一种中华桫椤绿色球状体途径的组培繁殖方法

摘要

本发明公开一种中华桫椤绿色球状体途径的组培繁殖方法。该方法包括无菌外植体的获得、绿色球状体的诱导，其诱导通过两个诱导预培养基培养后再经绿色球状体诱导培养基培养，得到绿色球状体，之后，经两个增殖培养基交替培养，再经分化培养、生根培养获得组培苗。本发明成功诱导出树状木本蕨类植物绿色球状体，繁殖效率高，其绿色球状体诱导率达82～88％，增殖倍数达7.5～9.3倍，绿色球状体的分化率达100％，生根率达100％，繁殖周期短，对于珍稀濒危蕨类中华桫椤种群数量的扩大，以及对濒危程度的缓解具有重要意义，同时实现了濒危物种种质资源的离体保存。

权利要求

1.一种中华桫椤绿色球状体途径的组培繁殖方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)中华桫椤无菌外植体的获得

将中华桫椤无菌孢子接种在1/4MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80的培养基上，培养条件为：20～25℃、每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx，得到无菌苗，在超净工作台，将无菌苗在解剖镜下用镊子剥离出茎尖，将茎尖作为中华桫椤绿色球状体诱导的无菌外植体；

(2)中华桫椤绿色球状体的诱导

①第一次诱导预培养：将步骤(1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅰ，培养5天～7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅰ为：1/4MS～1/2MS+6-BA 

1.0～2.0mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

②第二次诱导预培养：将步骤(2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅱ，培养时间为5天～7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅱ为：1/4MS～1/2MS+2-ip 0.1～0.3mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂

7.0g/L，pH为5.80；

③绿色球状体的诱导：将步骤(2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导培养基，培养条件与步骤(1)相同，培养时间为14天～20天，得到绿色球状体，所述绿色球状体诱导培养基为：1/4MS～1/2MS+2-ip 0.5～0.8mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

(3)中华桫椤绿色球状体的增殖

每一个增殖周期按以下步骤进行：

①第一步增殖培养：将步骤(2)③获得的绿色球状体切割成1～3mm，接种于增殖培养基A，培养21天～22天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基A为：1/4MS～1/2MS+TDZ 0.8～1.0mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

②第二步增殖培养：将(3)①第一步增殖培养增殖后的绿色球状体接种于增殖培养基B，培养21天～22天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基B为：1/4MS～1/2MS+2-ip 

0.1～0.2mg/L+6-BA 1.0～1.2mg/L+NAA 0.05～0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为

5.80；

(4)中华桫椤绿色球状体的分化

将步骤(3)②第二步增殖培养增殖后的绿色球状体分割为直径1～3mm的球状体，接种于分化培养基，培养28天～29天，得到分化幼苗，培养条件与步骤(1)相同，所述分化培养基为：1/6MS～1/4MS+活性炭1～2g/L+水解酪蛋白200～300mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

(5)生根培养

将步骤(4)得到的分化幼苗接种于生根培养基，分化幼苗生根后即为中华桫椤组培苗，培养条件与步骤(1)相同，所述生根培养基为：1/2MS+活性炭1～2g/L+水解酪蛋白200～

300mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂浓度7.0g/L，pH为5.80。

说明书

一种中华桫椤绿色球状体途径的组培繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明属植物组织培养技术领域，具体涉及中华桫椤绿色球状体诱导和增殖方法。技术背景

[0002] 中华桫椤(Alsophila costularis)隶属于桫椤科桫椤属(木桫椤属)。地上茎直立，树状，可高达10m，是为数不多的木本蕨类植物。

[0003] 桫椤科植物最早出现于中生代的早侏罗纪或晚三叠纪，是恐龙同时代的物种。后来由于地质变迁和气候变化，大量种类灭绝，最后仅存于热带和亚热带中某些气候特别适宜的“避难所”，因此被称为植物界的“孑遗植物”、“活化石”。中华桫椤以及桫椤科的所有种均列为国家二级重点保护野生植物《国家重点保护野生植物名录(第一批)》。

[0004] 自然条件下，中华桫椤采用孢子进行繁殖，但孢子萌发和配子体发育对环境条件的要求较为严格，导致中华桫椤的自然繁殖能力极低，加之环境破坏和人为采掘，中华桫椤的野生种群数量急剧减少，已濒临灭绝。

[0005] 目前，中华桫椤的组织培养仅局限于孢子繁殖途径，其方法主要包括：孢子培养、原叶体培养、原叶体增殖、孢子体培养等步骤，存在繁殖周期长、繁殖效率低等缺陷，因此，寻找一种繁殖周期短且繁育效率高的方法，对于珍惜濒危蕨类—中华桫椤种群数量的扩大，以及濒危程度的缓解具有重要意义。

[0006] 蕨类植物绿色球状体是指由蕨类植物外植体诱导得到的由众多绿色颗粒组成的球状体，其本质是分生组织集合体，接种于分化培养基上可以获得大量蕨类植物幼苗，一旦诱导得到绿色球状体，其繁殖系数将显著高于孢子繁殖途径，且繁殖周期缩短。

[0007] 由于外植体选择以及适宜的植物激素筛选方面的原因，目前，已经成功诱导绿色球状体的种类较为有限，且在绿色球状体增殖过程中，只有选择适宜的植物激素配方和培养方式，才能在抑制绿色球状体分化的同时实现快速增殖。因此，目前，尚无中华桫椤等大型树状木本蕨类植物通过绿色球状体途径组培繁殖研究的相关报道。

发明内容

[0008] 本发明要解决的技术问题是克服中华桫椤自然繁殖力低、通过孢子繁殖途径组培繁殖周期较长，且繁殖系数较低等技术问题。

[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供一种中华桫椤绿色球状体途径的组培繁殖方法，该方法包括以下步骤：

[0010] (1)中华桫椤无菌外植体的获得

[0011] 将中华桫椤无菌孢子接种在1/4MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80的培养基上，培养条件为：20～25℃、每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx，得到无菌苗，在超净工作台，将无菌苗在解剖镜下用镊子剥离出茎尖，将茎尖作为中华桫椤绿色球状体诱导的无菌外植体；

[0012] (2)中华桫椤绿色球状体的诱导

[0013] ①第一次诱导预培养：将步骤(1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅰ，培养5天～7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅰ为：1/4MS～1/2MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L++蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

[0014] ②第二次诱导预培养：将步骤(2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅱ，培养时间为5天～7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅱ为：1/4MS～1/2MS+2-ip 0.1～0.3mg/L+NAA0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

[0015] ③绿色球状体的诱导：将步骤(2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导培养基，培养条件与步骤(1)相同，培养时间为14天～20天，得到绿色球状体，所述绿色球状体诱导培养基为：1/4MS～1/2MS+2-ip 0.5～0.8mg/L+NAA0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

[0016] (3)中华桫椤绿色球状体的增殖

[0017] 每一个增殖周期按以下步骤进行：

[0018] ①第一步增殖培养：将步骤(2)③获得的绿色球状体切割成1～3mm，接种于增殖培养基A，培养21天～22天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基A为：1/4MS～1/2MS+TDZ 0.8～1.0mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

[0019] ②第二步增殖培养：将(3)①第一步增殖培养增殖后的绿色球状体接种于增殖培养基B，培养21天～22天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基B为：1/4MS～1/2MS+2-ip 0.1～0.2mg/L+6-BA 1.0～1.2mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

[0020] (4)中华桫椤绿色球状体的分化

[0021] 将步骤(3)②第二步增殖培养增殖后的绿色球状体分割为直径1～3mm的球状体，接种于分化培养基，培养28天～29天，得到分化幼苗，培养条件与步骤(1)相同，所述分化培养基为：1/6MS～1/4MS+活性炭1～2g/L+水解酪蛋白200～300mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

[0022] (5)生根培养

[0023] 将步骤(4)得到的分化幼苗接种于生根培养基，分化幼苗生根后即为中华桫椤组培苗，培养条件与步骤(1)相同，所述生根培养基为：1/2MS+活性炭1～2g/L+水解酪蛋白200～300mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂浓度7.0g/L，pH为5.80。

[0024] 本发明的创新点：

[0025] 1、成功诱导出了大型树状木本蕨类植物中华桫椤的绿色球状体，绿色球状体的诱导率达82～88％。

[0026] 本发明通过大量实验，筛选出了适宜大型树状木本蕨类植物中华桫椤的两个绿色球状体诱导预培养基和一个绿色球状体诱导培养基。并设计了两次诱导预培养和一次诱导培养步骤，成功诱导出了中华桫椤绿色球状体，并且绿色球状体的诱导率达82～88％。

[0027] 2、增殖培养上，筛选出A和B两个增殖培养基，并设计每一个增殖周期依次用A和B两个增殖培养基，既有效地抑制了增殖过程出现的分化现象，又取得了增殖倍数达到7.5～9.3倍特别显著的技术效果，在不发生分化的前提下实现高效增殖，同时保持了较高的增殖速率。需进行几个周期的增殖培养，可根据生产上需要的种苗数量确定。本发明在研究过程中发现，仅采用增殖培养基A，可抑制分化，但增殖倍数较低，而仅采用增殖培养基B，增殖倍数较高但出现分化现象，而按本发明方法所述依次用增殖培养基A和增殖培养基B交替进行的增殖培养，既抑制了增殖过程出现的分化现象，又可实现了高效增殖的技术效果。而且有利于中华桫椤绿色球状体作为中间繁殖体的增殖以及保存。

[0028] 通过本发明的创新，与现有技术相比，本发明具有如下益效果：

[0029] 1、成功诱导出树状木本蕨类植物绿色球状体，并且繁殖效率特别高，对于我国二级重点保护的珍惜濒危蕨类—中华桫椤种群数量的扩大，以及濒危程度的缓解具有重要意义。

[0030] 本发明方法使绿色球状体诱导率、绿色球状体增殖速率、绿色球状体分化率、单个绿色球状分化苗数、以及分化苗培养成组培苗的效率均特别高，其绿色球状体的诱导率为82～88％，绿色球状体的增殖倍数达7.5～9.3倍，绿色球状体的分化率100％，生根率
100％，组培苗的形成率100％，因此，本发明繁殖效率特别高。而现有孢子繁殖途径的孢子萌发率为34.33％，原叶体簇增殖2～3倍，孢子体幼苗成苗率为24.00％。与现有的孢子途径繁殖相比，本发明的繁殖效率产生了预料不到的技术效果。

[0031] 2、繁殖周期短

[0032] 本发明诱导出绿色球状体后，即可以绿色球状体作为中间繁殖材料，高效培育出大量组培苗，无需再重复从孢子开始培养，因此，繁殖周期短。以绿色球状体为中间繁殖材料计算，繁殖周期为98天～101天，而现有的孢子途径繁殖，每次繁殖均需从孢子萌发开始繁殖，其繁殖周期需217天～252天，本发明与常规孢子繁殖途径的繁殖方法相比缩短了119～151天，繁殖周期缩短了54.8～59.9％。

[0033] 3、实现了濒危物种种质资源的离体保存

[0034] 通过本发明提供的方法得到的中华桫椤绿色球状体以及中华桫椤组培苗可作为种质资源进行保存，对于实现珍稀濒危蕨类—中华桫椤种质资源离体保存具有重要意义。

附图说明

[0035] 图1是中华桫椤绿色球状体。图中的线段为比例尺，表示的长度为1mm。

[0036] 图2是开始分化的中华桫椤绿色球状体。图中的线段为比例尺，表示的长度为1mm。

[0037] 具体实施方法

[0038] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料均为市售。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0039] 以下各实施例培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含量混合后，用pH计调pH为该培养基要求的pH值即制成。

[0040] 实施例1本发明方法

[0041] (1)中华桫椤无菌外植体的获得

[0042] 将中华桫椤无菌孢子接种在1/4MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80的培养基上，培养条件为：20～25℃、每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx，得到幼嫩的无菌苗。在超净工作台中，将得到的无菌苗在解剖镜下用镊子剥离出茎尖，将茎尖作为中华桫椤绿色球状体诱导的无菌外植体。

[0043] 中华桫椤无菌孢子的获得方法为：将10mg孢子置于1.5ml离心管中，用无菌水浸泡1～2小时，6000r/min离心2min，获得孢子沉淀物，加入体积分数为5％NaClO溶液灭菌4min，无菌水清洗3-5次即得中华桫椤无菌孢子。

[0044] (2)中华桫椤绿色球状体的诱导

[0045] ①第一次诱导预培养：将步骤(1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅰ中，培养7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅰ为：1/4MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；接种数50个茎尖。

[0046] ②第二次诱导预培养：将步骤(2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅱ中，培养时间为7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅱ为：1/4MS+2-ip 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。

[0047] ③绿色球状体的诱导：将步骤(2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导培养基中，培养时间为14天，培养条件与步骤(1)相同，得绿色球状体，所述绿色球状体诱导培养基为：1/4MS+2-ip 0.8mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。

[0048] 经诱导预培养和诱导培养后，中华桫椤的茎尖膨大形成绿色球状体，绿色球状体的诱导率为88.00％。

[0049] 诱导率＝(产生绿色球状体的无菌苗数/接种的无菌外植体数)×100％。

[0050] (3)中华桫椤绿色球状体的增殖

[0051] 每一个增殖周期按以下步骤进行增殖培养：

[0052] ①第一步增殖培养：将步骤(2)③获得的绿色球状体切割成2mm，接种于增殖培养基A上，培养21天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基A为：1/2MS+TDZ 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。该2mm绿色球状体的鲜重为10mg，接种数50个绿色球状体。

[0053] ②第二步增殖培养：将(3)①第一步增殖培养增殖后的绿色球状体接种于增殖培养基B上，培养21天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基B为：1/2MS+2-ip 0.2mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。

[0054] 绿色球状体每21天的平均鲜重增加量为75mg,增殖倍数约为7.5倍，且增殖过程中未出现绿色球状体分化现象。每个增殖培养周期按上述顺序进行，需进行几个周期的增殖培养，根据生产上需要的组培苗数量确定。

[0055] (4)中华桫椤绿色球状体的分化

[0056] 将步骤(3)②第二步增殖培养增殖后的绿色球状体分割为直径2mm的球状体，接种于分化培养基上，培养28天，得到分化幼苗，培养条件为与步骤(1)相同；所述的分化培养基为：1/6MS+活性炭1g/L+水解酪蛋白200mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。

[0057] 接种数了50个绿色球状体，平均分化率为100％。

[0058] 分化率＝(发生分化的绿色球状体数量/接种的绿色球状体的数量)×100％。

[0059] (5)生根培养

[0060] 将步骤(4)得到的分化幼苗接种于生根培养基上培养，分化幼苗生根后即为中华桫椤组培苗，培养条件为与步骤(1)相同，所述生根培养基为：1/2MS+活性炭1g/L+水解酪蛋白200mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂浓度7.0g/L，pH为5.80。

[0061] 培养4周，中华桫椤组培苗的平均高度达2.87cm。分化幼苗全部生根成活形成组培苗，生根率100％，即组培苗的形成率100％。

[0062] 实施例2和实施例3均为本发明方法

[0063] 实施例2和实施例3除表1所列各培养基中各成分的浓度不同外，其余措施均与实施例1相同，不再赘述。

[0064] 表1实施例2-实施例3各步骤与实施例1的区别

[0065]

[0066]

[0067] 实施例1的繁殖结果：绿色球状体的诱导率为88％，分化率100％，生根率100％，即组培苗的形成率100％，生根培养28天，组培苗的平均高度2.87cm。直径为2mm的绿色球状体鲜重10mg，绿色球状体每21天平均鲜重增加75mg，增殖倍数约为7.5倍。以获得的绿色球状体为中间繁殖体，经两步增殖培养供42天、分化培养28天、生根培养形成组培苗28天、繁殖时间供98天。

[0068] 实施例2的繁殖结果：绿色球状体的诱导率为85.33％，分化率100％，生根率100％，即组培苗的形成率100％，生根培养28天，组培苗的平均高度3.10cm。直径为1mm的绿色球状体鲜重5mg，绿色球状体每21天平均鲜重增加46.67mg，增殖倍数约为9.3倍。以获得的绿色球状体为中间繁殖体，经两步增殖培养供44天、分化培养29天、生根培养形成组培苗
28天、繁殖时间供101天。

[0069] 实施例3的繁殖结果：绿色球状体的诱导率为82％，分化率100％，生根率100％，即组培苗的形成率100％，生根培养28天，组培苗的平均高度2.70cm。直径为2mm的绿色球状体鲜重10mg，绿色球状体每21天平均鲜重增加83.67mg，增殖倍数约为8.4倍。以获得的绿色球状体为中间繁殖体，经两步增殖培养供42天、分化培养28天、生根培养形成组培苗28天、繁殖时间供98天。

[0070] 一个1～3mm的绿色球状体一次分化可获得20～25株组培苗。

[0071] 实施例4对照

[0072] 实施例4为现有的孢子繁殖途径的繁殖方法，步骤如下：

[0073] (1)中华桫椤孢子消毒

[0074] 将12mg中华桫椤孢子置于1.5ml离心管中，用无菌水浸泡1-2小时，6000r/min离心2min，获得孢子沉淀物，加入体积分数为5％NaClO溶液灭菌4min，无菌水清洗3-5次即得中华桫椤无菌孢子。

[0075] (2)中华桫椤孢子萌发培养

[0076] 将步骤(1)获得的中华桫椤无菌孢子接种于1/4MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80，接种数量为10瓶，20～25℃培养，每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx。

[0077] 培养6周后，孢子开始萌发，萌发率约为34.33％，继续培养9～10周后，形成原叶体簇。萌发率＝萌发的孢子数/接种的孢子数×100％。

[0078] (3)中华桫椤原叶体增殖培养

[0079] 将步骤(2)中获得的原叶体簇分成小块，继续接种于1/4MS+蔗糖30.0g/L，琼脂7.0g/L，pH为5.80，接种数量为50块，培养条件同步骤(1)。培养4周后，原叶体簇增殖2～3倍。

[0080] 将增殖后的原叶体簇分成小块，继续接种于1/4MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80，接种数量为50块，并在原叶体上滴加适量的无菌水，以促进孢子体的形成，培养条件同步骤(1)。

[0081] 培养8～12周后，逐渐有孢子体幼苗形成，孢子体幼苗成苗率为30.67％。孢子体幼苗成苗率＝产生孢子体幼苗的原叶体数/接种的原叶体数×100％。

[0082] (4)中华桫椤孢子体幼苗的培养

[0083] 将步骤(3)中获得的孢子体幼苗接种于1/2MS+活性炭2g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。

[0084] 培养4周后即成组培苗，中华桫椤组培苗的平均高度为2.57cm。

[0085] 对照实施例4表明：孢子萌发培育时间42天，形成原叶体时间63～70天，增殖培养时间28天，孢子体形成的培育时间为56天～84天，培育出组培苗时间28天，因此，孢子繁殖途径的组培快繁，从孢子萌发至培育成组培苗需217天～252天。孢子萌发率为34.33％，原叶体簇增殖2～3倍，孢子体幼苗成苗率为24.00％。现有的孢子途径繁殖，每次繁殖均需从孢子萌发开始繁殖，因此，每次繁殖周期均需217天～252天。

[0086] 上述实施例1至-实施例3表明：本发明绿色球状体的诱导率为82～88％，绿色球状体的增殖倍数达7.5～9.3倍，绿色球状体的分化率100％，生根率100％，组培苗的形成率100％，因此，繁殖效率特别高。本发明诱导出绿色球状体后，即可以绿色球状体作为中间繁殖材料，高效培育出大量组培苗，无需再重复从孢子开始培养，因此，繁殖周期短。以绿色球状体为中间繁殖材料计算，繁殖周期为98天～101天。