丝胶蛋白包裹的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的制备方法

摘要

本发明涉及天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米药物载体及其制备方法和在肿瘤治疗领域的应用，其制备方法包括：制备纯丝胶蛋白固体；制备介孔硅纳米颗粒；制备具有规则孔道的氨基化、醛基化或双硫化介孔硅纳米颗粒；制备负载药物的氨基化、醛基化或者双硫化介孔硅纳米颗粒；制备pH/蛋白酶或还原/蛋白酶双响应性的丝胶/介孔硅复合型多功能控制体系。本发明操作简单，原料获得方式简便，成本低廉，普遍适用，无需特殊复杂设备等。使用该方法所制备的纳米复合体系，充分利用了外层丝胶蛋白和内层介孔硅纳米粒子的特性，具有pH/蛋白酶或者还原/蛋白酶双重响应性，具备抑制肿瘤细胞，实时监测纳米粒子定位和药物释放等多重功能，且载药量高，生物相容性好，在肿瘤诊疗领域特别是在解决肿瘤的多重耐药性方面具备广阔的应用前景。

权利要求

1.丝胶蛋白包裹的具有pH/蛋白酶双重响应的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：（1）称取蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，溶解后的丝胶液再经过3500 Da的透析袋透析、冻干即得到纯丝胶蛋白固体；其中所述的高温碱提法是将剪碎后的蚕茧浸没在0.01-

0.05M的碳酸钠溶液中，100摄氏度溶解30-60分钟；

（2）利用溶胶凝胶及表面活性剂模板法制备介孔硅纳米颗粒；

（3）将步骤（2）中所得介孔硅纳米颗粒分散于甲醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应得到表面氨基化的介孔硅纳米颗粒；

（4）将步骤（3）中的表面氨基化的介孔硅纳米颗粒置于甲醇和盐酸的混合液中回流洗脱模板，洗脱模板后离心即得到具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米颗粒；

（5）将步骤（4）中的具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米颗粒分散于浓度为2.5wt%的戊二醛水溶液中，室温避光搅拌24小时，而后离心收集产物，然后用双蒸水清洗多次后，得到醛基化的介孔硅纳米颗粒；其中氨基化介孔硅纳米颗粒与戊二醛水溶液的质量体积比为

100 mg : 10 mL；

（6）将步骤（4）中所得的氨基化介孔硅纳米颗粒或步骤（5）中所得的醛基化介孔硅纳米颗粒与药物混合反应，得到负载药物的氨基化或者醛基化介孔硅纳米颗粒；

（7）通过负载药物的醛基化介孔硅纳米颗粒中表面的醛基与步骤（1）得到的纯丝胶蛋白上的氨基反应，或直接利用静电作用将丝胶蛋白包裹在氨基化介孔硅纳米颗粒表面，即得到丝胶蛋白包裹的具有pH/蛋白酶双重响应的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒；其中所述通过负载药物的醛基化介孔硅纳米颗粒中表面的醛基与步骤（1）得到的纯丝胶蛋白上的氨基反应的具体步骤如下：将步骤（1）得到的纯丝胶蛋白固体加水制备成5 - 10 mg/mL丝胶蛋白水溶液，将丝胶蛋白水溶液加入步骤（6）所得的负载药物的醛基化介孔硅纳米颗粒中，避光35摄氏度搅拌6-7小时；而后离心收集产物；然后用双蒸水冲洗产物，置于冷冻真空干燥机中冻干即获得粉末状的纳米颗粒，其中介孔硅纳米粒与纯丝胶蛋白的质量比为1 : 

0.5 – 1 : 2。

2.丝胶蛋白包裹的具有还原/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：（1）称取蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，溶解后的丝胶液再经过3500 Da的透析袋透析、冻干即得到纯丝胶蛋白固体；其中所述的高温碱提法是将剪碎后的蚕茧浸没在0.01-

0.05M的碳酸钠溶液中，100摄氏度溶解30-60分钟；

（2）利用溶胶凝胶及表面活性剂模板法制备介孔硅纳米颗粒；

（3）将步骤（2）中所得介孔硅纳米颗粒根据质量体积比1 g : 83 mL分散于甲醇中，加入巯丙基三甲氧基硅烷，即得到巯基化的介孔硅纳米颗粒；其中甲醇与巯丙基三甲氧基硅烷的体积比为36 : 1；

（4）将步骤（3）中的200 mg巯基化的介孔硅纳米颗粒分散于30 mL甲醇中，加入200 mg（2-氨基乙巯基）-2-巯基吡啶，室温搅拌24小时后，离心收集产物，用甲醇和双蒸水清洗数次后冻干，得到双硫化的介孔硅纳米颗粒；

（5）将步骤（4）中的双硫化介孔硅纳米颗粒置于甲醇和盐酸的混合液中回流，洗脱模板后即得到具有规则孔道的双硫化介孔硅纳米颗粒；

（6）将步骤（5）得到的具有规则孔道的双硫化介孔硅纳米颗粒与药物混合反应，即可得到负载药物的双硫化介孔硅纳米颗粒；

（7）将步骤（6）得到的负载药物的双硫化介孔硅纳米颗粒表面的氨基与步骤（1）得到的纯丝胶蛋白上的羧基反应，使得丝胶蛋白包裹于介孔硅纳米粒表面，即得到丝胶蛋白包裹的具有还原/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒；所述将负载药物的双硫化介孔硅纳米颗粒表面的氨基与步骤（1）得到的纯丝胶蛋白上的羧基反应具体步骤如下：将步骤（1）得到的纯丝胶蛋白固体加水制备成5 - 10 mg/mL丝胶蛋白水溶液，依次加入1-​(3-​二甲氨基丙基)​-​3-​乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基丁二酰亚胺，室温反应2-3小时后，将该溶液加入步骤（6）所得的负载药物的双硫化介孔硅纳米颗粒中，避光35摄氏度反应6 - 

24小时；而后离心收集产物；然后用双蒸水冲洗产物，置于冷冻真空干燥机中冻干即获得粉末状的天然丝胶蛋白包裹的具有还原/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒；

丝胶蛋白与1-​(3-​二甲氨基丙基)​-​3-​乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1 : 6，丝胶蛋白与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为1 : 3，介孔硅纳米粒与纯丝胶蛋白的质量比为2 : 1。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述药物为抗癌药物、激素或抗生素。

说明书

丝胶蛋白包裹的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的制备

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医用复合材料领域，特别涉及多种天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米药物载体及其制备方法和在肿瘤治疗领域的应用。

背景技术

[0002] 随着纳米科学技术的飞速发展，各种各样的有机或无机材料被制成纳米结构用于生物医学领域，尤其是利用纳米材料作为药物载体用于疾病治疗得到了越来越广泛的关注。介孔二氧化硅纳米粒子 （Mesoporous silica nanoparticles, MSN）作为一种具有蜂窝状多孔结构的固体材料，具有很多优良的结构特征，如极大的比表面积及孔容积，均一可控的介孔尺寸的孔洞，稳定的理化性质，简易的内外表面修饰以及良好的生物相容性。因此，大量的研究致力于利用介孔硅纳米粒子作为主体用来负载一些客体分子以达到疾病诊疗的目的。

[0003] 为了实现药物在到达靶部位之前的“零释放”，同时使载药系统具有环境刺激响应性，让纳米粒子能够更多的在靶部位富集并且达到药物控释，研究者们在介孔硅表面设计了各种各样的“阀门”，将一些无机纳米粒子，聚合物或者生物大分子通过物理作用或者一些特殊的化学键结合到介孔硅表面，使其具备pH响应、酶响应、热响应、还原响应、光响应等，甚至多重响应特性。更进一步地，为了实现控释系统的多功能化，不少研究者通过负载或者表面修饰一些磁性纳米粒子，量子点或者荧光基团，从而构建出诊疗一体化的多功能智能控释系统。然而大部分的“阀门”设计过程繁琐，且单一的“阀门”设计往往难以达到多重响应的目的。另外，一些“阀门”原料比如金属纳米粒，由于不可生物降解，存在于体内可能产生短期或长期毒性，阻碍了将材料真正应用于人体内的进程。

[0004] 丝胶蛋白（Silk Sericin）是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白，约占蚕茧含量的20% - 30%，由分子量为24 - 400 kDa的多肽组成，其分子由丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸等18种氨基酸组成。长期以来由于人们对丝胶蛋白认识的不足和研究的局限性，导致丝胶在缫丝工业中被当作废物处理，浪费了大量宝贵的天然资源。近年来人们发现丝胶蛋白具有保湿、抗菌、抗氧化、抗凝血以及促进细胞粘附和增殖等生物特性，同时，丝胶具有亲水性和可降解性，可以用于生物医用材料领域。目前，已经有研究团队将丝胶蛋白与其他高分子材料如明胶、聚乙烯醇、羟甲基纤维素、聚丙烯酰胺等简单混合，或者直接利用纯丝胶蛋白制备成薄膜、生物支架等应用于组织工程领域，显示出了很好的应用前景。但目前没有任何报道使用丝胶蛋白包裹介孔硅制备药物递送系统。

[0005] 本发明采用高温碱提法成功提取蚕茧中的丝胶蛋白，通过静电作用或利用化学键（亚胺键或双硫键等）连接首次将丝胶蛋白包裹于介孔二氧化硅表面，成功地制备了具有良好生物相容性，较高载药量，兼具pH、酶以及还原等多重响应性，且具有荧光特性的多功能智能控释体系，可用于抗肿瘤治疗，特别是针对耐药性肿瘤细胞产生了很好的杀伤效果，并可通过荧光设备进行实时监控，可达到诊疗一体化的目的。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的问题是提供多种天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米药物载体及其制备方法和应用，该方法制备得到的天然丝胶蛋白包裹的介孔硅纳米载体具有良好的生物相容性和较高的载药量，且丝胶本身具有细胞粘附性，能很好地被肿瘤细胞吞噬，且通过细胞内溶酶体的pH/蛋白酶环境或者胞内谷胱甘肽的还原性触发药物释放，以达到杀伤肿瘤的目的。同时，由于丝胶蛋白的荧光特性使得纳米载体本身带有黄绿色荧光，可以实时监控纳米粒的定位及药物的释放，达到诊疗一体化的目的。

[0007] 本发明旨在利用丝胶蛋白作为“阀门”包封载药介孔二氧化硅纳米粒子构建出兼具pH/蛋白酶或者还原/蛋白酶等多重响应性的多功能复合型药物控释系统。本发明所需实验装置简单，操作过程简便，成本低廉。利用本方法所制备而成的丝胶/介孔硅复合纳米材料具有良好的生物相容性和较高的载药量，且丝胶本身具有细胞粘附性，能很好地被肿瘤细胞吞噬，且通过细胞内溶酶体的pH/蛋白酶环境或者胞内谷胱甘肽的还原性能触发药物释放，以达到杀伤肿瘤的目的。同时，由于丝胶蛋白的荧光特性使得纳米载体本身带有黄绿色荧光，可以实时监控纳米粒的定位及药物的释放，达到诊疗一体化的目的。

[0008] 为达到上述目的，本发明提供的丝胶/介孔硅复合型多功能药物控释体系的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 一、pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型多功能控制体系

[0010] （1）称取蚕茧，用高温碱提法提取丝胶蛋白，再经过透析、冻干即可得到纯丝胶蛋白固体；

[0011] （2）利用溶胶凝胶及表面活性剂模板法制备介孔硅纳米颗粒；

[0012] （3）将步骤（2）中所得介孔硅纳米颗粒分散于溶剂中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,得到表面氨基化的介孔硅纳米颗粒；

[0013] （4）将步骤（3）中的氨基化的介孔硅纳米颗粒置于甲醇/盐酸的混合液中回流，洗脱模板后即得到具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米颗粒；

[0014] （5）将步骤（4）中的氨基化介孔硅纳米粒子与戊二醛混合反应，得到醛基化的介孔硅纳米粒子；

[0015] （6）将步骤（4）中所得的氨基化介孔硅纳米颗粒或步骤（5）中所得的醛基化介孔硅纳米粒子与药物混合反应，得到负载药物的氨基化或者醛基化介孔硅纳米颗粒；

[0016] （7）通过介孔硅纳米粒中表面的醛基与丝胶蛋白上的氨基反应，或直接利用静电作用将丝胶蛋白包裹在介孔硅纳米颗粒表面，即得到pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型多功能药物控释体系。

[0017] 所述步骤（1）中选用的蚕茧为正常家蚕蚕茧品种（白玉等）、家蚕丝素缺失型突变品种（185 Nd-s, 140 Nd-s, 139 Nd-s等）或柞蚕蚕茧的一种，购自中国农业科学院蚕业研究所。

[0018] 进一步地，提取丝胶蛋白的具体过程包括：

[0019] 1）称取适量蚕茧，剪成1 cm2左右的碎片；

[0020] 2）将剪碎后的蚕茧浸没在0.01 - 0.05 M碳酸钠中，100摄氏度溶解30 - 60分钟；

[0021] 3）将溶解后的丝胶液转移至3500 Da的透析袋中，放入双蒸水中透析48小时；

[0022] 4）将透析袋中的溶液转移至50 mL离心管中，离心后收集上清液，置于冷冻冻干机中冻干后可得到粉末状的丝胶蛋白，置于-20摄氏度可长期保存。

[0023] 所述步骤（2）的介孔硅纳米粒子是以十六烷基三甲基溴化铵作为模板，正硅酸四乙酯作为有机硅前体，氢氧化钠作为碱催化剂所制得。具体地，将十六烷基三甲基溴化铵分散于双蒸水中（质量体积比为1 g : 480 mL），再加入氢氧化钠（模板质量的28%），加热搅拌至80摄氏度，缓慢逐滴加入正硅酸四乙酯（模板质量的5倍），持续搅拌2 - 3小时后，得到白色介孔硅纳米粒子混浊液，离心收集沉淀，甲醇和双蒸水清洗后用真空冷冻干燥机冻干，即可得到白色粉末状带有模板的介孔硅纳米粒子。

[0024] 所述步骤（3）中选用3-氨丙基三乙氧基硅烷实现介孔硅纳米粒子的氨基化，具体过程是指将步骤（2）所得的介孔硅纳米粒子根据质量体积比1 g : 75 mL分散于甲醇中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌24小时后，离心收集即得到氨基化的介孔硅纳米粒子。本步骤中所用的溶剂甲醇与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为75 : 2。

[0025] 所述步骤（4）中选用甲醇/浓盐酸混合溶液洗脱所述步骤（3）所得产物中的模板十六烷基三甲基溴化铵，得到具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米粒子。具体地，是将步骤（3）中所得的氨基化介孔硅纳米粒子分散于甲醇/浓盐酸（体积比为16 : 1）混合液中，80摄氏度中回流48小时后，即可有效洗脱模板十六烷基三甲基溴化铵，而后离心即可获得具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米颗粒。

[0026] 所述步骤（5）中选用戊二醛实现介孔硅纳米粒子的醛基化。具体地，所用的戊二醛水溶液浓度为2.5wt%，选用的氨基化介孔硅纳米粒子与2.5%戊二醛水溶液的质量体积比为100 mg : 10 mL。更进一步地，将氨基化介孔硅纳米粒子分散于戊二醛水溶液中，室温避光搅拌24小时，而后离心收集产物，然后用双蒸水清洗多次后，即可获得醛基化的介孔硅纳米颗粒。

[0027] 所述步骤（6）中所选用的药物可以是常用抗癌药物（如盐酸阿霉素，顺铂，紫杉醇，喜树碱等）的一种或几种。进一步地，其他功效的药物（如激素，抗生素等）同样适用于本发明。优选地，本步骤将适量盐酸阿霉素溶于PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）中，而后加氨基化或者醛基化介孔硅纳米颗粒，室温避光搅拌24 - 48小时。

[0028] 所述步骤（7）是用丝胶蛋白包封介孔硅纳米颗粒。具体过程是将丝胶蛋白水溶液（5 - 10 mg/mL）加入步骤（6）的混合液中，避光35摄氏度反应6 - 7小时；而后离心收集产物；进一步地，用双蒸水冲洗产物多次，然后置于冷冻真空干燥机中冻干即可获得粉末状的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒，介孔硅纳米粒与丝胶蛋白的质量比为1 : 0.5 – 1 : 2。

[0029] 二、还原/蛋白酶双响应性的丝胶/介孔硅复合型多功能控制体系

[0030] （1）将含有模板的介孔硅纳米粒分散于溶剂中，加入巯丙基三甲氧基硅烷，反应得到巯基化的介孔硅纳米颗粒；

[0031] （2）将步骤（1）中的巯基化的介孔硅纳米颗粒分散于溶剂中，加入（2-氨基乙巯基）-2-巯基吡啶混合反应，得到双硫化的介孔硅纳米颗粒；

[0032] （3）将步骤（2）中的双硫化介孔硅纳米颗粒置于甲醇/盐酸的混合液中回流，洗脱模板后即得到具有规则孔道的双硫化介孔硅纳米颗粒；

[0033] （4）将步骤（3）中的双硫化的介孔硅纳米颗粒与药物混合，即可得到负载药物的双硫化介孔硅纳米颗粒；

[0034] （5）通过介孔硅表面的氨基与丝胶蛋白上的羧基反应，将丝胶蛋白包裹于介孔硅纳米粒表面，即可得到还原/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型多功能药物控释体系。

[0035] 所述步骤（1）中选用巯丙基三甲氧基硅烷实现介孔硅纳米粒子的巯基化，具体过程是将含有表面活性剂模板的介孔硅纳米粒子（制作方法与合成pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型纳米粒中的过程一致）根据质量体积比1 g : 83 mL分散于甲醇中，然后加入巯丙基三甲氧基硅烷，室温搅拌24小时后，离心收集、清洗后得到巯基化的介孔硅纳米粒子。本步骤中所用的溶剂甲醇与巯丙基三甲氧基硅烷的体积比为36 : 1。

[0036] 所述步骤（2）中使用（2-氨基乙巯基）-2-巯基吡啶（SATH）实现介孔硅纳米粒的双硫化。合成（2-氨基乙巯基）-2-巯基吡啶的具体过程包括：1）将2,2’-二硫二吡啶溶解于甲醇/冰醋酸（体积比5 : 0.2）的混合溶液中；2）将半胱胺盐酸盐溶于甲醇中(质量体积比为1.14 g ：10 mL)，逐滴加入步骤1)中的混合液中，室温反应48小时；3）反应完毕后，旋转蒸发掉甲醇；4）得到的产物用无水乙醚清洗两遍后，重新溶解于甲醇中，再加入无水乙醚沉淀，可得到白色固体状产物，置于-20摄氏度冰箱过夜；5）次日取出产物，吸弃黄色上清后，重复沉淀5次后，置于真空泵干燥，即可得到粉末状（2-氨基乙巯基）-2-巯基吡啶。

[0037] 所述步骤（3）中洗脱模板的方式与合成pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型纳米粒中洗脱模板的过程一致。

[0038] 所述步骤（4）中所选用的药物可以是常用抗癌药物（如盐酸阿霉素，顺铂，紫杉醇，喜树碱等）的一种或几种。进一步地，其他功效的药物（如激素，抗生素等）同样适用于本发明。药物搭载方式与合成pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型纳米粒中药物搭载的方式一致。

[0039] 所述步骤（5）是用丝胶蛋白包封住介孔硅纳米颗粒。选用的蚕茧为正常家蚕蚕茧品种（白玉等）、家蚕丝素缺失型突变品种（185 Nd-s, 140 Nd-s, 139 Nd-s等）或柞蚕蚕茧的一种，购自中国农业科学院蚕业研究所。丝胶蛋白提取方法与合成pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型纳米粒中丝胶蛋白提取的方式一致。丝胶蛋白包封过程具体包括：1）将丝胶蛋白固体溶于适量双蒸水中制备成丝胶蛋白水溶液（5 - 10 mg/mL）；2）分别称取适量加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)，N-羟基丁二酰亚胺 (NHS)（与丝胶蛋白的质量比分别为6:1, 3:1），依次加入丝胶蛋白水溶液中，室温反应2 - 3小时；3）将反应后的溶液加入步骤（4）的混合溶液中，避光35摄氏度反应6 - 24小时；而后离心收集产物；进一步地，用双蒸水冲洗产物多次，然后置于冷冻真空干燥机中冻干即可获得粉末状的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒。介孔硅纳米粒与丝胶蛋白的质量比为2 : 1。

[0040] 本发明提供了几种多重响应性的多功能复合型药物控释体系的制备方法。

[0041] 本发明的有益效果在于：

[0042] （1）该方法操作简单，原料获得方式简便，成本低廉，普遍适用，无需特殊复杂设备等。

[0043] （2）使用该方法所制备的纳米复合体系，充分利用了外层丝胶蛋白和内层介孔硅纳米粒子的特性，具有pH/蛋白酶或者还原/蛋白酶双重响应性，具备抑制肿瘤细胞，实时监测纳米粒子定位和药物释放等多重功能，且载药量高，生物相容性好，在肿瘤诊疗领域特别是在解决肿瘤的多重耐药性方面具备广阔的应用前景。

附图说明

[0044] 图1为丝胶/介孔硅复合型纳米颗粒的扫描电镜形貌图；

[0045] 图2为不同纳米粒的热重损失曲线图；

[0046] 图3为丝胶/介孔硅复合型纳米颗粒的荧光光谱图以及荧光显微镜照片；

[0047] 图4为空载的丝胶/介孔硅复合型纳米粒子对肿瘤细胞活力的影响；

[0048] 图5为丝胶/介孔硅复合型纳米颗粒与小鼠来源的巨噬细胞的相互作用：A为给予巨噬细胞不同的处理后的形态变化；B为给予巨噬细胞不同的处理后炎性因子肿瘤坏死因子（TNF-α）以及白介素1（IL-1β）的表达情况；

[0049] 图6为丝胶/介孔硅复合型药物控释体系的pH/蛋白酶双响应药物释放曲线图；

[0050] 图7为负载阿霉素的pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型载药体系与游离阿霉素对药物敏感型以及多重耐药型肿瘤细胞活力的影响的比较。

[0051] 图8为负载阿霉素的还原/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型载药体系与游离阿霉素对多重耐药型肿瘤细胞活力的影响的比较。

具体实施方式

[0052] 实施例1：本发明提供的利用戊二醛交联法制备丝胶/介孔硅复合型纳米颗粒。

[0053] 1、蚕茧的选择：

[0054] 本发明优先选用家蚕丝素缺失突变品种的蚕茧（购于中国农业科学院蚕业研究所，该家蚕丝素缺失突变品种保存于中国农业科学院蚕业研究所国家蚕资源保存中心，保藏编号185 Nd-s）为原材料，主要的化学成分为丝胶蛋白。

[0055] 2、丝胶蛋白的提取：

[0056] （1）称取2 g家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，剪成1 cm2左右的碎片；

[0057] （2）将剪碎后的蚕茧浸没在40 mL 0.02 M碳酸钠中，100摄氏度溶解30分钟；

[0058] （3）将溶解后的丝胶溶液转移至3500 Da的透析袋中，放入双蒸水中透析48小时；

[0059] （4）将透析袋中的溶液转移至50 mL离心管中，离心后收集上清液，置于冷冻冻干机中冻干后可得到固态丝胶蛋白，保存于-20摄氏度冰箱。

[0060] 3、丝胶/介孔硅复合型纳米颗粒的制备：

[0061] （1）将1.0 g十六烷基三甲基溴化铵分散于480 mL双蒸水中，加入0.28 g 氢氧化钠，加热搅拌至80摄氏度，缓慢逐滴加入5.0 g正硅烷乙酯，持续搅拌2小时后，得到白色介孔硅纳米粒子混浊液，离心收集沉淀，甲醇和双蒸水清洗多次后，真空冷冻干燥机冻干，即得到白色粉末状含有模板的介孔硅纳米粒子。

[0062] （2）将步骤（1）所得的介孔硅纳米粒子（1 g）分散于75 mL甲醇中，然后加入2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温搅拌24小时后，离心收集即得到氨基化的介孔硅纳米粒子。

[0063] （3）将步骤（2）所得的氨基化介孔硅纳米粒子分散于170 mL甲醇/浓盐酸（体积比为16 : 1）混合液中，80摄氏度中回流48小时后，而后离心即可获得具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米颗粒，甲醇和双蒸水清洗多次后冻干。

[0064] （4）将步骤（3）所得的氨基化介孔硅纳米颗粒 （200 mg）分散于2.5%戊二醛水溶液（20 mL）中，室温避光搅拌24小时，而后离心收集产物，然后用双蒸水清洗多次后，即可获得醛基化的介孔硅纳米颗粒。

[0065] （5）将步骤（4）所得的醛基化介孔硅纳米颗粒重新分散于400 mL双蒸水中，加入20 mL 丝胶蛋白水溶液（5 mg/mL），35摄氏度避光搅拌6小时后，离心收集沉淀，双蒸水清洗多次后，冷冻真空泵冻干，即可得到粉末状的丝胶/介孔硅复合纳米颗粒。如图1所示：通过该方法合成的丝胶/介孔硅复合型纳米颗粒粒径为200 nm左右。如图2所示：当温度提高至770摄氏度时，氨基化介孔硅纳米粒，醛基化介孔硅纳米粒以及丝胶/介孔硅纳米粒的重量损失分别为14.18%，26.75%以及42.07%，说明了丝胶成功被修饰于介孔硅纳米粒上。

[0066] 实验例1：研究丝胶/介孔硅复合型纳米粒的生物相容性。

[0067] 1、将空载的丝胶/介孔硅复合型纳米粒子与多种肿瘤细胞共孵育48小时后，检测细胞活力，如图4所示：当复合体系没有搭载任何药物时，对细胞的活力没有明显的影响。

[0068] 2、将空载的丝胶/介孔硅复合型纳米粒子与小鼠来源的巨噬细胞（Raw264.7 cells）共孵育24小时后，用鬼笔环肽和DAPI分别染细胞骨架和细胞核以观察细胞的形态，以及检测巨噬细胞炎性基因（TNF-α，IL-1β）的表达。如图5A所示：当巨噬细胞与丝胶/介孔硅复合型纳米粒共孵育24小时后，巨噬细胞的形态与和空白培养基（阴性对照）孵育24小时后的细胞形态类似，说明丝胶/介孔硅复合型纳米粒并没有激活巨噬细胞，而脂多糖刺激后巨噬细胞出现了明显的极化，形成了大量的丝状伪足；一致地，如图5B所示，丝胶/介孔硅复合型纳米粒也没有促进巨噬细胞炎性基因的表达，说明丝胶/介孔硅复合型纳米粒在体外研究中并没有显示出免疫原性。

[0069] 实验例2：检测丝胶/介孔硅复合型纳米颗粒的荧光特性。

[0070] 1、用荧光光谱测试仪检测丝胶/介孔硅复合型纳米颗粒的荧光光谱，如图3A所示：在适当的激发波长的激发下，可产生波长在550 nm左右的发射光。

[0071] 2、将丝胶/介孔硅复合型颗粒与RAW264.7巨噬细胞共孵育24小时后，用荧光显微镜观察材料的荧光，如图3B所示：在蓝光光源激发下，材料可以发出绿色荧光。

[0072] 实验例3：研究丝胶/介孔硅纳米复合载药体系的pH/蛋白酶双响应性释药行为。

[0073] 1、制备负载抗肿瘤药物的pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型药物控释体系。

[0074] （1）本研究使用广谱抗肿瘤药物盐酸阿霉素。首先将100 mg盐酸阿霉素溶于200 mL PBS（pH 7.4）中，而后加入100 mg醛基化介孔硅纳米颗粒，室温避光搅拌24 小时。

[0075] （2）将10 mL的丝胶蛋白水溶液（5 mg/mL）加入步骤（1）的混合液中，避光35摄氏度反应6小时后，离心收集产物，双蒸水冲洗产物至上清液接近无色，然后将所得产物置于冷冻真空干燥机中冻干即可获得粉末状的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒。

[0076] 2、检测上述步骤所得的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的载药量。

[0077] 将1 mL 丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒（1.25 mg）分散于4 mL氢氟酸中，待彻底溶解后，将液体稀释4倍，测量液体在480 nm的紫外吸光度（0.34871），再根据标准曲，线算得所得液体的阿霉素浓度为0.018193 mg/mL；载药量为29.1%，即100 mg 的丝胶/介孔硅纳米粒可负载约41 mg的盐酸阿霉素。

[0078] 3、检测丝胶/介孔硅复合型纳米载药体系在不同pH条件下的释药曲线。

[0079] 将2 mg负载阿霉素的丝胶/介孔硅纳米粒分装在4个2 mL EP管中（0.5 mg每管），分别加入1.5 mL pH 5.0、6.5、7.4以及含有木瓜蛋白酶的pH 5.0的缓冲液中，避光置于37摄氏度摇晃孵育，在设定的时间点收取上清液，用紫外分光光度计测定480 nm处的吸光值，根据标准曲线计算出释放出来的阿霉素量，再计算出释放出来的药量占初始载药量的比例，绘制释放曲线。如图6所示：72小时后在pH 5.0的环境下有53.85%的药物释放出来，在加入蛋白酶后，有81.56%的药物从体系中释放出来，证实该释药系统对pH以及蛋白酶双重敏感。

[0080] 实验例 4：研究负载阿霉素的丝胶/介孔硅复合型载药体系对于药物敏感型肿瘤细胞以及多重耐药型肿瘤细胞的杀伤作用。

[0081] 将负载阿霉素的丝胶/介孔硅复合型载药纳米粒子与药物敏感型人肝癌细胞（HepG2 cells），人宫颈癌细胞（HeLa cells），人乳腺癌细胞（MCF-7 cells）,以及多重耐药型人乳腺癌细胞（MCF-7/ADR cells）共孵育48小时，用MTT法检测细胞活力。如图7所示：将药物敏感型肿瘤细胞用游离的盐酸阿霉素处理后，大部分的肿瘤细胞出现了死亡；类似地，丝胶/介孔硅/盐酸阿霉素复合颗粒也能有效地诱导肿瘤细胞死亡，但在低浓度时对肿瘤细胞的杀伤作用弱于游离盐酸阿霉素，因为盐酸阿霉素是小分子水溶性药物，易通过扩散方式被肿瘤细胞摄取而及时发挥抗肿瘤效应。而相反地，当将多重耐药型乳腺癌细胞与游离盐酸阿霉素处理后，细胞活力明显高于用丝胶/介孔硅/盐酸阿霉素复合颗粒处理后的肿瘤细胞，因为多重耐药型肿瘤细胞存在大量的药物泵，当游离阿霉素透过细胞膜进入细胞质后很快地被泵出了细胞外，因而肿瘤杀伤力明显下降；而丝胶/介孔硅/盐酸阿霉素复合颗粒通过内涵体-溶酶体途径进入细胞内，极大程度地避开了药物泵的作用，同时“阀门”在溶酶体环境下能被迅速打开，使药物被大量地释放出来扩散至细胞核，因而在多重耐药型肿瘤细胞中发挥了较强的细胞杀伤效应。

[0082] 实施例 2：本发明提供的利用双硫键制备还原/酶双响应性的丝胶/介孔硅复合型药物控释系统。

[0083] 1、本实施例中，优先选用的蚕茧品种为家蚕丝素缺失突变品种的蚕茧（购于中国农业科学院蚕业研究所，该家蚕丝素缺失突变品种保存于中国农业科学院蚕业研究所国家蚕资源保存中心，保藏编号140Nd-s）；丝胶蛋白的提取方法与实施例1相同。

[0084] 2、巯基化介孔硅纳米粒子的合成与实施例1中氨基化的介孔硅纳米粒子的合成方法基本相同，不同之处在于将3-氨丙基三乙氧基硅烷换成巯丙基三甲氧基硅，加入的体积为溶剂甲醇的1/36。

[0085] 3、双硫化的介孔硅纳米粒子的合成：

[0086] （1）（2-氨基乙巯基）-2-巯基吡啶的合成：1）将4.41 g 2,2’-二硫二吡啶溶解于甲醇（20 mL）/冰醋酸（0.8 mL）的混合溶液中；2）将1.14 g半胱胺盐酸盐(M=113溶于10mL甲醇中，逐滴加入1)中的混合液中，室温搅拌48小时；3）反应完毕后，旋转蒸发溶剂后，得到黄色油脂样物质；4）得到的产物用无水乙醚（50 mL）清洗两遍后，重新溶解于10 mL甲醇中，再加入200 mL无水乙醚中沉淀，可得到白色固体状产物；5）搅拌10分钟后置于-20摄氏度冰箱过夜；6）次日取出产物，吸弃黄色上清后，得到黄色晶体状产物，重复沉淀2-3次后，置于真空泵干燥，即可得到粉末状（2-氨基乙巯基）-2-巯基吡啶。

[0087] （2）将200 mg巯基化的介孔硅纳米粒子分散于30 mL的甲醇中，加入200 mg SATH，室温搅拌24小时后，离心收集产物，用甲醇和双蒸水清洗数次后冻干；

[0088] （3）洗脱表面活性剂模板，方法与实施例1中的过程相同。

[0089] 4、制备负载抗肿瘤药物的还原/酶双响应的丝胶/介孔硅复合型药物控释体系：本实施例选择的抗肿瘤药物为盐酸阿霉素，材料制备方式与实施例1实验例3中制备pH/蛋白酶双响应的丝胶/介孔硅复合型药物控释体系的方法基本相同，不同之处在于：（1）阿霉素用量减少；（2）使用的丝胶蛋白为编号140 Nd-s的家蚕丝素缺失突变品种的蚕茧提取所得；（3）使用的介孔硅纳米颗粒为具有规则孔道的双硫化的介孔硅纳米颗粒；（4）丝胶蛋白包裹载药双硫化的介孔硅纳米颗粒之前先进行活化，具体过程包括：1）将10 mg盐酸阿霉素溶于
20 mL PBS（pH 7.4）中，加入20 mg双硫化的介孔硅纳米颗粒，避光室温反应24小时；2）将10 mg丝胶蛋白溶于2 mL双蒸水中，依次加入0.06 g EDC，30 mg NHS，室温反应3小时；3）将步骤2）的所得的溶液加入步骤1）的反应液中，室温避光反应7小时后，离心收集产物，双蒸水冲洗产物至上清液接近无色，然后将所得产物置于冷冻真空干燥机中冻干即可获得粉末状的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒。

[0090] 实验例1：检测上述步骤所得的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的载药量。

[0091] 本实验例载药量的检测方法与实施例1中实验例3的检测方法相同，计算所得的载药量为0.14，即100 mg丝胶/介孔硅纳米颗粒可负载16.28 mg盐酸阿霉素。

[0092] 实验例2：研究负载阿霉素的丝胶/介孔硅复合型载药体系对于多重耐药型肿瘤细胞的杀伤作用

[0093] 将负载阿霉素的丝胶/介孔硅复合型载药纳米粒子与多重耐药型人乳腺癌细胞（MCF-7/ADR cells）共孵育48小时，用MTT法检测细胞活力。如图8所示：丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒对多重耐药型人乳腺癌细胞MCF-7/ADR cells产生的杀伤效果，说明纳米颗粒能被肿瘤细胞吞噬，并通过细胞内环境将药物释放出来，从而产生了细胞杀伤效应。