯尼考或是氟苯尼考胺复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜上预先包被在检测线上的抗氟苯尼考胺多克隆抗体(FFA多抗)处时，此处的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成了金标单抗C+氟苯尼考或是氟苯尼考胺+FFA多抗的夹心结构，最终是单抗C上标记的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反应的金标单抗C则仍继续层析前行,当到达点预先包被在质控线羊抗鼠IgG处时，抗体类型为IgG的金标金标单抗C被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是：检测线显示红色表示有氟苯尼考或是氟苯尼考胺残留，即药残阳性；检测线不显示红色，表示检测不到氟苯尼考、氟苯尼考胺或是两者浓度低于10ug/ml，即药残阴性。质控线显示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是金标抗体C、或是羊抗鼠IgG失活，检测结果无效。本发明的特点是：1、本发明的氟苯尼考现场检测试纸，从实际的养殖需要出发，将药物残留的检测搬到的养殖现场，使用时无需专门设施和操作技术，适合普通养殖户养殖现场检测，应用简单。2、具有检测快速、简便、准确、灵敏等特点，并具有较高的稳定性，在5-10min之内便可显示检测结果，一旦检出超标可以将养殖动物多养一段时间，让药物代谢直至残留低于国家标准，可以安全上市，是最方便的一种解决药残问题的方法，减少了因药物残留对人体的伤害和养殖户因药残超标被退货造成巨大的损失。改善了因药残留送检麻烦，周期长，收费高等原因造成99％以上养殖户在养殖动物上市前是不送检药残留的情况；3、该试纸制备抗氟苯尼考胺多抗时，是以氟苯尼考胺与卵清蛋白偶联的完全抗原免疫家兔制备的多抗，这从根本上避免了与牛血清白蛋白的交叉反应，进一步保证了试纸的特异性(因为单克隆抗体制备中免疫原是有牛血清白蛋白为载体蛋白的)；4、在整个胶体金标记和试纸制备过程中起到防止非特异结合和起到封闭作用的牛血清白蛋白，均以适当浓度的PEG20000所代替，这样进一步杜绝了因牛血清白蛋白而致的交叉反应，保证了试剂盒的特异性。

附图说明

[0021] 图1：本发明氟苯尼考现场检测试纸的结构示意图；

[0022] 图2：本发明氟苯尼考现场检测试纸的检测结果示意图。

[0023] 杂交瘤细胞株FFA－C，其保藏编号为：CCTCC—C201575；保藏单位全称及简称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；保藏日期：2015年5月21日。

具体实施方式

[0024] 实施例1.

[0025] 氟苯尼考胺的合成：按照摩尔比为1:1，称取FF10.74,g氢氧化钠2.56g加入15ml蒸馏水溶解，加热搅拌至完全溶解，此时溶液为酒红色澄清，再加入6.0g氯化钠，搅拌至完全溶解，冷却后用薄层层析板层析混合液，用碘熏蒸显色，测得Rf(原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值)值与FFC不同,证明有FFA生成。将溶液室温放置过夜，用滤纸过滤、蒸馏水洗涤至流出液体为无色、干燥之后的FFA半抗原，合成路线如下所示：

[0026]

[0027] 实施例2.

[0028] 完全抗原的制备：称取25mg氟苯尼考胺溶于2mLDMF中；称量66mg BSA溶解于10mlPH7.4的PBS缓冲液中；将氟苯尼考胺逐滴加入到上述BSA溶液中，4℃条件下搅拌，然后逐滴加入100μL戊二醛于反应液中，缓慢搅拌反应24h。将合成的产物用PBS透析72h,每8h换液一次,得氟苯尼考胺-牛血清白蛋白(FFA-BSA)免疫原，同法制备氟苯尼考胺-卵清白蛋白(FFA-OVA)包被原，合成路线如下所示：

[0029]

[0030] 实施例3.

[0031] 抗氟苯尼考胺的单克隆抗体的制备：本发明的分泌抗氟苯尼考胺的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其制备与选择的方法如下：

[0032] (1)碱水解法制备氟苯尼考胺(FFA)半抗原

[0033] (2)用戊二醛法合成氟苯尼考胺完全抗原，包括免疫原FFA-BSA，包被原FFA-OVA；

[0034] (3)用免疫原FFA-BSA免疫Balb/c小白鼠；

[0035] (4)将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，培养得120株杂交瘤细胞；

[0036] (5)用包被原FFA-OVA包板间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株；

[0037] (6)采用有限稀释法对其中4株阳性杂交瘤细胞进行了克隆；

[0038] (7)通过间接ELISA法筛选出效价最高的抗氟苯尼考胺的单抗2D6-1C4二次克隆的细胞株制备的抗体，制备金标单抗。见表1

[0039] 表1：单克隆抗体筛选结果

[0040]

[0041] 实施例4.

[0042] 本发明的氟苯尼考胺单抗C的特异性鉴定：用抗氟苯尼考胺单克隆抗体与4种不同抗生素进行竞争ELLIA检测，用FFA-OVA包板。阴性对照用PBS包板；阳相对照，用PBS代替用于检测交叉反应的抗生素。检测结果，氟苯尼考胺单克隆抗体既能与氟苯尼考胺反应也能与氟苯尼考反应，两者无差异。而氟苯尼考胺单克隆抗体与同类抗生素甲砜霉素以及其他类如大环内酯类的土霉素，喹诺酮类的盐酸诺氟沙星和磺胺类的新诺明均无交叉反应。说明该抗体特异性强，而且不仅能检测氟苯尼考原药也可检测其体内的代谢产物氟苯尼考胺。见表2

[0043] 表2：抗氟苯尼考胺单克隆抗体特异性实验( n＝6)

[0044]

[0045]

[0046] 注：*.与阳性对照组比较，OD值显著减小，(P＜0.01)

[0047] 实施例5

[0048] 氟苯尼考快速检测试纸条，参见附图1，其包括：保藏号为CCTCC—C201575杂交瘤细胞FFA-C所分泌的抗氟苯尼考胺、胶体金标记的单克隆抗体C(简称：金标单抗C)，抗氟苯尼考胺多克隆抗体(简称：多抗)和羊抗小鼠IgG(简称：羊抗鼠IgG)，带有不干胶的载体板3，在载体板3的两端部，分别设有加样端吸水层1和手持端吸水层7，在该载体板3中部段设有由硝酸纤维膜制成的检测层6，在该检测层6与加样端吸水层1交界处设有载有金标单抗C的玻璃纤维层块2，玻璃纤维层块2的一端设置在加样端吸水层1之下，另一端设置在检测层6之上，在与玻璃纤维层块2延续的检测层6上设有检测线4和质控线5，检测线4和质控线5处分别包被有多抗和羊抗鼠IgG。

[0049] 实施例6

[0050] 胶体金标记的单克隆抗体C的制备步骤如下：

[0051] (1)胶体金的制备：10-20nm胶体金颗粒制备，将浓度为0.01％氯金酸溶液250ml与1％柠檬酸钠6.65ml混合，加热至100摄氏度，制成胶体金溶液，该溶液的pH值：用0.2M碳酸钾调至8.2，备用；

[0052] (2)金标单抗C的制备：

[0053] 抗氟苯尼考胺单抗浓度为1g/L时，100ml胶体金标记的最适单抗量为200μl，按此比例将抗氟苯尼考胺单抗胺加入到胶体金溶液中，慢搅50min，加入5％PEG20000，4℃过夜；然后将其在4℃下，8000r离心60min；取离心沉淀，用含有含5％PEG20000、0.25％吐温20的
0.01mol/L磷酸盐缓冲液(KCL 0.2g,NaCL8.0g,KH2PO40.2g,Na2HPO412H2O 2.9g，蒸馏水
1000ml,pH 7.4)悬起，再加叠氮钠将浓度调至0.02％，即制成金标单抗C。

[0054] 实施例7.

[0055] 抗氟苯尼考胺多抗的制备：以氟苯尼考胺与卵清蛋白偶联的完全抗原(FFA-OVA)为免疫原免疫家兔，用氟苯尼考胺与牛血清白蛋白偶联的完全抗原(FFA-BSA)为包被原，进行免疫酶联吸附试验(ELISA)，测得效价达1:100000时，心脏采血分离血清，4℃保存备用。

[0056] 实施例8.

[0057] 本发明的氟苯尼考现场检测试纸检测层制备方法为：用饱和硫酸铵法纯化免疫的兔血清，经冷冻干燥后，制备成1mg/ml抗氟苯尼考胺多抗，用喷膜机将其喷于硝酸纤维膜上，形成检测线4；同样，将羊抗小鼠IgG，制备成200μg/ml，用喷膜机将其喷于硝酸纤维膜上，形成质控线5。两线相距5mm，质控线5近手持端吸水层，检测线4近加样端吸水层。室温下晾干，再用pH 7.4，含5％PEG20000的0.010.01mol/LPBS 37℃封闭30min，PBS漂洗晾干。

[0058] 实施例9.

[0059] 本发明的氟苯尼考快速检测条检测的最低残留量为10ug/ml。见表3[0060] 表3：氟苯尼考现场检测试纸灵敏的测定

[0061]

[0062] 注：++表示检测线颜色为紫红色，检测结果为强阳性；+表示检测线颜色为红色，检测结果为阳性；—表示检测线为无色，检测结果为阴性。

[0063] 实施例10.

[0064] 本发明的氟苯尼考快速检测试纸条的使用方法，检测步骤如下：首先，从养殖的池中取活鱼一条，取肝脏，按重量/体积(w/v)比1:2加入生理盐水或pH 6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，将肝脏碾碎，制备成检测样品；然后，将试纸的加样端1吸水层浸入试管的检测样品中(液面不得超过吸水纸1的2/3)，5min读结果。

[0065] 阳性结果：检验层6上下呈现两条红色的检测线4和质控线5，表示样品有中残有氟苯尼考或是氟苯尼考胺氟苯尼考；

[0066] 阴性结果：检验层6上端部呈现一条红色质控线5，表示样品表示检测不到氟苯尼考、氟苯尼考胺或是两者浓度低于10ug/ml；

[0067] 检测结果无效：加样5分钟内，检验层6上端质控线5处无红线出现，表示该试纸失效，检测结果无效。(见附图2)。