植物调控元件和其用途

摘要

本发明提供适用于调节植物中的基因表达的重组DNA分子和构建体，以及其核苷酸序列。本发明还提供包含含有可操作地连接至异源可转录DNA分子的DNA分子的重组DNA分子的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子，以及其使用方法。

权利要求

1.一种包含SEQ ID NO:22的DNA序列的重组DNA分子,其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。

2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述异源可转录多核苷酸分子包含具有农艺学重要性的基因。

3.如权利要求2所述的重组DNA分子，其中所述具有农艺学重要性的基因在植物中赋予除草剂耐性。

4.如权利要求2所述的重组DNA分子，其中所述具有农艺学重要性的基因在植物中赋予害虫抗性。

5.一种转基因植物细胞，其包括包含SEQ ID NO:22的DNA序列的重组DNA分子,其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子，其中所述转基因植物细胞是不可再生的。

6.如权利要求5所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。

7.如权利要求5所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。

8.一种转基因植物部分，其包括包含SEQ ID NO:22的DNA序列的重组DNA分子,其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子，其中所述转基因植物部分是不可再生的。

9.一种产生商品产品的方法，其包括获得根据权利要求8所述的转基因植物部分并且从其中产生所述商品产品。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述商品产品是蛋白质精料、蛋白质分离物、谷粒、淀粉、种子、粗粉、谷粉、生物质或种子油。

11.一种产生转基因植物的方法，其包括：

a)用如权利要求1所述的重组DNA分子转化植物细胞以产生转化植物细胞；并且b)使转基因植物从所述转化植物细胞再生。

说明书

植物调控元件和其用途

[0001] 相关申请的引用

[0002] 本申请要求2013年3月14日提交的美国临时序列号61/785,268的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

[0003] 序列表的并入

[0004] 名称为“MONS332WO.txt”的文件中含有的序列表通过电子方式提交来与本文一起提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表是52.7千字节(在Microsoft 中测量的大小)并且创建于2014年3月11日。
发明领域

[0005] 本发明涉及植物分子生物学、植物遗传工程和适用于调节植物中的基因表达的DNA分子的领域。

背景技术

[0006] 调控元件是通过调节可操作连接可转录DNA分子的转录来调控基因活性的遗传元件。这类元件可包括启动子、前导区、内含子和3′未翻译区域并且适用于植物分子生物学和植物遗传工程领域。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明提供用于包含调控元件的植物和构建体中的新颖调控元件。本发明还提供包含调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。在本文公开的一个实施方案中，调控元件可操作地连接至可转录DNA分子。在某些实施方案中，可转录DNA分子相对于调控序列是异源的。本文还提供制造和使用本文公开的调控元件的方法，包括包含调控元件的构建体，和包含可操作地连接至相对于调控元件异源的可转录DNA分子的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。

[0009] 因此，在一方面，本发明提供包含选自由以下组成的组的DNA序列的重组DNA分子：(a)具有与SEQ ID NO：1-37中任何一个至少约85％序列同一性的DNA序列；(b)包含SEQ ID NO：1-37中任何一个的DNA序列；和(c)SEQ ID NO：1-37中任何一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。“异源可转录DNA分子”是指所述可转录DNA分子相对于其可操作地连接的所述DNA序列为异源的。在具体实施方案中，重组DNA分子包含与SEQ ID NO：1-37中任何一个的DNA序列具有至少90％、至少
91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的DNA序列。在具体实施方案中，异源可转录DNA分子包含具有农艺学重要性的基因，如能够在植物中提供除草剂抗性或害虫抗性的基因。在其他实施方案中，本发明提供包含如本文提供的重组DNA分子的构建体。

[0010] 在另一方面，本文提供转基因植物细胞，其包括包含选自由以下组成的组的DNA序列的重组DNA分子：(a)具有与SEQ ID NO：1-37中任何一个至少约85％序列同一性的DNA序列；(b)包含SEQ ID NO：1-37中任何一个的DNA序列；和(c)SEQ ID NO：1-37中任何一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。在某些实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其他实施方案中，转基因植物细胞是双子叶植物细胞。

[0011] 在仍然另一个方面，本文进一步提供转基因植物或其部分，其包括包含选自由以下组成的组的DNA序列的重组DNA分子：(a)具有与SEQ ID NO：1-37中任何一个至少85％序列同一性的DNA序列；(b)包含SEQ ID NO：1-37中任何一个的DNA序列；和(c)SEQ ID NO：1-37中任何一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。在具体实施方案中，转基因植物是相对于起始转基因植物的任何世代的子代植物并且包含重组DNA分子。本文还提供包含在生长时产生这类转基因植物的重组DNA分子的转基因种子。

[0012] 在另一方面，本发明提供产生商品产品的方法，其包括获得含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分并且从其中产生所述商品产品。在一个实施方案中，商品产品是加工种子、颗粒、植物部分和粗粉。

[0013] 在仍然另一个方面，本发明提供产生包含本发明的重组DNA分子的转基因植物的方法，其包括用本发明的重组DNA分子来转化植物细胞以产生转化植物细胞并且使转基因植物从所述转化植物细胞再生。

附图说明

[0014] 图1：展示本发明的表达盒配置。

[0015] 序列简述

[0016] SEQ ID NO：1-30、38-41、49和56是3′UTR序列。

[0017] SEQ ID NO：31、35、42、47、48、50、51、52、53、54和55是调控表达元件组(EXP)的DNA序列，其包含5′可操作地连接至前导序列的启动子序列，所述前导序列5′可操作地连接至内含子序列；或5′可操作地连接至前导序列的启动子序列。

[0018] SEQ ID NO：32、36和43是启动子序列。

[0019] SEQ ID NO：33和37是前导序列。

[0020] SEQ ID NO：34是内含子序列。

[0021] SEQ ID NO：44是具有可加工内含子的β-葡糖醛酸酶(GUS)的编码序列。

[0022] SEQ ID NO：45和46是荧光素酶编码序列。

[0023] 发明详述

[0024] 本发明提供在植物中具有基因调控活性的DNA分子。这些DNA分子的核苷酸序列提供为SEQ ID NO：1-37。这些DNA分子能够影响植物组织中的可操作地连接可转录DNA分子的表达，并且因此调控转基因植物中的可操作地连接转基因的基因表达。本发明还提供修饰、产生和使用这些分子的方法。本发明还提供包括含有本发明的重组DNA分子的转基因植物细胞、植物、植物部分和种子的组合物，和制备和使用所述组合物的方法。

[0025] 提供以下定义和方法是为了更好地界定本发明以及指导本发明的一般技术人员实践本发明。除非另外指出，否则术语应按照相关技术领域的普通技术人员的常规用法来理解。

[0026] DNA分子

[0027] 如本文使用，术语“DNA”或“DNA分子”是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即，脱氧核苷酸碱基的聚合物。如本文使用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文使用的命名法对应于美国联邦法规§1.822的标题37，并且在WIPO标准ST.25(1998)，附录2，表1和3的表中阐明。

[0028] 如本文使用，“重组DNA分子”是包含在没有人为干预的情况下完全不会自然出现的组合DNA分子的DNA分子。例如，重组DNA分子可为包含相对于彼此异源的至少两个DNA分子的DNA分子，包含与在自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列的DNA分子，或通过遗传转化并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。

[0029] 如本文使用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对DNA序列相同的程度。最优序列比对通过手动地比对两个序列，例如，参考序列和另一个DNA序列，以在具有适当内部核苷酸插入、缺失或间隙的序列比对中最大限度地提高核苷酸匹配的数目来建立。如本文使用，术语“参考序列”是指提供为SEQ ID NO：1-37的DNA序列。

[0030] 如本文使用，术语“％序列同一性”或“％同一性”是同一性分率乘以100。与参考序列最佳比对的DNA序列的“同一性分率”是最优比对中的核苷酸匹配的数目，除以参考序列中的核苷酸的总数，例如，整个参考序列的全长中的核苷酸的总数。因此，本发明的一个实施方案提供包含DNA序列的DNA分子，所述DNA序列在与本文提供为SEQ ID NO：1-37的参考序列最佳比对时，与参考序列具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性或至少约100％同一性。

[0031] 调控元件

[0032] 调控元件如启动子、前导区、增强子、内含子和转录终止区域(或3′UTR)在活细胞中的总体基因表达中起整体作用。如本文使用，术语“调控元件”是指具有基因调控活性的DNA分子。如本文使用，术语“基因调控活性”是指例如通过影响可操作地连接可转录DNA分子的转录和/或翻译来影响可操作地连接可转录DNA分子的表达的能力。因此，在植物中起作用的调控元件，如启动子、前导区、增强子、内含子和3′UTR适用于经由遗传工程来修饰植物表现型。

[0033] 如本文使用，“调控表达元件组”或“EXP”序列可指可操作地连接调控元件，如增强子、启动子、前导区和内含子的群组。因此，调控表达元件组可包含例如5′可操作地连接至前导序列的启动子，所述前导序列进而5′可操作地连接至内含子序列。

[0034] 调控元件可通过其基因表达模式来表征，例如，正性和/或负性效应如组成性、时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达，和其任何组合，以及定量或定性指示。如本文使用，“基因表达模式”是将可操作地连接DNA分子转录至转录RNA分子中的任何模式。转录RNA分子可翻译来产生蛋白质分子或可提供反义或其他调控RNA分子，如双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小分子RNA(miRNA)等。

[0035] 如本文使用，术语“蛋白质表达”是转录RNA分子翻译至蛋白质分子中的任何模式。蛋白质表达可通过其时间、空间、发育或形态性质，以及通过定量或定性指示来表征。

[0036] 启动子适用作调节可操作地连接可转录DNA分子的表达的调控元件。如本文使用，术语“启动子”总体上是指涉及识别和结合RNA聚合酶II和其他蛋白质，如反式作用转录因子，以启始转录的DNA分子。启动子可最初从基因的5′未翻译区域(5′UTR)识别。或者，启动子可为合成产生或操纵的DNA分子。启动子还可为嵌合的。嵌合启动子经由两个或更多个异源DNA分子的融合来产生。适用于实施本发明的启动子包括SEQ ID NO：32和36，包括片段或其变体。在本发明的具体实施方案中，如本文描述的要求保护的DNA分子和其任何变体或衍生物，进一步定义为包含启动子活性，即，能够充当启动子宿主细胞，如在转基因植物中。在更进一步特异性实施方案中，片段可定义为展现其源自的起始启动子分子所具有的启动子活性，或片段可包含“最小启动子”，其提供基础水平转录并且由用于识别和结合RNA聚合酶II复合物以便启始转录的TATA盒或等效DNA序列组成。

[0037] 在一个实施方案中，提供本文公开的启动子序列的片段。启动子片段可包括启动子活性，如上所述，并且可单独或与其他启动子和启动子片段组合使用，如在构建嵌合启动子中，或与其他EXP和EXP片段组合。在具体实施方案中，提供启动子的片段，其包含本文公开的具有启动子活性的DNA分子的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约500、至少约600、至少约700、至少约750、至少约800、至少约900或至少约1000个邻接核苷酸，或更长。从起始启动子分子产生这类片段的方法在本领域中是熟知的。

[0038] 来自表示为SEQ ID NO：32和36的任何启动子的组合物，如内部或5′缺失，例如，可使用本领域中熟知方法来产生以改进或改变表达，包括移除对于表达具有正性或负性效应的元件；复制对于表达具有正性或负性效应的元件；和/或复制或移除对于表达具有组织或细胞特异性效应的元件。从表示为SEQ ID NO：32和36的任何启动子产生的包含其中TATA盒元件或其等效序列和下游序列得以移除的3′缺失的组合物可用于例如制得增强子元件。可产生进一步缺失以移除对于表达具有正性或负性；组织特异性；细胞特异性；或定时特异性(诸如但不限于，昼夜节律)效应的任何元件。表示为SEQ ID NO：32和36的任何启动子和从其中衍生的片段或增强子可用于制得嵌合转录调控元件组合物。

[0039] 根据本发明，启动子或启动子片段可针对已知启动子元件，即，DNA序列特性，如TATA盒和其他已知转录因子结合位点基元的存在来分析。这类已知启动子元件的识别可由本领域技术人员用于设计具有与原始启动子类似表达模式的启动子的变体。

[0040] 如本文使用，术语“前导区”是指从基因的未翻译5′区域(5′UTR)识别的DNA分子并且总体上定义为转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸节段。或者，前导区可为合成产生或操纵DNA元件。前导区可用作调节可操作地连接可转录DNA分子的表达的5′调控元件。前导区分子可与异源启动子或与其原生启动子一起使用。适用于实施本发明的前导区包括SEQ ID NO：33和37或片段或其变体。在具体实施方案中，这类DNA序列可定义为能够在宿主细胞，包括例如转基因植物细胞中充当前导区。在一个实施方案中，这类DNA序列可解码为包含前导区活性。

[0041] 表示为SEQ ID NO：33和37的前导序列可包含调控元件或可采用可对于可操作地连接可转录DNA分子之转录或翻译具有效应的次级结构。表示为SEQ ID NO：33和37的前导序列可根据本发明用于制得影响可操作地连接DNA分子之转录或翻译的嵌合调控元件。

[0042] 如本文使用，术语“内含子”是指DNA分子可从基因识别并且可总体上定义为在翻译之前的信使RNA(mRNA)处理期间剪接的区域。或者，内含子可为合成产生或操纵DNA元件。内含子可含有实现可操作地连接基因的转录的增强子元件。内含子可用作调节可操作地连接可转录DNA分子的表达的调控元件。构建体可包括内含子，并且内含子可或可不相对于可转录DNA分子异源。在本领域中的内含子的实例包括水稻肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子。

[0043] 在植物中，在基因构建体中包含一些内含子导致相对于缺乏内含子的构建体，mRNA和蛋白质积聚增加。此效应被称为基因表达的“内含子介导增强”(IME)。已知刺激植物中的表达的内含子已经在玉米基因(例如，tubA1、Adh1、Sh1和Ubi1)、水稻基因(例如，tpi)和双子叶植物基因如来自矮牵牛花的那些基因(例如，rbcS)、马铃薯(例如，st-ls1)和拟南芥(例如，ubq3和pat1)中识别。已经证明内含子的剪接位点内的缺失或突变减少基因表达，指示剪接可能为IME所需要。然而，双子叶植物中的IME已经通过来自拟南芥的pat1基因的剪接位点内的点突变来证明。相同内含子在一种植物中的多次使用在某些情况下证明为展现缺点。在那些情况下，需要具有基本控制元件之集合来构建适当重组DNA元件。

[0044] 适用于实施本发明的内含子包括SEQ ID NO：34。来自表示为SEQ ID NO：34的内含子的组合物可包含顺式调控元件的内部缺失或复制；且/或包含内含子/外显子剪接接合点的5′和3′DNA序列的改变在可操作地连接至启动子+前导区或嵌合启动子+前导区和编码序列时可用于改进表达或表达特异性。当修饰内含子/外显子界限序列时，避免使用正好在剪接位点(GT)的5’末端之前的核苷酸序列AT或核苷酸A和相应地正好在剪接位点(AG)的3’末端之后的核苷酸G或核苷酸序列TG可有利于消除将信使RNA加工成最终转录物期间所形成的不必要起始密码子的可能性。因此，内含子的5’或3’末端剪接接合位点周围的DNA序列可以此方式来修饰。如本文描述和经由在本领域中已知的方法改变的内含子和内含子变体可如工作实例中所描述来凭经验地测试以确定内含子对于可操作地连接DNA分子的表达的效应。也可产生包含内含子/外显子剪接接合点的5′和3′区域的改变以减少引入在加工和剪接信使RNA之后所得转录物中产生的错误起始和停止密码子的可能性。内含子可如工作实例中所描述凭经验地测试以确定内含子对于转基因的表达的效应。

[0045] 如本文使用，术语“3′转录终止分子”、“3′未翻译区域”或“3′UTR”是指在mRNA分子的3′部分的未翻译区域的转录期间所使用的DNA分子。mRNA分子的3′未翻译区域可通过特异性裂解和也称为聚腺苷酸尾部的3′多聚腺苷酸化来产生。3′UTR可以可操作地连接至和位于可转录DNA分子的下游并且可包括多聚腺苷酸化信号和能够影响转录、mRNA处理或基因表达的其他调控信号。聚腺苷酸尾部被认为在mRNA稳定性和启始翻译中起作用。在本领域中的3′转录终止分子的实例是胭脂碱合成酶3′区域；小麦hsp17 3′区域、豌豆rubisco酶小亚单位3′区域、棉花E6 3′区域和薏苡辛3′UTR。

[0046] 3′UTR通常有利地用于特异性DNA分子的重组表达。微弱3′UTR具有产生通读的潜力，其可影响位于相邻表达盒中的DNA分子的表达。适当控制转录终止可防止通读至位于下游的DNA序列(例如，其他表达盒)并且可进一步允许RNA聚合酶的有效再循环以改进基因表达。有效终止转录(RNA聚合酶II从DNA释放)是重新启始转录的先决条件，从而直接影响总体转录水平。转录终止之后，成熟mRNA从合成位点释放并且模板运输至细胞质。真核mRNA以聚(A)形式在体内积聚，使得难以通过常规方法来检测转录终止位点。然而，通过生物信息学方法来预测功能性和有效3′UTR可能很难，因为允许容易预测有效3′UTR的保守DNA序列很少。

[0047] 从实际观点来看，用于表达盒中的3′UTR通常有利地具有以下特性。3′UTR应能够高效地和有效地终止转基因的转录并且防止转录物通读至任何相邻DNA序列中，所述相邻DNA序列可包含另一个表达盒如在多个表达盒驻留于一个传递DNA(T-DNA)中的情况下，或T-DNA插入其中的相邻染色体DNA。在植物生物技术中，3′UTR经常用于引动从转化植物提取的反向转录RNA的放大反应并且用于：(1)评估一旦整合至植物染色体中的表达盒的转录活性或表达；(2)评估插入植物DNA内的拷贝数；和(3)评估育种之后的所得种子的接合性。3′UTR还用于从转化植物提取的DNA的放大反应中来表征插入盒的完整性。

[0048] 如本文使用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用调控元件，也被称为顺式元件，其赋予总体表达模式的方面，但是通常不足以单独驱动可操作地连接可转录DNA分子的转录。不同于启动子，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA盒或等效DNA序列。启动子或启动子片段可天然地包括影响可操作地连接可转录DNA分子的转录的一个或多个增强子元件。增强子元件还可融合至启动子以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的总体调节的方面。

[0049] 许多启动子增强子元件被认为结合DNA结合蛋白质且/或影响DNA布局，产生选择性允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板或促进选择性开启转录启始位点处的双螺旋的局部构型。增强子元件可起作用来结合调控转录的转录因子。一些增强子元件结合一个以上转录因子，并且转录因子可以不同亲和力与一个以上增强子域相互作用。增强子元件可通过许多技术来识别，包括缺失分析，即，缺失5′末端或启动子内部的一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹的DNA结合蛋白分析，甲基化干扰，电泳迁移率变化测定，通过连接介导聚合酶链反应(PCR)的体内基因组足迹，和其他常规测定；或使用已知顺式元件基元或增强子元件作为目标序列或目标基元以常规DNA序列比较方法如BLAST的DNA序列相似性分析。增强子域的微细结构可通过一个或多个核苷酸的诱变(或取代)或在本领域中已知的其他常规方法来进一步研究。增强子元件可通过化学合成或通过从包含这类元件的调控元件分离来获得，并且其可与额外侧接核苷酸合成，所述侧接核苷酸含有适用限制酶位点以促进子序列操纵。因此，本发明涵盖根据调节可操作地连接可转录DNA分子的表达的本文公开方法的增强子元件的设计、结构和使用。

[0050] 如本文使用，术语“嵌合”是指通过将第一DNA分子融合至第二DNA分子来产生的单一DNA分子，其中第一和第二DNA分子两者通常都不存在于所述配置中，即，彼此融合。因此，嵌合DNA分子是并非通常另外存在于自然界中的新DNA分子。如本文使用，术语“嵌合启动子”是指经由DNA分子的这类操纵来产生的启动子。嵌合启动子可组合两个或更多个DNA片段，例如，将启动子融合至增强子元件。因此，本发明涵盖根据调节可操作地连接可转录DNA分子的表达的本文公开方法的增强子元件的设计、结构和使用。

[0051] 如本文使用，术语“变体”是指与第一DNA分子在组成上类似，但是不相同的第二DNA分子，如调控元件，并且其中第二DNA分子仍然保持第一DNA分子的一般功能性，即，相同或类似表达模式，例如经由更多或更少或等效转录或翻译活动。变体可为缩短或截短型式的第一DNA分子和/或改变型式的第一DNA分子的序列，如具有不同限制酶位点和/或内部缺失、取代和/或插入的DNA分子。“变体”也可涵盖具有包含参考序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入的核苷酸序列的调控元件，其中与相应亲本调控分子相比，衍生调控元件具有更多或更少或等效转录或翻译活性。调控元件“变体”还包括在细菌和植物细胞转化期间或作为结果而发生的突变所产生的变体。在本发明中，提供为SEQ ID NO：1-37的DNA序列可用于产生与原始调控元件的DNA序列在组成上类似，但是不相同的变体，但是仍然保持原始调控元件的一般功能性，即，相同或类似表达模式。鉴于本公开，本发明的这类变体的产生完全本领域的普通技能范围内并且涵盖于本发明范围中。

[0052] 嵌合调控元件可被设计成包含各种组成元件，其可以通过在本领域中已知的各种方法来可操作地连接，如限制酶消化和连接、连接无关的克隆、放大期间的PCR产物的模块化装配，或调控元件的直接化学合成，以及在本领域中已知的其他方法。所得各种嵌合调控元件可包含相同组成元件，或相同组成元件的变体，但是在构成允许组成部分可操作地连接的一个或多个连接DNA序列的一个或多个DNA序列方面有所不同。在本发明中，提供为SEQ ID NO：1-30或31-37的DNA序列可提供调控元件参考序列，其中构成参考序列的组成元件可通过在本领域中已知的方法来连接并且可包括一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入或在细菌和植物细胞转化中自然发生的突变。

[0053] 本文描述的修饰、复制或缺失对于具体可转录DNA分子的所需表达方面的功效可以经验为主地在稳定和瞬时植物测定中测试，如本文中的工作实例中所描述的那些，以便验证结果，所述结果可取决于产生的变化和起始DNA分子中的变化的目标而不同。

[0054] 构建物

[0055] 如本文使用，术语“构建体”意谓来源于任何来源的能够基因组整合或自主复制的任何重组DNA分子如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或线性或圆形DNA或RNA分子，包括其中至少一个DNA分子以功能操作方式连接至另一个DNA分子，即，可操作地连接的DNA分子。如本文使用，术语“载体”意谓可用于转化目的，即，将异源DNA或RNA引入宿主细胞中的任何构建体。构建体通常包括一个或多个表达盒。如本文使用，“表达盒”是指包含可操作地连接至一个或多个调控元件，通常至少启动子和3′UTR的至少一个可转录DNA分子的DNA分子。

[0056] 如本文使用，术语“可操作地连接”是指第一DNA分子连接至第二DNA分子，其中第一和第二DNA分子如此布置以使得第一DNA分子影响第二DNA分子的功能。两个DNA分子可或可不为单一邻接DNA分子的一部分并且可或可不相邻。例如，如果启动子影响DNA分子的转录或表达，所述启动子就是与DNA分子可操作连接的。

[0057] 在一个实施方案中，本发明的构建体可以双重肿瘤诱导(Ti)质粒边界构建体形式来提供，其具有从包含T-DNA的根癌农杆菌分离的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区域，其与由根癌农杆菌细胞提供的传递分子一起允许T-DNA整合至植物细胞的基因组中(参见，例如，美国专利6,603,061)。构建体还可含有在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA节段，例如，大肠杆菌复制起点如ori322，广泛宿主范围复制起点如oriV或oriRi，和可选择标记如Spec/Strp的编码区域，其编码赋予大观霉素或链霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)，或庆大霉素(Gm，Gent)可选择标记基因。对于植物转化，宿主菌株经常为根癌农杆菌ABI、C58或LBA4404；然而，植物转化领域技术人员已知的其他菌株可在本发明中起作用。

[0058] 本领域中已知以使得可转录DNA分子转录成翻译并表达为蛋白质的功能性mRNA分子的方式将构建体组装并引入细胞中的方法。为了实践本发明，制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法为本领域技术人员熟知的。举例来说，适用于在较高植物中表达核酸的典型载体在本领域中是熟知的并且包括来自根癌农杆菌的Ti质粒的载体和pCaMVCN传递控制载体。

[0059] 各种调控元件可包含于构建体中，包括本文提供的那些元件中的任何一个。任何这类调控元件可与其它调控元件组合来提供。这类组合可设计或改良以产生所需调控特征。在一个实施方案中，本发明的构建体包括可操作地连接至可操作地连接至3′UTR的可转录DNA分子的至少一个调控元件。

[0060] 本发明的构建体可包括本文提供或在本领域中已知的任何启动子或前导区。举例来说，本发明的启动子可以可操作地连接至异源非翻译5′前导区如来自热休克蛋白质基因的前导区。或者，本发明的前导区可以可操作地连接至异源启动子如花椰菜花叶病毒35S转录物启动子。

[0061] 表达盒还可包括编码适用于亚细胞靶向输送可操作地连接蛋白质的肽的转运肽编码序列，尤其叶绿体、白色体或其它质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；空泡；或细胞外位置。许多叶绿体定域蛋白质从核基因作为前体来表达并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向输送至叶绿体。这类分离叶绿体蛋白质的实例包括但不限于与小亚单位(SSU)核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合蛋白质I和蛋白质II、硫氧还蛋白F和烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)相关联的那些蛋白质。叶绿体转运肽描述于例如美国专利号7,193,133中。已经证明可通过可操作地连接至编码非叶绿体蛋白质的可转录DNA分子的异源CTP的表达将非叶绿体蛋白质靶向输送至叶绿体。

[0062] 可转录DNA分子

[0063] 如本文使用，术语“可转录DNA分子”是指能够转录至RNA分子中的任何DNA分子，包括但不限于，具有蛋白质编码序列的那些分子和产生具有序列适用于基因抑制的RNA分子的那些分子。类型DNA分子可包括，但是不限于，来自相同植物的DNA分子，来自另一种植物的DNA分子，来自不同生物体的DNA分子，或合成DNA分子，如含有基因的反义信息的DNA分子，或编码人工、合成或另外修饰型式的转基因的DNA分子。并入本发明的构建体中的示例性可转录DNA分子包括，例如，来自除了DNA分子并入其中的物种以外的物种的DNA分子或基因或来源于或存在于相同物种中但是通过遗传工程方法而非经典育种技术来并入受体细胞中的基因。

[0064] “转基因”是指至少相对于其在宿主细胞基因组中的位置对于宿主细胞异源的可转录DNA分子和/或在当前或任何以前世代的细胞中人工并入宿主细胞基因组中的可转录DNA分子。

[0065] 调控元件，如本发明的启动子，可以可操作地连接至相对于调控元件异源的可转录DNA分子。如本文使用，术语“异源”是指两个或更多个DNA分子的组合，在这类组合通常不存在于自然界中时。举例来说，两个DNA分子可来自不同物种和/或两个DNA分子可来自不同基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，调控元件相对于可操作地连接可转录DNA分子为异源的，如果这类组合通常不存在于自然界中，即，可转录DNA分子并非自然地可操作地连接至调控元件而出现。

[0066] 可转录DNA分子总体上可为需要转录物的表达的任何DNA分子。转录物的这类表达可导致所得mRNA分子的翻译，并且由此导致蛋白质表达。或者，例如，可转录DNA分子可被设计成最终导致特异性基因或蛋白质的表达减少。在一个实施方案中，此可使用在反义方向上定向的可转录DNA分子来完成。本领域普通技术人员熟悉使用这类反义技术。任何基因可以此方式负性调控，并且在一个实施方案中，可转录DNA分子可被设计成经由dsRNA、siRNA或miRNA分子的表达来抑制特定基因。

[0067] 因此，本发明的一个实施方案是重组DNA分子，其包含本发明的调控元件，如提供为SEQ ID NO：1-37的那些调控元件，所述调控元件可操作地连接至异源可转录DNA分子以便在构建体整合于转基因植物细胞的基因组中时以所需水平或所需模式调节可转录DNA分子的转录的。在一个实施方案中，可转录DNA分子包含基因的蛋白质编码区域并且在另一个实施方案中可转录DNA分子包含反义区域基因。

[0068] 具有农艺学重要性的基因

[0069] 可转录DNA分子可为具有农艺学重要性的基因。如本文使用，术语“具有农艺学重要性的基因”是指在表达于具体植物组织、细胞或细胞类型中，赋予所需特性的可转录DNA分子。具有农艺学重要性的基因的产物可在植物中起作用以便导致对于植物形态学、生理学、生长、发育、产量、颗粒组成、营养概况、疾病或害虫抗性，和/或环境或化学耐受性的效应或可在以植物为食的害虫的饮食中充当杀虫剂。在本发明的一个实施例中，本发明的调控元件并入构建体以使得调控元件可操作地连接至作为具有农艺学重要性的基因的可转录DNA分子中。在含有这类构建体的转基因植物中，具有农艺学重要性的基因的表达可赋予有利农艺学性状。有利农艺学性状可包括，例如但是不限于，除草剂耐性、昆虫防治、改良产量、抗病性、病原体抗性、改良植物生长和发育、变性淀粉含量、改良含油量、改良脂肪酸含量、改良蛋白质含量、改良果实成熟、增强动物和人营养、生物聚合物产生、环境压力抗性、药物肽、改进加工质量、改进风味、杂种种子繁育效用、改进纤维产生，和所需生物燃料产生。

[0070] 在本领域中已知的具有农艺学重要性的基因的实例包括针对如下性状的那些基因：除草剂抗性(美国专利号6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；和5,463,175)，增加产量(美国专利号USRE38,446；6,716,
474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,
222,098；和5,716,837)，昆虫防治(美国专利号6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,
046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,
537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,
016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,
093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658，5,880,
275；5,763,245；和5,763,241)，真菌病抗性(美国专利号6,653,280；6,573,361；6,506,
962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；和6,506,962)，病毒抗性(美国专利号6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023；和5,304,
730)，线虫抗性(美国专利号6,228,992)，细菌病抗性(美国专利号5,516,671)，植物生长和发育(美国专利号6,723,897和6,518,488)，淀粉产生(美国专利号6,538,181；6,538,179；
6,538,178；5,750,876；6,476,295)，改良油产生(美国专利号6,444,876；6,426,447；和6,
380,462)，较高油产生(美国专利号6,495,739；5,608,149；6,483,008；和6,476,295)，改良脂肪酸含量(美国专利号6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,
538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；和6,459,018)，较高蛋白质产生(美国专利号6,
380,466)，果实成熟(美国专利号5,512,466)，增强动物和人营养(美国专利号6,723,837；
6,653,530；6,5412,59；5,985,605；和6,171,640)，生物聚合物(美国专利号USRE37,543；6,
228,623；和5,958,745，和6,946,588)，环境压力抗性(美国专利号6,072,103)，药物肽和分泌肽(美国专利号6,812,379；6,774,283；6,140,075；和6,080,560)，改进加工性状(美国专利号6,476,295)，改进消化性(美国专利号6,531,648)低棉子糖(美国专利号6,166,292)，工业酶产生(美国专利号5,543,576)，改进风味(美国专利号6,011,199)，固氮(美国专利号
5,229,114)，杂种种子繁育(美国专利号5,689,041)，纤维产生(美国专利号6,576,818；6,
271,443；5,981,834；和5,869,720)和生物燃料产生(美国专利号5,998,700)。

[0071] 或者，具有农艺学重要性的基因可通过编码导致内源性基因的基因表达的靶向调节的RNA分子来影响上述植物特性或表现型，例如通过反义(参见，例如，美国专利5,107,065)；抑制性RNA(“RNAi”，包括通过miRNA-、siRNA-、反式作用siRNA-和分阶段sRNA-介导机制对于基因表达的调节，例如在公开申请U.S.2006/0200878和U.S.2008/0066206，和美国专利申请11/974,469中所描述)；或共抑制介导机制。RNA也可为工程化以使所需内源性mRNA产物裂解的催化RNA分子(例如，核酶或核糖开关；参见，例如，U.S.2006/0200878)。本领域中已知以使得可转录DNA分子转录至能够导致基因抑制的分子中的方式将构建体构建并引入细胞中的方法。

[0072] 选择性标记

[0073] 选择性标记转基因还可与本发明的调控元件一起使用。如本文使用，术语“可选择标记转基因”是指其在转基因植物、组织或细胞中的表达，或其缺乏，可加以筛选或以某种方式计录的任何可转录DNA分子。用于本发明实践的可选择标记基因，和其相关联选择和筛选技术在本领域中为已知的并且包括但不限于，编码β-葡糖醛酸酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、赋予抗生素抗性的蛋白质，和赋予除草剂耐性的蛋白质的可转录DNA分子。

[0074] 细胞转化

[0075] 本发明还针对产生包含可操作地连接至可转录DNA分子的一个或多个调控元件的转化细胞和植物的方法。

[0076] 术语“转化”是指将DNA分子引入受体宿主中。如本文使用，术语“宿主”是指细菌、真菌或植物，包括细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或子代。特别受到关注的植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、秧苗、胚胎和花粉。

[0077] 本文中使用的术语“转化”是指已经向其中引入外部多核苷酸分子(如构建体)的细胞、组织、器官或有机体。优选地，引入的多核苷酸分子被整合到受体细胞、组织、器官或有机体的基因组DNA中，以使引入的多核苷酸分子被随后的子代继承。“转基因”或“转化”细胞或有机体也包括细胞或有机体的子代以及由杂交中使用这种转基因植物作为亲代并且表现由外部多核苷酸分子的存在引起的改变表现型的育种计划中产生的子代。所引入DNA分子还可瞬时引入受体细胞中以使得所引入DNA分子不由后续子代承袭。术语“转基因”是指含有一个或多个异源DNA分子的细菌、真菌或植物。

[0078] 存在本领域技术人员熟知的将DNA分子引入植物细胞中的许多方法。此过程总体上包括选择合适宿主细胞、将宿主细胞用载体转化，并且获得转化宿主细胞的步骤。在本发明的实践中通过将构建体引入植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可包括任何熟知和证明方法。合适方法尤其包括但不限于细菌感染(例如农杆菌)、二元BAC载体、直接递送DNA(例如通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA吸收、电穿孔、使用碳化硅纤维来搅拌，和DNA涂布粒子的加速)。

[0079] 宿主细胞可为任何细胞或生物体，如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞。在具体实施方案中，宿主细胞和转化细胞可包括来自作物植物的细胞。

[0080] 转基因植物随后可从细胞本发明的转基因植物再生。使用常规育种技术或自花受粉，可从这个转基因植物产生种子。这类种子，和从这类种子生长的所得子代植物含有本发明的重组DNA分子，因此为转基因的。

[0081] 本发明的转基因植物可自花受粉以提供本发明的纯合转基因植物(对于重组DNA分子为纯合的)的种子或与非转基因植物或不同转基因植物杂交以提供本发明的杂合转基因植物(对于重组DNA分子为杂合的)的种子。这类纯合和杂合转基因植物在本文中称为“子代植物”。子代植物是起源于原始转基因植物并且含有本发明的重组DNA分子的转基因植物。使用本发明的转基因植物产生的种子可收获并且用于生长几个世代的本发明转基因植物，即，子代植物，其包含本发明的构建体并且表达具有农艺学重要性的基因。通常用于不同作物的育种方法的描述可发现于多个参考书籍中的一个，参见，例如，Allard，Principles of Plant Breeding，John Wiley&Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98(1960)；Simmonds，Principles of Crop Improvement，Longman，Inc.，NY，369-399(1979)；Sneep和Hendriksen，Plant breeding Perspectives，Wageningen(编)，Center for Agricultural Publishing and Documentation(1979)；Fehr，Soybeans：Improvement，Production and Uses，第2版，Monograph，16：249(1987)；Fehr，Principles of Variety Development，Theory and Technique，(第1卷)和Crop Species Soybean(第2卷)，Iowa State Univ.，Macmillan Pub.Co.，NY，360-376(1987)。

[0082] 转化植物可针对所关注的一个或多个基因的存在和由本发明的调控元件赋予的表达水平和/或概况来分析。本领域技术人员知道可用于分析转化植物的许多方法。举例来说，植物分析方法包括但不限于DNA印迹或RNA印迹、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、现场评估和免疫诊断测定。可转录DNA分子的表达可使用如制造商所描述的(Applied Biosystems，Foster City，CA)试剂和方法来测量并且PCR循环时间使用 Testing Matrix来确定。或者，如制造商所描述的 (Third Wave 
Technologies，Madison，WI)试剂和方法可用于评估转基因表达。

[0083] 本发明还提供本发明的植物的部分。植物部分包括但不限于叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明的植物部分可为能存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。本发明还包括并且提供包含本发明的DNA分子的转化植物细胞。本发明的转化或转基因植物细胞包含可再生和/或不可再生植物细胞。

[0084] 本发明还提供从含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分产生的商品产品。本发明的商品产品含有包含选自由SEQ ID NO：1-37组成的组的DNA序列的可检测量的DNA。如本文使用，“商品产品”是指包含来源于含有本发明的重组DNA分子的转基因、种子、植物细胞或植物部分的材料的任何组合物或产物。商品产品包括但不限于加工种子、谷粒、植物部分和粗粉。本发明的商品产品含有可检测量的对应于本发明的重组DNA分子的DNA。检测样品中的此DNA中的一种或多种可用于确定商品产品的内含物或来源。可使用检测DNA分子的任何标准方法，包括本文公开的检测方法。

[0085] 本发明可经由参考以下实施例来更容易理解，所述实施例提供用于说明，并且不意欲限制本发明，除非指定。本领域技术人员应当了解在下面的实施例中公开的技术代表本发明者发现的在实践中起较好作用的技术。但是，鉴于本公开，本领域技术人员了解到可以在公开的具体实施方案中进行许多变化，并且仍然获得同样或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围，因此，附图中提出或示出的所有事项应理解为例示性的，而不具有限制意义。

具体实施方式

[0086] 实施例1

[0087] 识别和克隆调控元件

[0088] 调控表达元件组(EXP)和转录终止区域(3′UTR)从双子叶物种蒺藜状苜蓿(Barrel Medic)的基因组DNA识别并克隆。选择蒺藜状苜蓿3’UTR部分地基于在同源大豆基因中所观察到的表达模式。

[0089] 识别和克隆蒺藜状苜蓿3′UTR开始于基于在大豆组织调查和专有转录物分析实验中的大豆基因表达模式来选择所关注的大豆基因。然后，选定大豆基因用于使用可公开获得DNA序列来发现蒺藜状苜蓿中的同源基因。随后，来自蒺藜状苜蓿的组织样品从在不同环境条件下生长的植物分离。然后，信使RNA(mRNA)从苜蓿组织分离并且在实时聚合酶链反应(PCR)实验中用于确定苜蓿基因的表达模式。从这些实验，选择蒺藜状苜蓿基因组的子集用于克隆和表征。

[0090] 使用公开的蒺藜状苜蓿序列数据，执行生物信息学分析来识别选定苜蓿基因座内的调控元件。举例来说，执行生物信息学分析以识别包含mRNA的多聚腺苷酸化和终止区域的3′UTR序列和进一步延伸至所识别基因座位的末端的序列。然后，将扩增引物设计并用于扩增所识别调控元件DNA片段中的每一个，如3′UTR DNA片段，包含启动子、前导区和内含子的DNA片段，和包含启动子和前导区的DNA片段。所得DNA片段连接至基础植物表达载体中并且测序。

[0091] 对于可适用DNA片段，然后使用转化植物原生质体来执行调控元件转录起始位点(TSS)和内含子/外显子剪接接合点的分析。在此分析中，原生质体用包含可操作地连接异源可转录DNA分子的克隆DNA片段的植物表达载体来转化。随后，5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，版本2.0(Invitrogen，Carlsbad，California92008)用于通过分析所产生mRNA转录物的DNA序列来证实调控元件TSS和内含子/外显子剪接接合点。

[0092] 所识别的3′UTR的DNA序列在本文中提供为SEQ ID NO：1-30。另外，所识别的启动子DNA序列在本文中提供为SEQ ID NO：32和36；所识别的前导区DNA序列在本文中提供为SEQ ID NO：33和37；并且所识别的内含子DNA序列提供为SEQ ID NO：34。此外，所识别EXP的DNA序列在本文中提供为SEQ ID NO：31和35。调控表达元件组EXP-Mt.Ubq2：1：2(SEQ ID NO：31)包含启动子元件，P-Mt.Ubq2-1：1：1(SEQ ID NO：32)，所述启动子元件5′可操作地连接至前导区元件，L-Mt.Ubq2-1：1：1(SEQ ID NO：33)，所述5′可操作地连接至内含子元件，I-Mt.Ubq2-1：1：2(SEQ ID NO：34)并且调控表达元件组EXP-Mt.AC145767v28：1：1(SEQ ID NO：35)包含启动子元件，P-Mt.AC145767v28-1：2：1(SEQ ID NO：36)，所述启动子元件5′可操作地连接至前导区元件，L-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：37)。从蒺藜状苜蓿识别并克隆的DNA序列中的每一个在表1列出。

[0093] 表1 从蒺藜状苜蓿克隆的3′UTR、调控表达元件组、启动子、前导区和内含子。

[0094]

[0095]

[0096] 实施例2

[0097] 分析3′UTR对于大豆叶原生质体中的组成性GUS表达的效果

[0098] 大豆叶原生质体用载体，尤其质粒构建体转化，以评估选定蒺藜状苜蓿3′UTR对于表达的效应。大豆叶原生质体用含有驱动可操作地连接至苜蓿3′UTR的β-葡糖醛酸酶(GUS)转基因的表达的组成性EXP序列的DNA载体转化。这些苜蓿3′UTR转化大豆叶原生质体与大豆叶原生质体比较，其中GUS转基因的表达由组成性启动子驱动，并且GUS转基因可操作地连接至来自陆地棉或海岛棉的3′UTR。

[0099] 用于这些实验中的植物载体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体包含来自根癌农杆菌的左边界区域；选择赋予除草剂草甘磷或抗生素大观霉素的抗性(均由拟南芥肌纤蛋白7启动子驱动)的转化植物细胞的第一转基因表达盒；用于评估3′UTR的活性的第二转基因表达盒，所述3′UTR包含5′可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的GUS的DNA序列的EXP或启动子序列，所述可加工内含子5′可操作地连接至来自蒺藜状苜蓿、陆地棉，或海岛棉的3′UTR；和来自根癌农杆菌的右边界区域。包含来自苜蓿的3′UTR(即，pMON109593、pMON116803、pMON116812、pMON116813、pMON116815、pMON116826、pMON116827、pMON116830、pMON122852、pMON122853、pMON122854、pMON122855、pMON122856、pMON122857、pMON122858、pMON122859、pMON122862、pMON122864、pMON122865、pMON122866、pMON122867和pMON122868)的载体使用组成性调控表达元件组EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ  ID NO：42)来驱动GUS。包含来自陆地棉或海岛棉的3’UTR(即，pMON81345，pMON81347，和pMON83002)的载体使用组成性启动子P-CaMV.35S-enh-1：1：11(SEQ ID NO：43)来驱动GUS。

[0100] 表2提供具有用于在此实施例中呈现的实验中转化大豆原生质体的相应3′UTR和SEQ ID NO的质粒构建体。

[0101] 表2.用于转化大豆叶原生质体的质粒构建体和3′UTR描述。

[0102]

[0103]

[0104] 用于共转化和数据标准化的两种质粒构建体，尤其质粒构建体也使用在本领域中已知的方法来构建。这些质粒构建体中的每一个包含由组成性EXP驱动的特异性荧光素酶编码序列。植物载体pMON19437包含具有组成性EXP的表达盒，所述组成性EXP包含5′可操作地连接至前导序列的启动子，所述前导序列5’可操作地连接至内含子(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1，SEQ ID NO：47)，所述内含子5′可操作地连接至萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶编码序列(LUCIFERASE：1：3，SEQ ID NO：45)，所述编码序列5′可操作地连接至来自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的3′UTR(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：49)。植物载体pMON63934包含具有组成性EXP序列的表达盒，所述EXP序列包含5′可操作地连接至前导序列(EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1，SEQ ID NO：48)的启动子，所述前导序列5′可操作地连接至海肾(Renilla reniformis)荧光素酶编码序列(CR-Ren.hRenilla Lucife-0：0：1，SEQ ID NO：46)，所述编码序列5′可操作地连接至来自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：49)的3′UTR。

[0105] 大豆叶原生质体使用本领域中熟知的基于基于聚乙二醇(PEG)的转化方法来转化。每个原生质体细胞用pMON19437质粒构建体、pMON63934质粒构建体，和呈现于表2中的质粒构建体之一来转化。在转化之后，转化大豆叶原生质体在全黑暗中孵育过夜。随后，GUS和荧光素酶的测量通过将转化细胞的裂解制备物的等分试样放置于两个不同小孔托盘中来进行。一个托盘用于GUS测量并且第二个托盘用于使用双重荧光素酶报道基因测定系统(Promega Corp.，Madison，WI；参见例如Promega Notes Magazine，第57期，1996，第02页)来执行双重荧光素酶测定。

[0106] 对于表2中呈现的每个质粒构建体执行一个或两个转化。从来自每个转化的多个样品确定每个3′UTR的平均表达值。样品测量使用每个质粒构建体转化的四次重复，或替代地，对于两个转化实验中的每一个以每个质粒构建体的三次重复来进行。平均GUS和荧光素酶表达水平提供于表3中。在此表中，萤火虫荧光素酶值(例如，来自pMON19437的表达)提供于标记为“FLuc”的列中并且海肾荧光素酶值(例如，来自pMON63934的表达)提供于标记为“RLuc”的列中。

[0107] 表3.转化大豆叶原生质体中的平均GUS和荧光素酶测定值。

[0108]

[0109]

[0110] 此外，为了比较每个3′UTR的相对活性，GUS值表示为GUS与荧光素酶活性的比率并且相对于最佳表达非苜蓿3′UTR，即，T-Gb.FbL2-1：1：1(SEQ ID NO：41)来标准化。表4示出GUS/荧光素酶比率和标准化比率。另外，在此表中，萤火虫荧光素酶值标记为“FLuc”并且海肾荧光素酶值标记为“RLuc”。

[0111] 表4.相对于转化大豆叶原生质体中的T-Gb.FbL2-1：1：1(SEQ ID NO：41)来标准化的GUS/FLuc和GUS/RLuc表达比率。

[0112]

[0113]

[0114] 如表4展示，与来自陆地棉或海岛棉的3′UTR相比，GUS表达使用所有选定苜蓿3′UTR来增强。举例来说，基于相对于T-Gb.FbL2-1：1：1来标准化的GUS/FLuc比率，使用苜蓿衍生3′UTR，GUS的表达高2.1至18.3倍，其中最佳表达3′UTR来自陆地棉或海岛棉。类似地，基于相对于T-Gb.FbL2-1：1：1标准化的GUS/RLuc比率，使用苜蓿衍生3′UTR，GUS的表达高1.61至10.48倍。

[0115] 实施例3

[0116] 分析3′UTR对于稳定地转化大豆植物中的组成性GUS表达的效果

[0117] 大豆植物用载体，尤其质粒构建体转化，以评估选定蒺藜状苜蓿3′UTR对于表达的效应。具体来说，大豆植物用含有驱动可操作地连接至苜蓿3′UTR的β-葡糖醛酸酶(GUS)转基因的表达的组成性EXP序列的载体转化。这些苜蓿3′UTR-转化大豆植物与转化大豆植物比较，其中GUS转基因的表达由组成性启动子驱动，并且GUS转基因可操作地连接至来自海岛棉的3′UTR。

[0118] 用于这些实验中的植物载体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体包含来自根癌农杆菌的左边界区域；选择赋予抗生素大观霉素的抗性(由拟南芥肌纤蛋白7启动子驱动)的转化植物细胞的第一转基因表达盒；用于评估3′UTR的活性的第二转基因表达盒，所述3′UTR包含5′可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的GUS的编码序列的调控表达元件组EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：42)，所述可加工内含子5′可操作地连接至来自蒺藜状苜蓿或海岛棉的3′UTR；和来自根癌农杆菌的右边界区域。包含来自苜蓿的3′UTR的载体是pMON109593、pMON116803、pMON116812、pMON116813、pMON116815、pMON116826、pMON116827、pMON116830、pMON122850、pMON122851、pMON122852、pMON122853、pMON122854、pMON122855、pMON122856、pMON122857、pMON122858、pMON122859、pMON122861、pMON122862、pMON122863、pMON122864、pMON122865、pMON122866、pMON122867和pMON122868。包含来自海岛棉的3’UTR的载体是pMON102167。

[0119] 表5提供具有用于在此实施例中呈现的实验中转化大豆植物的相应3′UTR和SEQ ID NO的质粒构建体。

[0120] 表5.用于转化大豆叶植物的质粒构建体和3′UTR描述。

[0121]

[0122]

[0123] 大豆植物使用在本领域中已知的农杆菌介导转化方法来转化。GUS的表达使用选定组织的组织学切片来定性测定。对于组织化学GUS分析，将全组织切片与GUS染色溶液X-Gluc(5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)(1mg/ml)一起孵育适当长度时间、冲洗，并且视觉检查蓝色着色。GUS活性使用选定植物器官和组织、通过直接肉眼检查或在显微镜下的检查来定性地确定。R0世代植物针对在Vn5根、Vn5库叶、Vn5源叶、R1源叶、R1叶柄、R1花朵、黄色圆荚体胚芽(大约R8发育期)、黄色圆荚体子叶(大约R8发育期)、R3未成熟种子、R3圆荚体和R5子叶中的表达来检查。

[0124] 相对于由包含来自海岛棉的3′UTR的pMON102167赋予的表达，还分析GUS表达的定量变化，如表6-13展示。对于此定量分析，从转化植物的选定组织中提取总蛋白质。在50μl的总反应体积中，一微克总蛋白质与荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)一起使用。反应产物，4-甲基伞形酮(4-MU)在羟基得以电离的较高pH下最大限度地发荧光。添加碳酸钠的碱性溶液同时停止测定并调整pH用于量化荧光产物。使用具有Micromax读取器的Fluoromax-3(Horiba；Kyoto，Japan)以365nm下的激发，445nm下的发射来测量荧光，所述读取器具备设定为激发2nm，发射3nm的缝隙宽度。

[0125] 表6和7展示在R0世代植物组织中测量的平均定量表达水平。未测定的那些组织在两个表中展示为空白单元。

[0126]

[0127]

[0128]

[0129] 如表6和7展示，在与海岛棉衍生3′UTR相比时，在包含不同苜蓿3′UTR的稳定转化大豆植物的组织中的由相同EXP驱动的表达是不同的。

[0130] 表8和9展示在与海岛棉衍生3’UTR相比时，包含不同苜蓿3′UTR的稳定转化大豆植物的组织中的倍数表达差异。

[0131]

[0132]

[0133]

[0134] 如表8和9展示，在与用包含来自海岛棉的3′UTR的pMON102167转化的大豆植物相比时，组织包含不同苜蓿3′UTR的转化大豆植物中的表达是不同的。举例来说，两个苜蓿3′UTR，T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)和T-Mt.Lox-1-1：2：1(SEQ ID NO：14)在所有组织中导致组成性EXP，EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：42)的表达增强。其它苜蓿3′UTR在一些组织中提供组成性EXP的增强表达，而其他组织中减少表达。举例来说，3′UTR T-Mt.Sali3-2-1：2：1(SEQ ID NO：26)Vn5根、Vn5库叶、Vn5源叶、R1源叶、黄色圆荚体胚芽和黄色圆荚体子叶中提供2.19至8.05倍表达增加，而在R1花朵和R5子叶中减少表达。此外，3′UTR T-Mt.AC140914v20-1：2：1(SEQ ID NO：2)在Vn5根、Vn5库叶、Vn5源叶、黄色圆荚体胚芽、黄色圆荚体子叶、R3未成熟种子和R5子叶中提供1.88至4.12倍表达增加，而在R1源叶、R1花朵中减少表达，并且在R3圆荚体中保持表达相对相同。另外，3′UTR T-Mt.Oxr-1：2：1(SEQ ID NO：17)在Vn5根、Vn5库叶、Vn5源叶、R1源叶、黄色圆荚体胚芽、黄色圆荚体子叶和R3圆荚体中提供2.19至10.90倍表达增加，而在R1花朵和R5子叶中减少表达，并且在R3未成熟种子中保持表达相对相同。

[0135] 将包含不同苜蓿3′UTR的一些转化大豆植物带至R1世代。表10和11展示测定组织的平均GUS表达值。表12和13展示相对于来自海岛棉的3’UTR的表达倍数差异。

[0136]

[0137] 如表10和11展示，在与海岛棉衍生3′UTR相比时，在包含不同苜蓿3′UTR的稳定转化大豆植物的组织中，由相同EXP驱动的表达是不同的。表12和13展示相对于用包含来自海岛棉的3′UTR的pMON102167转化的组织，包含不同苜蓿3′UTR的稳定转化大豆植物的组织中的倍数表达差异。

[0138]

[0139] 表13.R1世代转化大豆植物的黄色圆荚体胚芽、黄色圆荚体子叶、R3未成熟种子、R3圆荚体和R5子叶中的倍数表达差异。

[0140]

[0141] 如表12和13展示，相对于用在R1世代中包含来自海岛棉的3′UTR的pMON102167转化的植物，若干苜蓿3′UTR增强组成性EXP元件，EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：42)的表达。举例来说，3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)在所有测定组织中提供GUS表达的3.10至21.65倍增强。3′UTR T-Mt.Sali3-2-1：2：1(SEQ ID NO：26)在所有测定组织中提供GUS表达的1.52至8.90倍增强。3′UTR T-Mt.Oxr-1：2：1(SEQ ID NO：17)在大多数组织中提供增强，但是相对于用T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)转化的植物，减少R3未成熟种子中的表达。

[0142] 前述实验表明取决于所选择的特定3′UTR，蒺藜状苜蓿衍生3′UTR元件以不同方式影响组成性EXP元件EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：42)的表达。在许多情况下，相对于用包含来自海岛棉的3′UTR的pMON102167转化的植物，在用包含苜蓿3′UTR的植物表达载体转化的植物的某些组织中，存在增强的表达。然而，增强效应并非在所有植物组织观察到并且在许多情况下，表达在一些组织中减弱并且在使用苜蓿3′UTR的其他组织中增强。因此，使用选定苜蓿3′UTR允许“微调”具体转基因的表达谱并且在与可转录DNA分子的可操作连接中可与不同表达元件，如启动子、前导区和内含子组合使用以提供特定组织中的最优表达，同时在对于特定可转录DNA分子不太理想的组织中减少表达。

[0143] 实施例4

[0144] 分析3′UTR对于稳定地转化大豆植物中的种子优选GUS表达的效果

[0145] 大豆植物用载体，尤其质粒构建体转化，以评估选定苜蓿3′UTR对于表达的效应。具体来说，大豆植物用含有驱动可操作地连接至苜蓿3′UTR的β-葡糖醛酸酶(GUS)转基因的表达的种子表达EXP序列的DNA载体转化。这些苜蓿3′UTR-转化大豆植物与转化大豆植物比较，其中GUS转基因的表达由种子表达EXP序列驱动，并且GUS转基因可操作地连接至来自海岛棉的3′UTR。

[0146] 用于这些实验中的植物载体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体包含来自根癌农杆菌的左边界区域；选择赋予抗生素大观霉素的抗性(由拟南芥肌纤蛋白7启动子驱动)的转化植物细胞的第一转基因表达盒；用于评估3′UTR的活性的第二转基因表达盒，所述3′UTR包含5′可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的GUS的编码序列的提供种子优选表达的EXP元件EXP-Gm.Sphas1：1：1(SEQ ID NO：50)，所述可加工内含子5′可操作地连接至来自蒺藜状苜蓿或海岛棉的3′UTR；和来自根癌农杆菌的右边界区域。包含来自苜蓿的3′UTR的植物表达载体是pMON116832、pMON116834、pMON116835、pMON116841、pMON122869、pMON122870、pMON122871、pMON122872、pMON122873、pMON122874、pMON122875、pMON122876、pMON122878、pMON122879、pMON122880、pMON122881、pMON122882、pMON122883、pMON122885、pMON122887、pMON122888和pMON126122。包含来自海岛棉的3’UTR的载体是pMON83028。

[0147] 表14提供具有针对性提供定量测定数据的相应3′UTR、SEQ ID NO和世代的质粒构建体。

[0148] 表14.用于转化大豆植物的质粒构建体和相应3′UTR。

[0149]

[0150] 将大豆植物转化并且所测定的GUS如实施例3中描述。表15和16提供R0世代稳定转化大豆植物的定量平均GUS值。

[0151] 表15.R0世代转化大豆植物的黄色圆荚体胚芽、黄色圆荚体子叶、R3未成熟种子、R3圆荚体和R5子叶中的平均GUS表达。

[0152]

[0153] 表16.R0世代转化大豆植物的Vn5根、Vn5库叶、Vn5源叶、R1源叶、R1叶柄和R1花朵中的平均GUS表达。

[0154]

[0155]

[0156] 如可以在表15和16中看出，大多数苜蓿3′UTR仅在种子衍生组织中影响种子优选EXP元件，EXP-Gm.Sphas1：1：1(SEQ ID NO：50)的表达，除了在R1源叶、R1叶柄和R1花朵中增强GUS表达的T-Mt.Apx-1：1：2(SEQ ID NO：5)以外。若干苜蓿3′UTR在黄色圆荚体胚芽和黄色圆荚体子叶中提供较高表达，如T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)、T-Mt.RD22-1：2：1(SEQ ID NO：24)和T-Mt.AC153125V10-1：2：1(SEQ ID NO：4)。因此，这些3′UTR可在种子发育较晚阶段期间理想地增强种子启动子的表达。相对于许多其他3′UTR，3′UTRT-Mt.Expr1-1：2：1(SEQ ID NO：7)在R5子叶和黄色圆荚体子叶中提供较高表达，因而可适用于对于种子发育的较宽窗口提供较高子叶表达。在一些情况下，3′UTR在黄色圆荚体胚芽和黄色圆荚体子叶中提供更均一水平种子表达，如在使用T-Mt.FBA-1：2：1(SEQ ID NO：9)、T-Mt.Zfp-1：2：1(SEQ ID NO：30)、T-Mt.Pip1-1：2：1(SEQ ID NO：18)和T-Mt.Pt2-1：2：2(SEQ ID NO：23)时。

[0157] 允许包含T-Mt.Zfp-1：2：1(SEQ ID NO：30)、T-Mt.Apx-1：1：2(SEQ ID NO：5)、T-Mt.Sui1-1：1：2(SEQ ID NO：29)和T-Mt.EF1a-1：1：2(SEQ ID NO：6)的R0世代植物产生种子并且种植用于R1世代研究。表17示出事件的平均定量测定数据的比较，这些事件包括包含苜蓿3′UTR的这些R1世代植物和用包含来自海岛棉的3′UTR T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)的pMON83028转化的植物。

[0158] 表17.R1世代转化大豆植物的黄色圆荚体胚芽、黄色圆荚体子叶和R5子叶中的平均GUS表达。

[0159]

[0160] 如可以在表17中看出，与T-Gb.E6-3b：1：1相比，苜蓿3′UTR不同地影响在胚胎和子叶组织中的表达。举例来说，相对于T-Gb.E6-3b：1：1，T-Mt.Apx-1：1：2(SEQ ID NO：5)和T-Mt.Sui1-1：1：2(SEQ ID NO：29)增强黄色圆荚体胚芽、黄色圆荚体子叶和R5子叶中的种子优选EXP元件的表达。T-Mt.EF1a-1：1：2(SEQ ID NO：6)增强黄色圆荚体胚芽和黄色圆荚体子叶中的表达，但是不增强在R5子叶中的表达。T-Mt.Zfp-1：2：1(SEQ ID NO：30)减少较晚发育黄色圆荚体胚芽和黄色圆荚体子叶中的表达，但是增强在R5子叶中的表达。

[0161] 因此，在与种子优选启动子可操作连接时，每个不同苜蓿3′UTR不同地影响发育种子中的表达。对于表达的效应的这些差异可用于提供种子表达的更精制和定制途径并且可理想地适合于“微调”其中需要种子表达的特定可转录DNA分子的表达谱。

[0162] 实施例5

[0163] 分析3′UTR对于稳定地转化大豆植物中的组成性GUS表达的效果。

[0164] 大豆植物用载体，尤其质粒构建体转化，以评估选定蒺藜状苜蓿3′UTR对于表达的效应。具体来说，大豆植物用含有驱动可操作地连接至苜蓿3′UTR的β-葡糖醛酸酶(GUS)转基因的表达的展现组成性表达谱的两个不同EXP序列的载体转化。这些苜蓿3′UTR转化植物与转化大豆植物比较，其中GUS转基因的表达可操作地连接至来自海岛棉的3′UTR。

[0165] 用于这些实验中的植物载体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体包含来自根癌农杆菌的左边界区域；选择赋予抗生素大观霉素的抗性(由拟南芥肌纤蛋白7启动子驱动)的转化植物细胞的第一转基因表达盒；用于评估3′UTR的活性的第二转基因表达盒，所述3′UTR包含5′可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的GUS的编码序列的EXP元件EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：42)或EXP-DaMV.FLT：1：2(SEQ ID NO：51)，所述可加工内含子5′可操作地连接至来自蒺藜状苜蓿或海岛棉的3′UTR；和来自根癌农杆菌的右边界区域。包含来自苜蓿的3′UTR的载体是pMON118768、pMON153701和pMON116803。包含来自海岛棉的3’UTR的载体是pMON121042和pMON102167。

[0166] 表18提供具有用于转化在此实施例中呈现的大豆植物的相应EXP元件、3′UTR和SEQ ID NO的质粒构建体。

[0167] 表18.用于转化大豆植物的质粒构建体和相应EXP元件和3′UTR。

[0168]

[0169]

[0170] 将植物转化并且所测定的GUS如实施例3中描述。表19和20提供R0世代稳定转化大豆植物的定量平均GUS值。

[0171]

[0172] 如表19和20展示，与海岛棉衍生3′UTRT-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)相比，苜蓿3′UTR T-Mt.Sali3-2-1：2：1(SEQ ID NO：26)和T-Mt.AC140914v20-1：2：1(SEQ ID NO：2)不同地影响组成性EXP元件EXP-DaMV.FLT：1：2(SEQ ID NO：51)的表达。在许多采样组织中，存在使用苜蓿3′UTR的表达增强。相对于3′UTRT-Mt.AC140914v20-1：2：1，在也包含EXP元件EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：42)的植物的大多数组织中发现增强。表21和
22展示相对于包含来自海岛棉的3’UTR的pMON121042(T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40))赋予的表达，定量GUS表达的倍数差异。

[0173]

[0174] 前述实验表明相对于包含来自海岛棉的3’UTR的pMON121042(T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40))，每个苜蓿3′UTR对于每个组成性EXP元件的表达水平具有不同效应。举例来说，EXP-DaMV.FLT：1：2的表达在Vn5根、Vn5库叶、Vn5源叶、R1源叶、R1叶柄、R1花朵、黄色圆荚体胚芽、黄色圆荚体子叶、R3圆荚体和R5子叶中增强1.14至15.13倍，但是使用T-Mt.Sali3-2-1：2：1，在R3未成熟种子中表达减少。此相同EXP元件，在与T-Mt.AC140914v20-1：2：1组合时，导致Vn5根、Vn5源叶、R1源叶、R1叶柄、R1花朵、黄色圆荚体胚芽、黄色圆荚体子叶、R3未成熟种子、R3圆荚体和R5子叶中的1.34至13.42倍增强，但是在V5库叶中保持与T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)大约相同。在黄色圆荚体胚芽中的表达是使用T-Mt.Sali3-2-1：2：1的黄色圆荚体子叶的约两倍(15.13相比于7.23倍增强)，而在使用T-Mt.AC140914v20-1：2：1时，这两个组织中的表达相对相同(9.19相比于9.13倍增强)。相对于EXP元件EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3，与此相同3′UTR与EXP-DaMV.FLT：1：2组合时相比，与T-Mt.AC140914v20-1：2：1的组合在许多采样组织中产生较小增强。在R1花朵中，减少表达相对于T-Gb.E6-3b：1：1在EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3组合与T-Mt.AC140914v20-
1：2：1。EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3与T-Mt.Sali3-2-1：2：1的组合在Vn5根、Vn5库叶、Vn5源叶、R1源叶、黄色圆荚体胚芽和黄色圆荚体子叶中提供增强，但是相对于T-Gb.E6-3b：
1：1(SEQ ID NO：40)，在R1花朵和R5子叶中减少表达。

[0175] 两个苜蓿3′UTR，T-Mt.Sali3-2-1：2：1和T-Mt.AC140914v20-1：2：1，中的每一个不同地影响两个不同组成性EXP元件EXP-DaMV.FLT：1：2和EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3的表达。在许多组织中，存在相对于T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)的表达增强，但是在一些组织中，发生表达减少。因此，通过使用不同苜蓿3′UTR，能够更精确控制植物中的表达并且更好“微调”特异性可转录DNA分子的表达以便在需要可转录DNA分子的表达时提供最优表达，同时减少可能负面地影响植物的组织中的表达。

[0176] 实施例6

[0177] 蒺藜状苜蓿3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2当在稳定地转化大豆植物中与许多不同EXP分子组合时导致GUS表达的增强

[0178] 大豆植物用载体，尤其质粒构建体转化，以评估苜蓿3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)对于表达的效应。具体来说，大豆植物用含有具有驱动可操作地连接至苜蓿3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)的β-葡糖醛酸酶(GUS)转基因的表达的组成性表达谱的多个不同EXP的载体转化。这些苜蓿3′UTR-转化大豆植物与转化大豆植物比较，其中GUS转基因可操作地连接至来自海岛棉的3′UTR。

[0179] 用于这些实验中的载体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体包含来自根癌农杆菌的左边界区域；选择赋予抗生素大观霉素的抗性(由拟南芥肌纤蛋白7启动子驱动)的转化植物细胞的第一转基因表达盒；用于评估包含EXP元件的3′UTR  T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)的活性的第二转基因表达盒，所述EXP元件EXP-Mt.AC145767v28：1：1(SEQ ID NO：35)、EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：42)、EXP-BSAcVNV.FLT：1：2(SEQ ID NO：52)、EXP-CERV.FLT：1：2(SEQ ID NO：53)、EXP-DaMV.FLT：1：2(SEQ ID NO：51)、EXP-CUCme.eEF1a：1：1(SEQ ID NO：54)或EXP-Mt.Ubq2：1：2(SEQ ID NO：31)5′可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的GUS的编码序列，所述可加工内含子5′可操作地连接至来自蒺藜状苜蓿的3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)，或来自海岛棉的3’UTR T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)或T-Gb.FbL2-1：1：1(SEQ  ID  NO：41)；和来自根癌农杆菌的右边界区域。包含T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)的载体是pMON118798、pMON116815、pMON118769、pMON153709、pMON118771、pMON153707和pMON155502。值得注意的是，载体pMON118798包含原生EXP-Mt.AC145767v28：1：1，其包含可操作地连接至从与3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：
1：2(SEQ ID NO：1)相同的基因座位克隆的前导区元件的启动子元件。包含3’UTR来自海岛棉的载体是pMON102167、pMON113874、pMON121030、pMON121042、pMON140827和pMON125841。

[0180] 表23提供具有用于转化在此实施例中呈现的大豆植物的相应EXP元件、3′UTR和SEQ ID NO的质粒构建体。

[0181] 表23.用于转化大豆植物的质粒构建体和相应EXP元件和3′UTR。

[0182]

[0183]

[0184] 将大豆植物转化并且所测定的GUS如实施例3中描述。表24和25提供R0世代稳定转化大豆植物的定量平均GUS值。标记为“bdl”的表格单元指示得到定量分析但是表达低于检测水平的组织。表26和27提供相对于T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)，可操作地连接至T-Mt.AC145767v28-1：1：2的每个EXP元件的表达的倍数变化。

[0185]

[0186]

[0187]

[0188]

[0189] 如表24和25展示，相对于T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)，苜蓿3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)增强六个组成性EXP元件的表达，但是以取决于特异性EXP元件和组织的不同方式。EXP元件，EXP-Mt.AC145767v28：1：1，在用于驱动GUS并且可操作地连接至其原生3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2时在所有测定组织表达非常低并且在R3未成熟种子、R3圆荚体和R1花朵中不可检测到。相对于EXP-Mt.Ubq2：1：2与T-Gb.FbL2-1：1：1的组合，包含EXP元件EXP-Mt.Ubq2：1：2和3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2的植物的一些组织展示减少的表达。此减少的表达在R3未成熟种子、R1花朵和R1叶柄中发现，同时相比之下，Vn5库叶和R5子叶表达增强大于四倍。使用EXP-Mt.Ubq2：1：2和3′UTR，根表达(Vn5根)没有变化。

[0190] 调控表达元件组EXP-CERV.FLT：1：2和EXP-DaMV.FLT：1：2提供最高水平的表达。如表26和27展示，相对于与T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)组合的相同EXP，这两个EXP在具有T-Mt.AC145767v28-1：1：2的所有组织中增强。调控表达元件组EXP-CERV.FLT：1：2在发育黄色圆荚体子叶中增强60.50倍并且在黄色圆荚体胚芽中增强较小(21.50倍)，同时与在黄色圆荚体子叶中相比，调控表达元件组EXP-DaMV.FLT：1：2在黄色圆荚体胚芽中以更大程度增强(分别为26.80相比于15.76倍增强)。这些表达和增强差异给予在后期发育种子中提供转基因的定制表达的机会。在与T-Gb.E6-3b：1：1组合时，调控表达元件组EXP-BSAcVNV.FLT：1：2在R3圆荚体和Vn5根中表达最高(参见表25和26)。在与T-Mt.AC145767v28-1：1：2组合时，EXP-BSAcVNV.FLT：1：2在这两个组织中的表达极大地增强，尤其在Vn5根中。此外，相对于与T-Gb.E6-3b：1：19(SEQ ID NO：40)组合的此相同EXP，在与T-Mt.AC145767v28-1：1：2组合时，EXP-BSAcVNV.FLT：1：2的表达增强58.63倍。

[0191] 总之，蒺藜状苜蓿3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)增强来自植物和植物病毒基因组DNA的六个不同组成性EXP元件的表达。另外，相对于大多数其他苜蓿衍生3′UTR，此3′UTR增强种子优选EXP元件EXP-Gm.Sphas1：1：1(SEQ ID NO：54)的表达。因此，此3′UTR适合于提供启动子或构建体中的可操作地连接表达元件的组合的增强表达。

[0192] 实施例7

[0193] 分析稳定地转化大豆植物中的EXP-Mt.Ubq2：1：2(SEQ ID NO：31)

[0194] 大豆植物用包含可操作地连接至GUS编码序列的组成性调控表达元件组EXP-Mt.Ubq2：1：2(SEQ ID NO：31)的用载体，尤其质粒构建体来转化。这些转化植物然后测定在稳定转化大豆植物中的GUS表达。

[0195] 用于这些实验中的植物载体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体包含来自根癌农杆菌的左边界区域；选择赋予抗生素大观霉素的抗性(由拟南芥肌纤蛋白7启动子驱动)的转化植物细胞的第一转基因表达盒；用于评估包含EXP-Mt.Ubq2：1：2的EXP-Mt.Ubq2：1：2(SEQ ID NO：31)的活性的第二转基因表达盒，所述EXP-Mt.Ubq2：1：2 5′可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的β-葡糖醛酸酶(GUS)的编码序列，所述可加工内含子5′可操作地连接至来自蒺藜状苜蓿的3′UTR T-Mt.AC145767v28-1：1：2(SEQ ID NO：1)，或来自海岛棉的3’UTR T-Gb.E6-3b：1：1(SEQ ID NO：40)或T-Gb.FbL2-1：1：1(SEQ ID NO：41)；和来自根癌农杆菌的右边界区域。

[0196] 所得载体用于转化如实施例3描述的大豆植物。表28和29展示在各种组织中测定的平均定量GUS表达值和稳定转化大豆植物的发育时间点。

[0197] 表28.包含EXP-Mt.Ubq2：1：2(SEQ ID NO：31)的稳定转化大豆植物的叶、根和花中的平均GUS表达。

[0198]

[0199] 表29.包含EXP-Mt.Ubq2：1：2(SEQ ID NO：31)的稳定转化大豆植物的圆荚体和种子组织中的平均GUS表达。

[0200]

[0201] 如表28和29展示，EXP-Mt.Ubq2：1：2(SEQ ID NO：31)能够驱动稳定转化大豆植物中的可转录DNA分子的组成性表达。此外，不同3’UTR影响每个组织中的表达程度。举例来说，与其他两个3′UTR，T-Gb.FbL2-1：1：1和T-Mt.AC145767v28-1：1：2相比，将EXP-Mt.Ubq2：1：2与T-Gb.E6-3b：1：1组合导致在所有测定组织中的较低表达。然而，不论施用哪一种3′UTR，EXP-Mt.Ubq2：1：2提供中等至高等组成性表达，其程度可通过选择哪一种3′UTR可操作地连接至EXP来调节。

[0202] 实施例8

[0203] 来自调控元件的增强子

[0204] 增强子可来自本文提供的启动子元件，如SEQ ID NO：32和36。增强子元件可包含一个或多个顺式调控元件，所述顺式调控元件在5′或3′可操作地连接至启动子元件或5′或3′可操作地连接至可操作地连接至启动子的额外增强子元件时，可增强或调节可转录DNA分子的表达，或提供可转录DNA分子特异性在细胞类型或植物器官中，或在发育或昼夜节律中的具体时间点处的表达。增强子通过移除TATA盒或功能类似元件和允许转录从启动子或启动子片段启始的任何下游序列来产生。

[0205] 增强子元件可来源于本文提供的启动子元件并且使用在本领域中已知的方法来克隆以5′或3′可操作地连接至启动子元件或5′或3′可操作地连接至可操作地连接至启动子的额外增强子元件。或者，增强子元件可使用在本领域中已知的方法来克隆以便可操作地连接至增强子元件的一个或多个复本，其5′或3′可操作地连接至启动子元件，或5′或3′可操作地连接至可操作地连接至启动子的额外增强子元件。此外，可克隆增强子元件以5′或3′可操作地连接至来自不同属类生物体的启动子元件或5′或3′可操作地连接至来自其他属类生物体或相同属类生物体的额外增强子元件，所述额外增强子元件可操作地连接至来自相同或不同属类生物体的启动子，从而产生嵌合调控元件。GUS表达植物转化载体可使用在本领域中已知的方法与以前实例中所描述的构建体类似来构建，其中所得植物表达载体含有来自根癌农杆菌的左边界区域；赋予抗生素或除草剂的抗性和用于选择转化植物细胞的第一转基因选择盒；和其中增强子元件可操作地连接至启动子以形成嵌合启动子元件的第二转基因盒，所述嵌合启动子元件5′可操作地连接至前导区元件，所述前导区元件5′可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的GUS的编码序列，所述可加工内含子可操作地连接至3′UTR如T-Gb.E6-3b：1：1或如上所述来自蒺藜状苜蓿的任何3′UTR；和来自根癌农杆菌的右边界区域。

[0206] 由包含一个或多个增强子的调控元件驱动的GUS表达可在如本文描述的稳定或瞬时植物测定中评估来确定增强子元件对于可转录DNA分子的表达的效应。一个或多个增强子元件的修饰或一个或多个增强子元件的复制可基于经验实验和使用每个调控元件组合物所观察到的所得基因表达调控来执行。改变一个或多个增强子在所得调控或嵌合调控元件中的相对位置可影响转录活性或调控或嵌合调控元件的特异性并且凭经验地来确定以识别用于植物内的所需转基因表达谱的最佳增强子。

[0207] 实施例9

[0208] 分析3′UTR对于稳定地转化玉米植物中的组成性GUS表达的效果

[0209] 玉米植物用二元质粒构建体转化以相对于常常用于玉米植物中的两个3′UTR评估苜蓿3′UTR T-Mt.Oxr-1：2：1(SEQ ID NO：17)对于表达的效应。具体来说，玉米植物用含有展现驱动可操作地连接至苜蓿3′UTR T-Mt.Oxr-1：2：1(SEQ ID NO：17)的β-葡糖醛酸酶(GUS)转基因的表达的组成性表达谱的EXP的载体转化。这些转化玉米植物与转化玉米植物比较，其中GUS可操作地连接至3′UTR T-AGRtu.nos-1：1：13(SEQ ID NO：49)或3’UTR T-Os.LTP：1(SEQ ID NO：56)。

[0210] 用于这些实验中的二元质粒构建体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体包含来自根癌农杆菌的右边界区域；测定3′UTR序列的第一表达盒，其中组成性调控表达元件组EXP-FMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Zm.DnaK：1：2(SEQ ID NO：56)5’可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的GUS的编码序列，所述可加工内含子5′可操作地连接至以下三个3′UTR中的一个：T-Mt.Oxr-1：2：1(SEQ ID NO：17)，T-AGRtu.nos-1：1：13(SEQ ID NO：49)或T-Os.LTP：1(SEQ ID NO：56)；用于选择赋予除草剂草甘磷的抗性(由水稻肌纤蛋白1启动子驱动)的转化植物细胞的第二转基因表达盒；和来自根癌农杆菌的左边界区域。所得质粒用于转化玉米植物。

[0211] 组织化学GUS分析用于转化植物的定性表达分析。将全组织切片与GUS染色溶液X-Gluc(5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)(1mg/ml)一起孵育适当长度时间、冲洗，并且视觉检查蓝色着色。GUS活性使用选定植物器官和组织、通过直接肉眼检查或在显微镜下的检查来定性地确定。授粉之后21天(21DAP)，将R0植物针对根和叶，以及花粉囊、穗丝和发育种子和胚芽中的表达来进行检查。

[0212] 还执行转化玉米植物的定量分析。对于定量分析，从转化玉米植物的选定组织中提取总蛋白质。在50μl的总反应体积中，一微克总蛋白质与荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)一起使用。反应产物，4-甲基伞形酮(4-MU)在羟基得以电离的较高pH下最大限度地发荧光。添加碳酸钠的碱性溶液同时停止测定并调整pH用于量化荧光产物。使用具有Micromax读取器的Fluoromax-3(Horiba；Kyoto，Japan)以365nm下的激发，445nm下的发射来测量荧光，所述读取器具备设定为激发2nm和发射3nm的缝隙宽度。

[0213] 表30示出所测量的平均定量GUS表达，其展示每个3′UTR对于相同组成性表达EXP的不同效应。

[0214] 表30.用不同3′UTR转化的玉米植物中的平均GUS表达。

[0215]

[0216]

[0217] 如可以在表30中看出，每个3′UTR对于由EXP-FMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Zm.DnaK：1：2(SEQ ID NO：56)驱动的组成性表达具有不同效应。举例来说，相对于其他两个3′UTR，3′UTR T-Os.LTP：1(SEQ ID NO：56)似乎在VT根和R1穗轴/穗丝中增强表达。相对于T-AGRtu.nos-1：1：13(SEQ ID NO：49)和T-Os.LTP：1(SEQ ID NO：56)，3′UTR T-Mt.Oxr-1：2：1(SEQ ID NO：17)似乎在R3种子中在21DAP胚乳和21DAP胚芽中增强表达。相对于其他两个3′UTR，使用T-Mt.Oxr-1：2：1(SEQ ID NO：17)，花朵/花粉囊中的表达也较高。对于每个3′UTR所观察到的表达差异展示每个3′UTR在调节表达中的有用性。因此，这些实验表明选择3′UTR可在转基因盒中用于微调具体可转录DNA分子的表达。此实验还展示双子叶衍生3′UTR，如T-Mt.Oxr-1：2：1，影响单子叶物种如玉米中的转录的能力。

[0218] 实施例10

[0219] 分析使用植物衍生原生质体的GUS活性的内含子增强

[0220] 总体上，内含子基于使用无内含子载体对照的实验和比较来选择以便凭经验地选择最优表达转基因的载体传递DNA(T-DNA)元件布置内的内含子和配置。举例来说，在赋予草甘磷耐受性的除草剂抗性基因，如CP4(US RE39247)的表达中，需要在生殖组织以及营养组织中具有转基因表达以便在施用除草剂时防止产量损失。此实例中的内含子基于其在可操作地连接至组成性启动子时，尤其在转基因植物的生殖细胞和组织中增强除草剂抗性赋予转基因的表达，因而在喷淋除草剂时为转基因植物提供营养和生殖耐受性的能力来选择。在大多数泛素基因中，5′UTR包含前导区，其具有嵌入其中的内含子序列。因此，来自这类基因的调控元件使用包含启动子、前导区和内含子的整个5′UTR来测定。为了获得不同表达谱或调节转基因表达水平，来自这类调控元件的内含子可移除或用异源内含子取代。

[0221] 本文提供为SEQ ID NO：34的内含子使用与表达序列标签集群相比的基因组DNA重叠群，或cDNA重叠群来识别，以识别基因组DNA内的外显子和内含子序列。另外，在基因序列编码由一个或多个内含子间断的前导序列的条件下，5′UTR或前导序列也用于定义一个或多个内含子的内含子/外显子剪接接合。内含子使用在本领域中已知的方法克隆至植物转化载体中以3′可操作地连接至调控元件和前导区片段并且5′可操作地连接至第二前导区片段或编码序列，如呈现图1中的表达盒。

[0222] 因此，例如，第一可能表达盒，如图1中的表达盒配置1，包含启动子或嵌合启动子元件[A]，其5′可操作地连接至前导区元件[B]，所述前导区元件5′可操作地连接至测试内含子元件[C]，所述测试内含子元件可操作地连接至编码区域[D]，所述编码区域可操作地连接至3′UTR元件[E]。或者，第二可能表达盒，如图1中的表达盒配置2，包含启动子或嵌合启动子元件[F]，其5′可操作地连接至第一前导区元件或第一前导区元件片段[G]，所述第一前导区元件或第一前导区元件片段5′可操作地连接至测试内含子元件[H]，所述测试内含子元件5′可操作地连接至第二前导区元件或第一前导区元件第二片段[I]，所述第二前导区元件或第一前导区元件第二片段可操作地连接至编码区域[J]，所述编码区域可操作地连接至3′UTR元件[K]。此外，第三可能表达盒，如图1中的表达盒配置3，包含启动子或嵌合启动子元件[L]，其5′可操作地连接至前导区元件[M]，所述前导区元件5′可操作地连接至编码序列元件[N]的第一片段，所述第一片段5′可操作地连接至内含子元件[O]元件，所述元件5′可操作地连接至编码序列元件[P]的第二片段，所述第二片段可操作地连接至3′UTR元件[Q]。值得注意的是，表达盒配置3被设计成以产生完全开放解读码组而在第一与第二片段编码序列之间没有框架变化的方式来允许剪接内含子。

[0223] 如本文论述，可优选地避免使用正好在剪接位点(GT)的5’末端之前的核苷酸序列AT或核苷酸A和相应地正好在剪接位点(AG)的3’末端之后的核苷酸G或核苷酸序列TG以消除将信使RNA加工成最终转录物期间所形成的不必要起始密码子的可能性。因此，内含子的5’或3’末端剪接接合位点周围的DNA序列可修饰。

[0224] 内含子可经由在瞬时测定或稳定植物测定中增强表达的能力针对增强效应来测定。对于内含子增强的瞬时测定，基础植物载体使用在本领域中已知的方法来构建。将内含子克隆至基础植物载体中，所述载体包含表达盒，所述表达盒包含组成性EXP，所述组成性EXP包含启动子和前导区如EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：42)，所述启动子和前导区5′可操作地连接至测试内含子元件(例如一个SEQ ID NO：34)，所述测试内含子元件可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的GUS的编码序列，所述可加工内含子可操作地连接至3′UTR(T-Gb.E6-3b：1：1，SEQ ID NO：40)。来自大豆或其他属类植物组织的原生质体细胞可用基础植物载体和如先前在上述实施例2中描述的荧光素酶对照载体来转化，并且测定活性。为了比较内含子增强表达的相对能力，GUS值表达为GUS与荧光素酶活性的比率并且与包含可操作地连接至已知内含子标准的组成性启动子的构建体赋予的那些水平比较，如来自烟草延长因子4A10基因，I-Nt.eIF4A10-1：1：1(SEQ ID NO：57)的内含子，以及包含组成性启动子，但是没有可操作地连接至启动子的内含子的构建体。

[0225] 对于呈现为SEQ ID NO：34的内含子的稳定植物测定，GUS表达植物转化载体可类似于以前实施例中所描述的构建体来构建，其中所得植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区域；包含包括启动子和前导区如EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：42)的组成性EXP的第一表达盒，所述启动子和前导区5′可操作地连接至测试内含子元件(例如，SEQ ID NO：34)，所述测试内含子元件可操作地连接至具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：44)的GUS的编码序列，所述可加工内含子可操作地连接至来自海岛棉(T-Gb.E6-3b：1：1，SEQ ID NO：40)的3′UTR。来自玉米或其他属类植物组织的原生质体细胞可用基础植物载体和如先前在上述实施例2中描述的荧光素酶对照载体来转化，并且测定活性。为了比较内含子增强表达的相对能力，GUS值表示为GUS与荧光素酶活性的比率并且与包含可操作地连接至已知内含子标准的组成性启动子的构建体赋予的那些水平比较，如来自烟草延长因子4A10基因，I-Nt.eIF4A10-1：1：1(SEQ ID NO：57)的内含子，以及包含组成性启动子，但是没有可操作地连接至启动子的内含子的构建体。

[0226] 应当指出的是呈现为SEQ ID NO：34的内含子可以若干方式来修饰，如缺失内含子序列内的片段，其对于可增强表达的内含子可减少片段的表达或复制。另外，内含子内的可影响针对具体细胞类型或组织和器官的表达特异性的DNA序列可复制或改变或缺失以影响转基因的表达和表达模式。另外，本文提供的内含子可修饰以移除任何潜在起始密码子(ATG)，所述起始密码子可导致非故意的转录物以不同、更长或截短蛋白质形式从不正确地剪接内含子表达。一旦内含子已经凭经验来测试，或它已经基于实验来改变，内含子可用于增强可为任何属类单子叶或双子叶植物的稳定转化植物中的转基因的表达，只要内含子提供转基因的增强。内含子也可用于增强其他生物体，如藻类、真菌或动物细胞中的表达，只要内含子提供其可操作地连接的转基因的表达的增强或减弱或特异性。

[0227] *******

[0228] 已经示出和描述本发明的原则，本领域技术人员显而易知本发明可在安排和细节上改进而不背离这些原则。我们要求在权利要求书的精神和范围内的所有改进。本文中的所有公布都以引用的方式并入本文，该引用的程度就如同已明确且个别地指示将各个别公 布或专利申请以引用的方式并入本文一般。