一种固液两相PEG培养基的制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种固液两相PEG培养基的制备方法及应用，是在培养瓶底部配置固体MS培养基，高压灭菌后冷却形成固体凝胶，沿垂直方向移出部分固体凝胶，优选为沿培养瓶直径移出一半体积的固体凝胶，在培养瓶底部形成空缺，在所述空缺处加入含PEG的MS液体培养基，所述加入的含PEG的MS液体培养基的体积与移出的固体凝胶的体积相同。本发明的培养基由固相MS培养基与液相PEG培养液两部分组成，液体PEG水平方向渗入固体凝胶，固相培养基上接入马铃薯试管苗茎段，进行抗旱性测定；具有制作简单、所需时间短、茎段接种方便等特点。

权利要求

1.一种固液两相PEG培养基的应用，其特征在于，所述固液两相PEG培养基的制备方法是在培养瓶底部配制固体MS培养基，高压灭菌后冷却形成固体凝胶，沿培养瓶直径移出一半体积的固体凝胶，在培养瓶底部形成空缺，在所述空缺处加入含PEG的MS液体培养基，所述加入的含PEG的MS液体培养基的体积与移出的固体凝胶的体积相同；所述固液两相PEG培养基应用于植物的抗旱性研究。

2.根据权利要求1所述的固液两相PEG培养基的应用，其特征在于，所述含PEG的MS液体培养基中PEG的重量体积比浓度为0-25%。

3.根据权利要求1所述的固液两相PEG培养基的应用，其特征在于，所述MS培养基中含

2-4%蔗糖，0.6-1.5%琼脂粉，均为重量体积比。

4.根据权利要求1所述的固液两相PEG培养基的应用，其特征在于，应用于不同马铃薯品种试管苗抗旱性的测定。

5.根据权利要求1所述的固液两相PEG培养基的应用，其特征在于，应用于不同马铃薯品种转基因试管苗抗旱性的测定。

6.根据权利要求1所述的固液两相PEG培养基的应用，其特征在于，应用于不同马铃薯品种诱变所获试管苗抗旱性的测定。

7.根据权利要求4-6任一项所述的固液两相PEG培养基的应用，其特征在于，在培养瓶中沿垂直方向移出部分固体凝胶后，将试管苗接入固体MS培养基中，接入位置距离固液两相交界线0.3-0.6cm，然后再加入含PEG的MS液体培养基。

说明书

一种固液两相PEG培养基的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物抗旱性研究领域，具体涉及一种固液两相PEG培养基的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 马铃薯是世界第四大粮食作物，也是我国潜在的主粮，且具有蔬菜、粮食兼用的特点。马铃薯的生长需要大量水分，缺水与盐胁迫对其影响很大，干旱等逆境胁迫是马铃薯生产的重要限制因子，其抗旱等逆性研究具有重要价值。

[0003] Bansal等(1991年)发现马铃薯叶圆盘对PEG6000(聚乙二醇，分子量为6000)溶液的抗性表现与供体品种的抗旱性一致，大分子量PEG可作为马铃薯抗旱性的筛选剂与测定剂。实际上，大分子量PEG不进入细胞，是包括马铃薯在内的植物抗旱性测定的最佳筛选剂，应用最普遍。甘露醇等小分子物质也可作为渗透胁迫剂，但进入细胞内部，甚至参与代谢，其作用无法与PEG相比。

[0004] 以马铃薯试管苗为材料，可以采用液体PEG培养基测定抗旱性，但采用液体PEG培养基的具有如下缺陷：1)很难使供试材料保持直立，特别是体积微小的材料。2)液体PEG中，植物对模拟旱胁迫的生理反应是否与土壤旱胁迫下的生理反应是否一致，尚无研究。

[0005] 采用含PEG的MS固体培养基测试抗旱性，不受茎段大小的限制，试管苗茎段都可保持直立，茎叶与根都能正常生长，可看到胁迫条件下茎段生长的全过程，抗旱性特点表现充分。固体PEG中，试管苗对模拟旱胁迫及盐胁迫的生理反应与土壤旱胁迫下的生理反应一致，结果更具说服力。

[0006] 现有技术中有两种固体PEG培养基已经用于马铃薯试管苗的抗旱性测定：

[0007] 第一种：普通固体PEG培养基，是将PEG加入到普通MS培养基中，高压灭菌后冷却成为固体PEG培养基，此种培养基具有制备方法简单，材料接种方便的特点。但是如果培养基中PEG的浓度超过8％，会抑制琼脂凝胶的形成，也就是说不能通过该方法直接配制出高浓度固体PEG培养基。而低浓度普通固体PEG培养基上，不能表现出从胁迫见效到作用明显，直至完全抑制试管苗生长的完整表现，远远达不到测定马铃薯试管苗抗旱性的要求，特别是达不到抗旱性品种筛选的要求，因此该普通固体PEG培养基的应用受到了极大地限制。

[0008] 第二种：垂直渗透法固体PEG培养基。Van der Weele等(2000年)报道了一种新方法：在固体MS平板上加等体积PEG溶液，经过24h渗透平衡，倒掉液体并晾干后便可获得含不同浓度PEG的固体培养基。其原理是上层的PEG溶液渗入下层固体MS凝胶中，称之垂直渗透法，该法是配制高浓度PEG固体培养基的经典方法。但是垂直渗透法固体PEG培养基的缺点明显：1)培养基制作步骤复杂，所需时间长达24h或更长；2)容易出现培养基的污染；3)PEG的浓度在固体凝胶中从上到下呈梯度递减分布，试管苗根部感受的PEG浓度不均匀；4)培养基的单次制作占用超净台空间大，占用时间长，不能随做随用。

[0009] 国内外，马铃薯抗旱性机理及抗旱性改良的研究还比较薄弱，这与马铃薯抗旱性研究方法有效性差，特别是试管苗抗旱性测定方法不够简便有直接关系。直接用垂直渗透法固体PEG培养基研究试管苗抗旱性的报道很少，如Anithakumari等(2011)用垂直渗透法制作PEG固体培养基(渗透时间3d)，并进行了马铃薯试管苗的抗旱性测定；邓珍等(2014)用垂直渗透法制作的PEG固体培养基(渗透时间48h)，测定了11个品种株高等生长指标，并对相对指标值进行了聚类分析，未见该种培养基用于马铃薯试管苗抗旱性研究的其他报道。

[0010] 针对马铃薯试管苗，陆续有利用小于8％的低浓度PEG固体培养基或用甘露醇作为测定剂研究抗旱性的报道，即使是转基因苗也不用固体PEG直接测定其抗旱性，这都是高浓度普通固体PEG使用受限、垂直渗透法使用不便所导致的。因此对固体PEG培养基进行改进是非常有必要的。

发明内容

[0011] 为解决高浓度普通固体PEG使用受限、垂直渗透法使用不便的技术问题，本发明特别设计了一种水平渗透的固液两相PEG培养基。

[0012] 本发明的一种固液两相PEG培养基的制备方法，是在培养瓶底部配置固体MS培养基，高压灭菌后冷却形成固体凝胶，沿垂直方向移出部分固体凝胶，在培养瓶底部形成空缺，在所述空缺处加入含PEG的MS液体培养基，所述加入的含PEG的MS液体培养基的体积与移出的固体凝胶的体积相同。

[0013] 优选的，所述沿垂直方向移出部分固体凝胶是沿培养瓶直径移出一半体积的固体凝胶。

[0014] 优选的，所述含PEG的MS液体培养基中PEG的重量体积比浓度为0-25％。

[0015] 优选的，所述MS培养基中含2-4％蔗糖，0.6-1.5％琼脂粉，均为重量体积比。

[0016] 本发明的制备方法得到的固液两相PEG培养基应用于植物的抗旱性研究。

[0017] 进一步的，将本发明的固液两相PEG培养基应用于不同马铃薯品种试管苗抗旱性的测定。

[0018] 进一步的，将本发明的固液两相PEG培养基应用于不同马铃薯品种转基因试管苗抗旱性的测定。

[0019] 进一步的，将本发明的固液两相PEG培养基应用于不同马铃薯品种诱变所获试管苗抗旱性的测定。

[0020] 进一步的，本发明的固液两相PEG培养基的应用方法，是在培养瓶中沿垂直方向移出部分固体凝胶后，将试管苗接入固体MS培养基中，接入位置距离固液两相交界线0.3-0.6cm，然后再加入含PEG的MS液体培养基。

[0021] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明的制作方法简便，需要时间短，可以随做随用，操作参数容易复制；材料接种方便，可先接入材料，后注入PEG溶液；不易出现污染；不管外植体大小，其位置固定、姿势直立，可观察到生长全过程；PEG液体沿水平方向渗透，在凝胶中PEG无自上而下的浓度梯度，抗旱性测定结果更具说服力；PEG液相在培养基中存在时间长，其胁迫作用更持续有效；固体凝胶中PEG的有效浓度高(超过8％)，可以观察到由低到高不同浓度PEG胁迫下，外植体生长受胁迫特点的完整表现；可满足不同品种抗旱性测定与高抗旱性品种评价、筛选的需要，满足诱变育种与转基因育种中抗旱性测定与高抗旱性材料的鉴定与筛选的需要。

附图说明

[0022] 图1本发明的固液两相PEG培养基俯视图，×示意接种材料处；

[0023] 图2本发明的固液两相PEG培养基侧视图；

[0024] 图3实施例1中双丰5号品种抗旱性测定；

[0025] 图4实施例1中夏波蒂品种抗旱性测定；

[0026] 图5实施例1中大西洋品种抗旱性测定；

[0027] 图6实施例1中克新18品种抗旱性测定；

[0028] 图7实施例1中PEG胁迫对株高的影响；

[0029] 图8实施例1中PEG胁迫对根长的影响；

[0030] 图9实施例1中PEG胁迫对根数的影响；

[0031] 图10实施例1中PEG胁迫对鲜重的影响；

[0032] 图11实施例1中PEG胁迫对干重的影响；

[0033] 图12实施例2中转基因植株抗旱性的测定；

[0034] 图13实施例2中对照植株抗旱性的测定；

[0035] 图14实施例2中PEG胁迫对株高的影响；

[0036] 图15实施例2中PEG胁迫对鲜重的影响；

[0037] 图16实施例2中移栽苗抗旱性的测定，其中A：干旱处理前；B：干旱处理20天；C：浇水后第5天；D：浇水后第18天；1-3：转基因植株；4-5：对照(未转基因植株)。

具体实施方式

[0038] 下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。本发明所提到的比例，如果没有特别的标记，均以重量/体积比(％，W/V)为准，即100mL液体中含多少克固体。

[0039] 本发明的固液两相PEG培养基的制备方法，首先配制含3％蔗糖，0.8％琼脂粉，pH为5.8的固体MS培养基，在每个230mL玻璃培养瓶(直径6.5cm，高度9.5cm)中分装50mL，高压灭菌后冷却30-40min形成固体凝胶。沿培养瓶直径垂直切走一半凝胶，并在空缺处加入等体积的含PEG的MS培养液，所述含PEG的MS液体培养基中PEG的浓度为0-25％(W/V)，得到本发明的固液两相PEG培养基(如图1所示)。该培养基由固相MS凝胶与液相PEG溶液组成，各占培养基总体积的一半，是一种固液两相等体积PEG培养基。

[0040] 本发明的固液两相PEG培养基为水平渗透法固体PEG培养基，包括固相MS培养基和液相PEG培养液两部分，液体PEG水平方向渗入固体凝胶，固相培养基上可接入马铃薯试管苗茎段，进行抗旱性测定；该培养基具有普通固体培养基制作简单、所需时间短、茎段接种方便等特点，其应用将具有促进马铃薯抗旱性研究的很大潜力。

[0041] 本发明的固液两相PEG培养基的使用方法，是在培养瓶中沿垂直方向移出部分固体凝胶后，将试管苗接入固体MS培养基中，接入位置距离固液两相交界线0.3-0.6cm，优选为0.5cm，然后再加入含PEG的MS液体培养基。在制作与接种阶段，固液两相培养基测定法的使用很方便。与垂直渗透法相比，简化了操作程序、降低了制作难度，是一种明显的改进，该方法的应用将直接促进马铃薯抗旱性的研究的快速发展。

[0042] 采用本发明的固液两相培养基，茎段接入固相后，其生长全过程在PEG胁迫下进行，表现特点更具有代表性，可揭示系列PEG浓度下，株高等多个参数的系谱表现规律。

[0043] 本发明的固液两相PEG培养基可以应用于马铃薯等植物的抗旱研究，具体研究包括1)对不同马铃薯品种试管苗抗旱性的测定；2)不同马铃薯品种转基因试管苗抗旱性的测定；3)不同马铃薯品种诱变所获试管苗抗旱性的测定。

[0044] 实施例1

[0045] 下面通过实验验证固液两相PEG培养基能够应用于不同马铃薯品种试管苗抗旱性差异的测定。

[0046] 取四个不同品种的马铃薯在本发明的固液两相PEG培养基中的固相MS培养基上进行培养，配置几组含PEG的MS液体培养基，其中PEG的浓度分别为0％、5％、10％、15％、20％、25％，对试管苗的生长状态进行观察。所述四个品种的马铃薯分别为双丰5号、夏波蒂、大西洋及克新18。具体培养条件为：以生长健壮、高度与长势一致的马铃薯试管苗为材料，剪取长度约2cm含顶芽的茎段为外植体，在每瓶固相培养基中接入3个茎段，排列成行，位置距离固液两相交界线0.5cm。培养瓶用透气膜或瓶盖封口，培养条件为：25℃，光照16h/d，光照强度2000Lx。培养4周，观察植株的生长情况。取出植株，用水冲去根部琼脂凝胶，吸干表面水分，测定单株株高、根长、根数与鲜重，最后65℃下烘干后称取单株干重。

[0047] 如图3至图6所示为4个品种试管苗的形态观察结果，可以看出随着液相培养基中PEG浓度的升高，固相凝胶上试管苗的生长受到明显的抑制，表现为株高逐渐变矮，根长变短，生长量变小、生长势变弱，表明PEG可有效地渗入到固相凝胶中，试管苗的生长对PEG胁迫反应敏感。在PEG浓度为0％至25％的范围内，4个品种试管苗的生长从不受影响(0％)到生长停滞(25％)，有系统的表现，达到了抗旱性测定的要求，克服了低浓度PEG固体培养基揭示力不足的缺陷。对同一品种而言，可以明显揭示出PEG起效浓度、作用明显的浓度及完全抑制生长的浓度。观察还表明茎叶与根的生长对PEG敏感度不同(如图3)，固液培养基上表现出了丰富的生长信息。

[0048] 如图7至图11所示为4个品种试管苗的生长指标的测定结果，可更准确地体现株高与根长的变化规律(如图7，图8)；随着PEG浓度的提高，根数、鲜重与干重等生长指标也表现出逐步减小的变化规律(图9至图11)，也可作为抗旱性研究的指标。其中株高、根数与鲜重对PEG敏感，而根长与干重变化趋势和缓，对PEG的敏感性差(图7至图11)。

[0049] 形态观察与生长指标的测定结果可揭示出品种间多参数的差异，固液两相PEG培养基具有区分不同品种试管苗PEG胁迫敏感性的能力，也就是说具有揭示马铃薯试管苗抗旱性差异的能力。当PEG浓度为5％时，双丰5号的生长受到明显抑制，株高减少至对照处理(无PEG)的55％(图3，图7)，而其它品种生长正常。PEG浓度为10％时，4个品种试管苗的生长均受到抑制，但受抑制程度不同。PEG浓度为15％时，夏波蒂的生长受到较大影响(图4，图7至图11)；PEG浓度为20％时，夏波蒂停止生长(图4)；PEG浓度达到25％时，双丰5号和克新18也停止生长(图3，图6)，此时大西洋还有生长量。表1归纳了试管苗生长受PEG胁迫的程度，初步分析表明不同品种抗旱性大小的顺序为：大西洋>克新18>双丰5号>夏波蒂。

[0050] 表1 不同品种试管苗生长受PEG胁迫的程度

[0051]PEG浓度 双丰5号 夏波蒂 大西洋 克新18
0％ 正常 正常 正常 正常
5％ + 正常 正常 正常
10％ + + + +
15％ + +++ ++ ++
20％ +++ 不生长 ++ +++
25％ 不生长 不生长 +++ 不生长

[0052] 注：“+”表示受抑制的程度，加号越多表示抑制越明显

[0053] 实施例2

[0054] 本发明的固液两相PEG培养基还能够应用于转基因试管苗抗旱性的测定。

[0055] 在PEG模拟干旱测定中，以条斑紫菜海藻糖-6-磷酸海藻糖合成酶基因(TPS)转化马铃薯底西瑞(Desiree)品种获得的试管苗为材料，未转基因试管苗为对照，用本发明的固液两相PEG培养基进行胁迫培养，培养4周，观察植株的生长情况并测定株高、根长、根数、鲜重与干重等参数。缺水旱胁迫测定中，将转基因和未转基因Desiree马铃薯试管苗开盖驯化一周，并移栽至含营养土的纸杯中。植株高度达20cm时，进行20天的不浇水干旱胁迫，然后再浇水，观察记录植株的生长状况。

[0056] 测定结果表明，在固液两相PEG培养基上，植株生长受抑制程度不同，转基因植株的生长状况好于对照(图12，图13)。PEG浓度为5％时，转基因植株与对照的株高及鲜重差异达极显著水平，PEG浓度为10％时，差异达显著水平(图14，图15)，表明转基因植株抗PEG胁迫能力高于对照植株。

[0057] 在不浇水的旱胁迫中，干旱处理20天时，转基因植株萎蔫程度小于对照(图16-B)；浇水后5天，植株萎蔫程度不见缓解，仍有加重的趋势(图16-C)；浇水培养至18天，转基因植株长出新叶，顶端逐渐变绿，而对照植株枯萎程度继续加重(图16-D)；结果表明转基因植株抗旱性明显高于对照。

[0058] 转基因植株抗PEG胁迫能力的提高与其抗旱性提高相符合，进一步表明PEG是适合马铃薯试管苗抗旱性研究的测定剂，固液两相PEG培养基可有效地用于马铃薯试管苗抗旱性的测定。

[0059] 本发明的固液两相培养基可满足成对材料的抗旱性对比研究。在转基因植株与对照、诱变材料与供体抗旱性对比中，可替代垂直渗透法配制的固体培养基，迅速获得结果，实现早期筛选与鉴定，达到普通固体培养基的效果。

[0060] 该培养基不仅用于马铃薯试管苗抗旱性鉴定，也可用于其他植物来源的试管苗，特别是无性繁殖植物，适用材料广泛，应用潜力较大，具有促进植物抗旱性研究的巨大应用潜力。

[0061] 本发明使用常规操作的方法制备出了固液两相PEG培养基，且成功应用于马铃薯品种间抗旱性测定区分与转基因植株抗旱性测定，其制作方法有很大的可塑性，改变培养瓶形状或使用专用模具可提高其制作效率，并优化测定效果，有潜力逐渐达到普通固体培养基的方便性与适用性。

[0062] 以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。