用于癌症靶向治疗的含有结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶的药物组合物

摘要

本发明提供了一种包含结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白(AAD)的药物组合物以治疗癌症或其他精氨酸依赖性疾病。该AAD融合蛋白可从粗蛋白的可溶性和不溶性级分中纯化出，其结合人血浆白蛋白(HSA)上，并具有用于有效消耗癌细胞中精氨酸的高活性和更长的半衰期。野生型ADI和本发明AAD的比活分别为8.4和9.2U/mg(在生理pH 7.4下)。本发明所使用的AAD可被用于治疗各种癌症(例如胰腺癌、白血病、头颈癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌、前列腺癌、胃癌和脑癌)以及用于治愈精氨酸依赖性疾病。该组合物可以单独使用或与至少一种化疗试剂联合使用以对癌症治疗和/或抑制转移产生协同作用。

权利要求

1.一种结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，包含含有选自白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白的一个或者两个组分的第一部分，该第一部分融合到含有精氨酸脱亚胺酶的第二部分，以形成结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，从而使得结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白保持精氨酸脱亚胺酶活性并且还能够结合血清白蛋白，其中所述白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.46、47、48或49。

2.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中所述两个组分是相同的。

3.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中所述两个组分是不同的。

4.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中该融合包含一个或多个连接子分子。

5.根据权利要求4的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中所述连接子分子包括选自SEQ ID NO.50、51、52、53、或丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸(SGS)氨基酸序列的序列。

6.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，进一步包含Poly-N或His标签中的至少一个。

7.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中该融合包含在第一部分和第二部分之间的内含肽介导的蛋白连接的剩下部分。

8.根据权利要求7的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中内含肽介导的蛋白包括几丁质结合结构域。

9.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中所述精氨酸脱亚胺酶选自由支原体(Mycoplasma)、乳球菌(Lactococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、链球菌(Steptococcus)、埃希氏菌(Escherichia)、分枝杆菌(Mycobacterium)或芽孢杆菌(Bacillus)微生物产生的精氨酸脱亚胺酶。

10.根据权利要求9的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中所述精氨酸脱亚胺酶是由精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、关节炎支原体(Mycoplasma  arthritidis)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或其组合产生的。

11.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其氨基酸序列包括选自SEQ ID NO.36、37、38、39、40、41或43的序列。

12.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中所述融合蛋白如下形成：通过使具有N端半胱氨酸残基的精氨酸脱亚胺酶与白蛋白结合结构域C端的反应性硫代酸酯反应，从而使得精氨酸脱亚胺酶和白蛋白结合结构域经由共价键连接。

13.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中所述融合蛋白如下形成：通过使具有N端半胱氨酸残基的白蛋白结合结构域与精氨酸脱亚胺酶C端的反应性硫代酸酯反应，从而使得精氨酸脱亚胺酶和白蛋白结合结构域经由共价键连接。

14.根据权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其中所述融合蛋白如下形成：通过使用SEQ ID NO.42和43且通过使具有N端半胱氨酸残基的精氨酸脱亚胺酶与白蛋白结合结构域C端的反应性硫代酸酯反应，从而使得精氨酸脱亚胺酶和白蛋白结合结构域经由共价键连接。

15.根据权利要求1-14中任一项的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白在制备用于治疗患者癌症的药物中的用途，其中所述药物被制备来对所述患者施用临床有效剂量的融合蛋白以减少循环精氨酸的可利用度，并且所述癌症是胰腺癌、白血病、头颈癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌、前列腺癌、胃癌或脑癌。

16.根据权利要求1-14中任一项的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白在制备用于治疗患者精氨酸依赖性疾病的药物中的用途，其中所述药物被制备来对患者施用临床有效剂量的融合蛋白以减少循环精氨酸的可利用度。

17.一种制备权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的方法，包括：构建编码所述结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的融合基因，将所述融合基因插入载体，将所述载体插入宿主生物，并表达包括权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的蛋白。

18.根据权利要求17的制备结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的方法，进一步包括纯化所述融合蛋白。

19.根据权利要求18的制备结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的方法，其中所述纯化是通过色谱法进行的。

20.根据权利要求18的制备结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的方法，其中所述纯化是对粗蛋白的可溶性级分进行。

21.根据权利要求18的制备结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的方法，其中所述纯化是对粗蛋白的不溶性级分进行。

22.一种制备权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的方法，所述方法通过在白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白与包含精氨酸脱亚胺酶的第二部分之间的内含肽介导的蛋白连接制备所述结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白。

23.一种药物组合物，包含在药学可接受的载体中的权利要求1的结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白。

24.根据权利要求23的药物组合物，其中所述组合物的pH范围是5.5-9.5。

25.根据权利要求23的药物组合物，其中所述组合物的pH是7.4。

26.根据权利要求23的药物组合物，其中所述组合物的pH是6.5。

说明书

用于癌症靶向治疗的含有结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶的药

物组合物

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2013年3月6日提交的美国临时专利申请系列号61/773,214和2014年3月5日提交的美国非临时专利申请系列号14/197,236的权利，其公开内容以引用方式全文并入于此。

技术领域

[0003] 本发明描述了结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶(AAD)融合蛋白，其已经通过基因修饰形成具有高活性和长体内半衰期的物质。本发明进一步描述了用于制造不同ADD融合蛋白的DNA和蛋白质工程化设计。该AAD融合蛋白能够从粗蛋白的可溶性级分和不溶性级分(包涵体)中分离和纯化。本发明进一步涉及用于人和其他动物中的癌症靶向治疗和治愈精氨酸依赖性疾病的含结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶的药物组合物。

[0004] 发明背景

[0005] 胰脏癌、结肠癌、肝癌、黑素瘤和宫颈癌在全球人口中的发病率正在增加，迫切需要针对这些疾病的有效治疗方法。在许多类癌中，包括白血病、黑素瘤、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、宫颈癌和肝癌，癌细胞因缺乏精氨琥珀酸合成酶(ASS)的表达而成为精氨酸营养缺陷型，这使得这些癌症成为精氨酸消耗疗法极好的靶标。

[0006] 精氨酸是人类以及其他哺乳动物的半必需氨基酸。它能够通过由尿素循环酶——精氨琥珀酸合成酶(ASS)和精氨琥珀酸裂解酶(ASL)——催化的两步反应由瓜氨酸合成。精氨酸能够被精氨酸酶代谢为鸟氨酸，鸟氨酸能够被线粒体中的鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)转换为瓜氨酸。瓜氨酸可被再次利用合成精氨酸。由于精氨琥珀酸合成酶(ASS)和精氨琥珀酸裂解酶(ASL)丰富的催化活性，正常细胞通常不需要提供外源的精氨酸用于生长。相反，许多类癌不能表达ASS因此成为精氨酸营养缺陷型。他们的生长依赖于仅从血液循环中获得的精氨酸。因此，通过使用精氨酸降解酶靶向循环精氨酸是阻止ASS-阴性肿瘤增长的一种可行策略。[Feun et al.,Curr.Pharm.Des.14:1049-1057(2008)；Kuo et al.,Oncotarget.1:246-251(2010)]

[0007] 精氨酸能够被精氨酸酶、精氨酸脱羧酶和精氨酸脱亚胺酶(ADI)降解。其中，精氨酸脱亚胺酶(ADI)似乎对精氨酸有着最高的亲和力(低Km值)。ADI将精氨酸转化为瓜氨酸和尿素循环的代谢产物氨。不幸的是，ADI只存在于原核生物例如支原体(Mycoplasma sp.)中。从原核生物中分离和纯化ADI存在一些问题。从恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)中分离的ADI不能在体内显示出有效，因为其在中性pH下酶活性低。从大肠杆菌(Escherichia coli)中生产的ADI是无酶活性的，随后需要多次变性和复性过程从而增加了随后的生产成本。

[0008] 由于天然ADI是在微生物中发现的，因此它具有抗原性并且会从患者的循环中被迅速清除。ADI的天然形式在注射进入人体循环后具有免疫原性，且半衰期短(大约4小时)并能引起中和抗体[Ensor et al.,Cancer Res.62:5443-5450(2002)；Izzo et al.,J.Clin.Oncol.22:1815-1822(2004)]。这些缺陷可以通过聚乙二醇化修饰来纠正。在各种形式的聚乙二醇修饰ADI中，发现经由琥珀酰亚胺琥珀酸酯与聚乙二醇(分子量20,000)结合的ADI(ADI-PEG 20)是一种有效形式。然而，聚乙二醇化后ADI的活性显著降低了大约50％[Ensor et al.,Cancer Res.62:5443-5450(2002)]。以往制备经聚乙二醇修饰的ADI的尝试产生了非均一性的物质(这是由于PEG在蛋白质表面赖氨酸残基上的随机结合)，在生产过程中也很难对所述非均一性的物质表征和开展质量控制。此外，PEG非常昂贵，这极大地增加了生产成本。将经过聚乙二醇修饰的ADI静脉注射到体内后，观察到游离PEG的泄漏或分离，(没有PEG的)ADI则会引发免疫原性问题。因此，存在对改进的治疗癌症的组合物的需求，特别是具有增强的活性和延长的体内半衰期的改进的癌症治疗组合物。

发明内容

[0009] 在本发明中，结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶(AAD)融合蛋白增加了其活性以及血浆半衰期从而有效地消耗癌细胞中的精氨酸。天然ADI可在微生物中发现，具有抗原性并且在患者的体内循环中被迅速清除。本发明构建了具有一个或两个白蛋白结合蛋白的不同AAD融合蛋白，以保持高活性同时具有更长的体内半衰期(一次注射能消耗精氨酸至少5天)。在本发明中，AAD融合蛋白产品中结合白蛋白的蛋白似乎并不影响融合蛋白的酶比活，却似乎增加了循环半衰期。野生型ADI和本发明中AAD融合蛋白的比活分别是8.4和9.2U/mg(在生理pH 7.4下)。

[0010] 从最广泛意义上，本发明提供了一种结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，其包含含有选自白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白的一个或者两个组分的第一部分，该第一部分融合到含有精氨酸脱亚胺酶的第二部分，以形成结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白，从而使得该结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白保持精氨酸脱亚胺酶的活性，并且还能够结合血清白蛋白。

[0011] 本发明进一步涉及用于人和其他动物中的靶向癌症治疗的包含结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶(AAD)融合蛋白的药物组合物。本发明的第一个方面是构建对癌细胞具有高活性的修饰的AAD融合蛋白。本发明的第二个方面是从粗蛋白的可溶性级分和不溶性级分中以高纯度纯化AAD融合蛋白。本发明的第三个方面是延长AAD融合蛋白的半衰期，因为其能够在循环中很好地结合白蛋白。本发明的第四个方面是提供一种使用本发明的包含AAD的药物组合物治疗癌症的方法，其通过将所述的组合物施用给患有各种肿瘤、癌症或与肿瘤或癌症相关的疾病、或其他精氨酸依赖性疾病的有需要的对象。

[0012] 本发明的AAD融合蛋白还经修饰以避免解离为白蛋白结合蛋白和ADI，从而使得其变得更加稳定和在循环中具有更长的半衰期。在AAD融合产品中，ADI被融合到白蛋白结合结构域/肽/蛋白上以延长融合产品的血浆半衰期和降低融合产品的免疫原性。白蛋白结合结构域(ABD)是一种在血液中结合白蛋白的肽。存在不同的ABD变体，其显示出不同的或提高的人血清白蛋白(HSA)亲和力。可构建不同的ABD变体并可融合到ADI。不同于天然产生的ADI，这种更长半衰期的特性有效帮助在癌细胞、癌干细胞和/或癌祖细胞中消耗精氨酸。

[0013] 含有AAD融合蛋白的药物组合物能够用于静脉(i.v.)注射(对于速效的药物剂量)和肌肉(i.m.)注射(对于相当速效和持久的药物剂量)。本发明中AAD融合蛋白的施用可被用于治疗各种癌症，例如胰腺癌、白血病、头颈癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌和脑癌。本发明涉及AAD融合蛋白，治疗癌症的方法，治疗和/或阻止癌组织转移的方法，以及治愈精氨酸依赖性疾病的方法。

[0014] 本发明的方法还包括使用不同的化疗药和/或放疗与本发明AAD融合蛋白的组合以对癌症治疗产生协同效应。

[0015] 附图简要说明

[0016] 图1以三维结构显示的构建具有一个或两个白蛋白结合结构域/肽/蛋白的不同AAD融合蛋白的设计方式。可将一个或两个白蛋白结合结构域/肽/蛋白融合到ADI以形成AAD融合蛋白。白蛋白结合结构域/肽/蛋白的位置远离ADI活性位点。可将白蛋白结合结构域/肽/蛋白融合到ADI的N端或/和C端。本图中的结构是基于精氨酸支原体的ADI结构(蛋白数据库：1LXY)。(A)天然ADI；(B)具有两个ABD或ABD1的AAD融合蛋白；(C)在N端具有一个ABD或ABD1的AAD融合蛋白；(D)在C端具有一个ABD或ABD1的AAD融合蛋白。

[0017] 图2显示在一些细菌种中的ADI序列比对，所述细菌种包括精氨酸支原体(SEQ ID No.23)、乳酸乳球菌(SEQ ID No.24)、蜡样芽胞杆菌(SEQ ID No.25)和地衣芽孢杆菌(SEQ ID No.26)。

[0018] 图3显示来源于精氨酸支原体的不同AAD融合蛋白(A到E)和来源于蜡样芽胞杆菌的AAD融合蛋白(F)的设计和氨基酸序列。

[0019] 图4显示在两个实施方式(A)和(B)中以下述方案通过使用内含肽(intein)-融合蛋白和表达的蛋白连接(CBD，几丁质结合结构域)产生AAD融合蛋白：(C)C端融合；(D)N端融合；(E)内含肽介导的蛋白连接。

[0020] 图5显示所构建的用于生产AAD融合蛋白的表达载体的质粒图谱。

[0021] 图6显示His-ABD-PolyN-ADI(ADI:精氨酸支原体的ADI)的(A)基因图谱、(B)核苷酸序列(SEQ ID No.44)和(C)氨基酸序列(SEQ ID No.40)。

[0022] 图7显示(A)His-ABD-PolyN-bcADI(bcADI：蜡样芽孢杆菌的ADI)的基因图谱、(B)核苷酸序列(SEQ ID No.45)和(C)氨基酸序列(SEQ ID No.41)。

[0023] 图8显示AAD融合蛋白的表达和纯化：(A)在20℃表达时大约90％的AAD是可溶性的(泳道2和3)，在37℃表达时大约90％的AAD是不溶的(包涵体)(泳道4和5)；(B)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶中的纯化的AAD融合蛋白：泳道1，纯化的AAD融合蛋白(52.8kDa)；泳道2，分子量标记。

[0024] 图9说明在体外组织培养研究中，AAD融合蛋白有效地消耗精氨酸并抑制各种类型人类癌细胞系的生长，包括人黑素瘤细胞系(A375)，人结肠癌细胞系(HCT116)和人胰腺癌细胞系(PancI)。

[0025] 图10显示AAD融合蛋白的白蛋白结合结果：(A)非变性的聚丙烯酰胺凝胶(12％)显示当加入的AAD融合蛋白(氨基酸序列显示在SEQ ID NO:36中；图3A)量增加时，HSA+AAD复合物的量也增加。泳道3至6中人血清白蛋白(HSA)和AAD的摩尔比分别为1:1、1:2、1:5和1:15。泳道1和泳道2分别表示6pmol的HSA和30pmol的AAD；(B)在另一个基于AAD融合蛋白(SEQ ID NO:40，图3E)的实验中，比例为1:8的白蛋白和AAD足以结合所有存在的白蛋白(泳道5)。

[0026] 图11是显示AAD融合蛋白对小鼠血浆精氨酸水平的剂量反应的图表。100μg AAD的剂量足以消耗血浆中的精氨酸至少5天。

[0027] 定义

[0028] 术语“癌干细胞”是指在肿瘤克隆中生物学上不同的细胞，其可以在体内启动和维持肿瘤增长(即癌起始细胞)。

[0029] 发明详述

[0030] 精氨酸是人类和其他哺乳动物的半必需氨基酸。它能够通过由尿素循环酶——精氨琥珀酸合成酶(ASS)和精氨琥珀酸裂解酶(ASL)——催化的两步反应由瓜氨酸合成。精氨酸能够被精氨酸酶代谢为鸟氨酸，鸟氨酸能够被线粒体中的鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)转换为瓜氨酸。瓜氨酸可被再次利用合成精氨酸。由于精氨琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)丰富的催化活性，正常细胞通常不需要提供外源的精氨酸用于生长。相反，许多类癌中不能表达ASS因此成为精氨酸营养缺陷型。他们的生长仅仅依赖于循环中的精氨酸。因此，通过精氨酸降解酶靶向循环的精氨酸是阻止ASS-阴性肿瘤生长的一种可行策略。

[0031] 精氨酸能够被精氨酸脱亚胺酶(ADI)降解。ADI将精氨酸转化为瓜氨酸和尿素循环的代谢产物氨。不幸的是，ADI只存在于原核生物例如支原体属中。存在许多与从原核生物中分离和纯化精氨酸脱亚胺酶相关的问题。从恶臭假单胞菌中分离的ADI因为在中性pH下酶活性低而未能在体内显示有效。从大肠杆菌中生产的ADI是无酶活性的，随后需要多次变性和复性过程从而增加了随后的生产成本。在注射进入人体循环后，天然形式的ADI的血浆半衰期很短(大约4小时)[Ensor et al.,Cancer Res.62:5443-5450(2002)；Izzo et al.,J.Clin.Oncol.22:1815-1822(2004)]。这些缺陷可以通过聚乙二醇化修饰得到部分纠正。在各种形式的聚乙二醇修饰ADI中，发现经由琥珀酰亚胺琥珀酸酯与PEG(分子量20,000)结合的ADI(ADI-PEG 20)是一种有效形式。然而，聚乙二醇化后ADI的活性显著降低(降低了大约50％)[Ensor et al.,Cancer Res.62:5443-5450(2002)；Wang  et al.,Bioconjug.Chem.17:1447-1459(2006)]。同时，琥珀酰亚胺琥珀酸酯PEG连接子容易被水解而从蛋白上分离，在人体短期使用后会产生免疫原性问题。因此，存在对改进的癌症治疗的组合物的需求，特别是具有增强的活性的改进的癌症治疗的组合物。

[0032] 从恶臭假单胞菌中分离的ADI不能在体内显示有效，这是因为其在中性pH下几乎无酶活性，且从实验动物的体内循环中被快速清除。来源于精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)的ADI已经在例如Takaku et al,Int.J.Cancer,51:244-249(1992)和美国专利号5,474,928中描述。然而，与该异源性蛋白的治疗用途相关的一个问题是其抗原性。Takaku et al.,Jpn.J.Cancer Res.,84:1195-1200(1993)中描述了将来源于精氨酸支原体的ADI经由氰脲酰氯连接基团以聚乙二醇(PEG)进行化学修饰。但是，该修饰蛋白在代谢时由于有氰化物从氰脲酰氯连接基团中释放而具有毒性。与此相反，即使对于ADI-PEG20，PEG连接子也容易被水解和从蛋白分离，从而在人体短期使用后产生免疫原性问题。因此，存在对能降解非必需氨基酸和无与现有技术相关的问题的组合物的需求。

[0033] 在许多类型的癌症中，包括黑素瘤、胰腺癌、结肠癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、肾细胞癌和肝癌，癌细胞因其缺乏精氨琥珀酸合成酶(ASS)的表达而成为精氨酸营养缺陷型，从而使得这些癌细胞成为精氨酸消耗疗法极好的靶标。在本发明中，结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶(AAD)融合蛋白具有用于有效消耗癌细胞中精氨酸的高活性和长半衰期。

[0034] ADI单体的大小大约为45kDa，其以二聚体(大约90kDa)形式存在[Das et al.,Structure.12:657-667(2004)]。图1显示了构建AAD融合蛋白的设计。一个或两个具有或不具有连接子的白蛋白结合结构域/肽/蛋白SEQ ID NO：46-49融合到ADI上形成AAD融合蛋白。值得注意的是，对一个或两个特定白蛋白结合结构域/肽/蛋白的选择取决于所靶向的癌组织类型、所产生融合蛋白的期望大小和半衰期、以及是选择结构域还是整个蛋白。进一步，所选择的白蛋白结合物可以是相同或不同的。意思是，可以融合一个蛋白和一个肽、两个蛋白、两个结构域、一个结构域和一个蛋白等等，只要产生的分子保持ADI活性并且还能结合血清白蛋白，且该融合蛋白的一个部分的功能都不会被融合蛋白的另一个部分干扰。白蛋白结合结构域/肽段/蛋白的位置远离活性位点。可将白蛋白结合结构域/肽/蛋白融合到ADI的N端或/和C端。存在有不同的ABD变体，其显示不同的或改进的人血清白蛋白(HSA)亲和力。可以构建不同的ABD变体并将其与ADI融合。一些天然具有ADI的微生物(例如假单胞菌属)因其潜在的致病性和热原性而不能被应用。ADI的来源可以是但不限于不同的微生物，例如支原体(例如精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、人型支原体(Mycoplasma hominis))、乳球菌(Lactococcus)(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))、假单胞菌(Pseudomonas)(例如变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、链球菌(Steptococcus)(例如化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))、埃希氏菌(Escherichia)、分枝杆菌(Mycobacterium)(例如结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis))和芽孢杆菌(Bacillus)(例如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus))。优选从精氨酸支原体、乳酸乳球菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或其任意组合中克隆的ADI。他们以SEQ ID表示的氨基酸序列(SEQ ID No:23-
35)以及图2所示的对一些氨基酸序列的序列比对结果都已在本文和文献[Das et al.,Structure.12:657-667(2004)；Wang et al.,Bioconjug.Chem.17:1447-1459(2006)；Ni et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.90:193-201(2011)]中予以公开。

[0035] 对下列蛋白的设计及其氨基酸序列显示于图3：(A)天然精氨酸支原体ADI蛋白质(SEQ ID NO：23)、(B)来源于精氨酸支原体ADI的不同AAD融合蛋白(SEQ ID NO：36-40)和(C)来源于蜡样芽胞杆菌ADI的AAD融合蛋白(SEQ ID NO:41)。成功构建了不同的AAD融合蛋白。在这些实施方式中，在AAD融合蛋白的白蛋白结合蛋白和ADI中间插入了连接子。

[0036] 另一方面，通过使用内含肽-融合蛋白和表达的蛋白连接也产生了新的AAD融合蛋白(图4)。该新的AAD融合蛋白能够通过以下方式形成：(1)使具有N端半胱氨酸残基的ADI和ABD的C端反应性硫代酸酯反应，或(2)将具有N端半胱氨酸残基的ABD和ADI的C端反应性硫代酸酯反应，从而使得ADI和ABD以共价键相连接。在图4E中，具有N端半胱氨酸残基的ADI与ABD的C端反应性硫代酸酯反应。ABD的C端的硫代酸酯标签以及ADI的N端的α-半胱氨酸是进行蛋白连接所需的。这些片段是由pTWIN1载体(纽英伦生物技术公司New  England Biolabs)按照使用手册生产的。特别地，合成编码ABD-内含肽-CBD融合蛋白的基因，并将其克隆到载体中置于T7启动子控制之下用于在大肠杆菌中表达(图4C)。将产生的ABD-内含肽-CBD融合蛋白结合到柱的几丁质上。ABD-内含肽-CBD的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)显示于图4A中。经硫醇诱导裂解和从柱洗脱后，获得了C端具有反应性硫代酸酯的ABD(图4C)。另一方面，合成编码CBD-内含肽-ADI融合蛋白的基因，并将其克隆到载体中置于T7启动子控制之下用于在大肠杆菌中表达(图4D)。将产生的CBD-内含肽-ADI融合蛋白结合到柱的几丁质上。CBD-内含肽-ADI的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)显示于图4B中。在pH 7和25℃裂解和从柱洗脱后，获得了N端具有α-半胱氨酸的ADI(图4D)。最后，通过如图4所示的蛋白连接反应产生AAD融合蛋白。

[0037] 重要的是，可以以常规方式生产和纯化AAD。例如，AAD融合蛋白在大肠杆菌中成功表达并从可溶级分和不溶级分中成功纯化，这一结果显示于图8。进一步，图8显示了以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的纯化的AAD融合蛋白。该纯化的AAD融合蛋白的大小被确定为52.8kDa。

[0038] 本发明的药物组合物包含对消耗肿瘤细胞中精氨酸具有高活性的AAD融合蛋白，从而用于癌症治疗。发现该纯化的AAD融合蛋白的比活与野生型ADI的比活相似。IC50是半最大抑制浓度，也即其表示对肿瘤细胞系达到50％抑制时所需的AAD融合蛋白浓度。IC50是药物有效性的衡量标准。AAD融合蛋白(氨基酸序列显示于SEQ ID NO:40，图3E)对于不同癌细胞系(人黑素瘤：A375和SK-mel-28；人结肠癌：HCT116；人胰腺癌：PancI；人肝癌：Sk-hep1；人宫颈癌：C-33A)的IC50显示于表1中。AAD融合蛋白对于不同癌细胞系的在体外的有效性显示于图9中，其描述了AAD融合蛋白可以杀死多种类型的癌，包括人黑素瘤、人结肠癌和胰腺癌细胞系。

[0039] 表1

[0040]癌细胞系 AAD的IC50(μg/ml)
A375(人黑素瘤) 0.104
SK-mel-28(人黑素瘤) 1.92
PancI人胰腺癌) 1
Sk-hep1(人肝癌) 10
C-33A(人宫颈癌) 0.063
HCT116(人结肠癌) 1.30

[0041] 对于白蛋白结合方面，我们成功展示了工程化AAD融合蛋白可结合人血清白蛋白(HSA)。图10显示AAD融合蛋白(氨基酸序列显示于SEQ ID NO:40,图3E)容易结合HSA。根据图1采用连接子分子设计的构造，以1:5或1:15的摩尔比形成了HSA-AAD复合物。预期通过形成非共价的HSA-AAD复合物，AAD融合蛋白在血液中的循环半衰期能得以增加。由此成功制成了一种长效形式的AAD融合蛋白。

[0042] 与本发明制备的包含AAD融合蛋白的药物组合物相比，没有商品化产品显示出高的效力。在癌症治疗应用方面，本发明的包含AAD融合蛋白的药物组合物可作为一种消耗肿瘤组织中的精氨酸的抗癌剂。AAD融合蛋白是一种可与其他分子靶标或毒性试剂联合使用的优良候选物。实施例

[0043] 提供下面的实施例是为了描述本发明特定的实施方式，而无意以任何方式限定本发明的范围。

[0044] 下面的一些实施例涉及产生结合白蛋白的精氨酸亚胺酶融合蛋白的方法。可以采用包括克隆和内含肽介导的蛋白连接在内的各种技术手段。此处所使用的术语“克隆”在广义上使用，包括构建编码结合白蛋白的精氨酸亚胺酶融合蛋白的融合基因、将该融合基因插入载体、将载体插入宿主生物并表达包括结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的蛋白。这一技术的多种变形方式可以被实施并且仍然落入本发明所考虑的克隆中。

[0045] 实施例1

[0046] 构建白蛋白结合结构域/肽/蛋白(ABD)的编码基因

[0047] 以两轮PCR构建ABD编码基因。在第一轮中，PCR反应混合物(总体积为25μl)包含以下物质：

[0048] 1x iProof PCR缓冲液(Bio-Rad)

[0049] 50μM dNTP混合物

[0050] 0.5单位iProof DNA聚合酶(Bio-Rad)

[0051] 10nM每种以下的寡核苷酸

[0052] ABD-F1正向引物(SEQ ID NO:01):

[0053] 5’-CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3’[0054] ABD-R2反向引物(SEQ ID NO:02):

[0055] 5’-TAGTCACTTACTCCATATTTGTCAAGTTCTCTGTTAGCTAAGACTTTAGC-3’[0056] ABD-F3正向引物(SEQ ID NO:03):

[0057] 5’-GAACTTGACAAATATGGAGTAAGTGACTATTACAAGAACCTAATCAACAA-3’[0058] ABD-R4反向引物(SEQ ID NO:04):

[0059] 5’-TACACCTTCAACAGTTTTGGCATTGTTGATTAGGTTCTTGTAATAGTCAC-3’[0060] ABD-F5正向引物(SEQ ID NO:05):

[0061] 5’-GCCAAAACTGTTGAAGGTGTAAAAGCACTGATAGATGAAATTTTAGCTGC-3’[0062] ABD-R6反向引物(SEQ ID NO:06):

[0063] 5’-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3’

[0064] 采用以下的PCR程序：

[0065] 98℃30s；20个循环的{98℃10s,50℃20s,72℃20s}。

[0066] 在第二轮PCR中，PCR混合物(总体积为50μl)包含以下物质：

[0067] 1x iProof PCR缓冲液(Bio-Rad)；

[0068] 50μM dNTP混合物；

[0069] 1μl of来自第一轮的PCR产物作为DNA模板；

[0070] 1单位iProof DNA聚合酶(Bio-Rad)；

[0071] 200nM每种以下的寡核苷酸

[0072] ABD-F7正向引物(SEQ ID NO:07):

[0073] 5’-CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3’[0074] ABD-R8反向引物(SEQ ID NO:08):

[0075] 5’-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3’

[0076] 采用以下的PCR程序：

[0077] 98℃30s；35个循环的{98℃10s,60℃20s,72℃20s}；72℃5分钟。

[0078] 获得了包含ABD的DNA序列的PCR产物(169bp)，并以Qiagen DNA凝胶提取试剂盒纯化以用于克隆。

[0079] 实施例2A

[0080] 构建编码AAD融合蛋白的融合基因

[0081] 在第一轮PCR中，PCR混合物(总体积为50μl)包含以下物质：

[0082] 1x iProof PCR缓冲液(Bio-Rad)；

[0083] 50μM dNTP混合物；

[0084] 25ng精氨酸支原体基因组DNA；

[0085] 1单位iProof DNA聚合酶(Bio-Rad)；

[0086] 200nM每种以下的寡核苷酸:

[0087] ADINde-F正向引物(SEQ ID NO:09):

[0088] 5’-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3’

[0089] ADIhis-R反向引物(SEQ ID NO:10):

[0090] 5’-AGCTAAGGAATTCGCATCATGATGGTGATGGTGGTGGCTACCCCACTTAAC-3’[0091] 采用以下PCR程序：

[0092] 98℃1min；35个循环的{98℃10s,50℃20s,72℃40s}；72℃5min。

[0093] 获得了1280bp长度的PCR产物，并用Qiagen DNA凝胶提取试剂盒纯化。然后进行第二轮PCR。PCR混合物(总体积为50μl)包含以下物质：

[0094] 1x iProof PCR缓冲液(Bio-Rad)；

[0095] 50μM dNTP混合物；

[0096] 10ng 1280bp的PCR产物；

[0097] 10ng 169bp的PCR产物；

[0098] 1单位iProof DNA聚合酶(Bio-Rad)；

[0099] 200nM每种以下的寡核苷酸

[0100] ADINde-F正向引物(SEQ ID NO:11):

[0101] 5’-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3’

[0102] ABD-R10反向引物(SEQ ID NO:12):

[0103] 5’-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3’

[0104] 采用以下PCR程序：

[0105] 98℃1min；35个循环的{98℃10s,50℃20s,72℃45s}；72℃5min。

[0106] 获得了1428bp的PCR产物并以Qiagen DNA凝胶提取试剂盒进行纯化。随后用限制性内切酶NdeI和HindIII消化，并连接于以同样的酶预消化的pREST A(Invitrogen)质粒上。连接产物随后被转化入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞中。所构建的融合基因的序列以DNA测序确认。

[0107] 实施例2B

[0108] His-ABD-PolyN-ADI的克隆

[0109] 采用两步重叠PCR法构建His-ABD-PolyN-ADI(SEQ ID NO:40,图3E)，最后一步所获得的PCR片段被插入到pET3a载体的NdeI和BamHI位点之间。His-ABD-PolyN-ADI的基因图谱、核酸序列以及氨基酸序列显示于图6。

[0110] 参与His-ABD-PolyN-ADI构建的引物：

[0111] hisABDNde-F正向引物(SEQ ID NO:13):

[0112] 5’-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3’

[0113] ABDnn-R1反向引物(SEQ ID NO:14):

[0114] 5’-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3’[0115] ABDn-R2反向引物(SEQ ID NO:15):

[0116] 5’-AGAACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3’

[0117] ADln-F正向引物(SEQ ID NO:16):

[0118] 5’-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3’[0119] ADIBam-R反向引物(SEQ ID NO:17):

[0120] 5’-TAGATCAATGGATCCTTACCACTTAACATCTTTACGTGATAAAG-3’

[0121] 在第一轮PCR中，在两个PCR管中配制50μl反应体积，其包含已知浓度的组分。在每个管中，混合dNTP、iProof缓冲液(BIO-RAD)、iProof DNA聚合酶(BIO-RAD)、引物和DNA模板，并以双蒸水补足至50μl。反应中所使用的DNA模板是包含来源于精氨酸支原体ADI基因的pET3a载体，其中在不改变ADI基因的蛋白序列的情况下移除了内部的NdeI位点突变。

[0122] 两个反应管分别包含以下的引物混合物：(A)10pmol hisABDNde-F(SEQ ID NO:13)、0.5pmol ABDnn-R1(SEQ ID NO:14)和10pmol ABDn-R2(SEQ ID NO:15)；以及(B)
10pmol ADIn-F(SEQ ID NO:16)和10pmol ADIBam-R(SEQ ID NO:17)。

[0123] 根据手册的推荐步骤设置PCR反应程序，其中退火和延伸温度(时间)分别为50℃(20s)和72℃(40s)。PCR所产生的两种产物大小分别为237bp和1278bp。提取产物并用作第二轮PCR的模板。

[0124] 在第二轮重叠步骤中，以与第一轮相似的方式制备反应混合物，除了所使用的模板是来源于第一轮PCR反应的1pmol 237bp PCR产物和1pmol 1278bp PCR产物的混合物。将所使用的引物变为10pmol hisABDNde-F(SEQ ID NO:13)和10pmol ADIBam-R(SEQ ID NO:17)。

[0125] 退火和延伸温度(时间)分别为50℃(20s)和72℃(60s)。从反应中获得了1484bp大小的PCR产物。纯化该PCR产物并以NdeI和BamHI消化，然后连接到预消化的pET3a质粒上。连接产物随后转化入大肠杆菌BL21(DE3)以生产重组蛋白。

[0126] 实施例2C

[0127] His-ABD-PolyN-bcADI的克隆

[0128] 采用两步重叠PCR法构建His-ABD-PolyN-bcADI(SEQ ID NO:41,图3F)，将最后步骤所获得的PCR片段插入到pET3a载体的NdeI和BamHI位点之间。His-ABD-PolyN-bcADI的基因图谱、核苷酸序列和氨基酸序列显示于图7中。

[0129] 参与His-ABD-PolyN-bcADI构建的引物：

[0130] hisABDNde-F2正向引物(SEQ ID NO:18):

[0131] 5’-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3’

[0132] bcABDnn-R1反向引物(SEQ ID NO:19):

[0133] 5’-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3’[0134] bcABDn-R2反向引物(SEQ ID NO:20):

[0135] 5’-TTTACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3’

[0136] bcADln-F正向引物(SEQ ID NO:21):

[0137] 5’-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTAAACATCCGATACATGTTACTTCAGA-3’[0138] bcADIBam-R反向引物(SEQ ID NO:22):

[0139] 5’-TAGATCAATGGATCCCTAAATATCTTTACGAACAATTGGCATAC-3’

[0140] 在第一轮PCR中，在两个PCR管中配制50μl反应体积，其包含已知浓度的组分。在每个管中，混合dNTP、iProof缓冲液(BIO-RAD)、iProof DNA聚合酶(BIO-RAD)、引物和DNA模板，并以双蒸水补足至50μl。反应中所使用的DNA模板是包含来源于蜡样芽孢杆菌ADI基因的pET3a载体，其中在不改变ADI基因的蛋白序列的情况下移除了内部的NdeI位点突变。

[0141] 两个反应管分别包含以下的引物混合物：(A)10pmol hisABDNde-F2(SEQ ID NO:18),0.5pmol bcABDnn-R1(SEQ ID NO:19)和10pmol bcABDn-R2(SEQ ID NO:20)；以及(B)
10pmol bcADIn-F(SEQ ID NO:21)和10pmol bcADIBam-R(SEQ ID NO:22)。根据手册的推荐步骤设置PCR反应程序，其中退火和延伸温度(时间)分别为50℃(20s)和72℃(40s)。PCR所产生的两种产物大小分别为237bp和1250bp。提取产物并用作第二轮PCR的模板。

[0142] 在第二轮重叠步骤中，以与第一轮相似的方式制备反应混合物，除了所使用的模板是来源于第一轮PCR反应的1pmol 237bp PCR产物和1pmol 1250bp PCR产物的混合物。将所使用的引物变为10pmol hisABDNde-F2(SEQ ID NO:18)和10pmol bcADIBam-R(SEQ ID NO:22)。

[0143] 退火和延伸温度(时间)分别为50℃(20s)和72℃(60s)。从反应中获得了1512bp大小的PCR产物。纯化PCR产物并以NdeI和BamHI消化，然后连接到预消化的pET3a质粒上。连接产物随后转化入大肠杆菌BL21(DE3)以生产重组蛋白。

[0144] 实施例3

[0145] AAD融合蛋白的表达和纯化

[0146] 为制备种子培养物，将携带有编码AAD融合蛋白的质粒(图5)的大肠杆菌BL21(DE3)菌系在5ml的2xTY培养基在30℃以250rpm培养过夜。将过夜的种子培养物(2.5ml)添加到250ml的2xTY培养基中,并在37℃以250rpm培养2.5h(直至OD600约等于0.6-0.7)。当达到该OD600时，将IPTG添加到培养物中(终浓度为0.2mM)。在20℃再继续生长22个小时，随后离心收集细胞。以25ml 10mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.4)重悬细胞团。超声裂解细胞。离心后收集可溶性部分。然后以镍亲和柱纯化融合蛋白(包含His标签)。表2显示培养温度是影响从表达宿主获得的AAD融合蛋白(氨基酸序列显示于SEQ ID NO:40,图3E)的溶解性的一个重要因素。

[0147] 为分离AAD融合蛋白的可溶性级分，以25ml 10mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.4)重悬细胞团。超声裂解细胞。离心收集可溶性部分。随后以镍亲和柱纯化AAD融合蛋白(包含His标签)。

[0148] 为分离AAD融合蛋白的不溶性级分，以25ml 20mM的Tris-HCl(pH7.4)、1％Triton X-100重悬细胞团。超声裂解细胞。离心收集不溶性部分(包涵体)。通过重悬于10ml 20mM的Tris-HCl(pH 7.4)、6M盐酸胍中将蛋白解折叠，漩涡混匀直至其变为可溶。当将解折叠的蛋白溶液一滴一滴地加入到快速搅拌的100ml 20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.4)中时，蛋白被重折叠。离心移除不可溶的物质。通过添加固体硫酸铵粉末到上清中达到70％饱和度使蛋白被盐析出来。离心收集不可溶部分，并重悬于10ml20mM磷酸钠缓冲液中。随后采用镍亲和柱纯化AAD融合蛋白(含有His标签)。

[0149] 表2

[0150]

[0151] 实施例4

[0152] AAD融合蛋白的酶活性实验和酶动力学

[0153] 为测定野生型ADI和本发明AAD融合蛋白的酶活性，采用了二乙酰一肟(DAM)-氨基硫脲(TSC)检测瓜氨酸。反应如下所示：

[0154]

[0155] 该反应通过将样品加入到颜色试剂(由酸性氯化铁溶液和DAM-TSC溶液混合得到)中。简而言之，将酶与20mM精氨酸、10mM pH7.4的磷酸钠在37℃共孵育5分钟。反应混合物于100℃加热5分钟以产生颜色并在540nm下读数(光程＝1cm)。采用不同浓度的瓜氨酸绘制标准曲线。一个单位的ADI天然酶是在实验条件下于37℃每分钟将1μmol精氨酸转化为1μmol瓜氨酸所需的酶活量。野生型ADI和本发明AAD融合蛋白的比活分别是8.4和9.2U/mg(在pH 
7.4,生理pH下)。还测定了在不同pH范围(pH 5.5-9.5)野生型ADI和AAD融合蛋白的比活，最适pH是6.5。因此，该结果说明AAD融合蛋白能够有效消耗精氨酸，因为与白蛋白结合蛋白的融合并未影响ADI的酶活性。

[0156] 米氏常数Km是达到最大反应速率一半时的底物浓度，其是底物对酶亲和力的反向衡量标准。低Km值说明对底物具有高亲和力，并且其意味着能更快达到最大反应速率。为确定其酶动力学或Km值，在pH 7.4在不同的精氨酸底物浓度(2000μM,1000μM,500μM,250μM,125μM,62.5μM)下测定了野生型ADI和AAD融合蛋白的活性。显示于图3E的AAD融合蛋白(SEQ ID NO:40,ADI蛋白从精氨酸支原体获得)以及显示于图3F的AAD融合蛋白(SEQ ID NO:41,ADI蛋白从蜡样芽孢杆菌获得)所测定的Km值分别为0.0041mM和0.132mM。该结果说明融合到ABD并未影响不同AAD融合蛋白对精氨酸的结合亲和力。

[0157] 实施例5

[0158] 细胞增殖实验和AAD融合蛋白对癌细胞系的体外有效性

[0159] 以DMEM培养基培养人黑素瘤A375和SK-mel-28、人胰腺癌PancI和人宫颈癌C-33A细胞系。以EMEM培养基培养SK-hep 1肝癌细胞系和C-33A宫颈癌细胞系。将100μl培养基中的癌细胞(2-5×103)接种到96孔板的孔中，孵育24小时。将培养基再换为含有不同浓度AAD融合蛋白的培养基。在37℃在95％空气/5％CO2的气体环境下将平板再孵育3天。根据使用手册以MTT实验计算培养物中存活的细胞数。将达到50％细胞生长抑制所需的酶的量定义为IC50。

[0160] 如表1和图9所示，结果显示，在体外组织培养研究中，AAD融合蛋白能有效消耗精氨酸，并抑制多种类型的人癌细胞系的生长。例如对人黑素瘤、人结肠癌、人胰腺癌、人肝癌和人宫颈癌，都具有低IC50值(见表1)，因为这些类型的癌都能被AAD融合蛋白容易地抑制。与预期一致，AAD融合蛋白会抑制所有精氨酸依赖的癌类型(例如ASS阴性癌)。

[0161] 实施例6

[0162] 测定AAD融合蛋白的体内半衰期

[0163] 本实验采用Balb/c小鼠(5-7周)，并且允许他们在实验前适应环境一周。将小鼠((n＝3)分为4组，分别腹腔内注射于100μl PBS中的0、100、500或1000μg的AAD融合蛋白(SEQ ID NO:40,图3E)。在第0h和第1-7天对每只小鼠采血。离心获得血清。将血清去蛋白并以氨基酸分析仪分析精氨酸。

[0164] 如图11所示，AAD融合蛋白(SEQ ID NO:40,图3E)，即使在100μg的最低剂量，也能在第1、3和5天有效消耗血浆中的精氨酸，这说明AAD能在体内有效消耗精氨酸至少5天。在所有处理组中，第6天和第7天的精氨酸水平逐渐回复正常。

[0165] 实施例7

[0166] AAD融合蛋白对癌细胞异种移植物的体内有效性

[0167] 本实验采用balb/c裸鼠(5-7周)，并且允许他们在实验前适应环境一周。向小鼠皮下接种存在于100μl新鲜培养基中的2x106的癌细胞。十天后，将小鼠随机分为对照组和处理组。每周以腹膜内方式，对照组接受100μl PBS，处理组接受100μl AAD融合蛋白。以卡尺测量肿瘤大小并通过公式计算肿瘤体积：(长度x宽度2)/2。在每种处理后5天获取血样以测量血浆中的精氨酸。