一种半夏胰蛋白酶抑制剂及其在抗虫中的应用

摘要

本发明公开了属于生物化学与分子生物学技术领域的一种半夏胰蛋白酶抑制剂及其在抗虫中的应用。所述半夏胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。本发明还发现了其胰蛋白酶抑制剂的一个活性突变体。该胰蛋白酶抑制剂具有明显的杀灭鳞翅目及半翅目昆虫的作用。

权利要求

1.一种半夏胰蛋白酶抑制剂突变体，其特征在于，所述半夏胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO3所示。

2.根据权利要求1所述一种半夏胰蛋白酶抑制剂突变体，其特征在于，所述半夏胰蛋白酶抑制剂突变体的基因序列如序列表SEQ ID NO4所示。

3.权利要求1所述半夏胰蛋白酶抑制剂突变体在抗虫中的应用，其特征在于，所述害虫为烟青虫或吊丝虫。

说明书

一种半夏胰蛋白酶抑制剂及其在抗虫中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种半夏胰蛋白酶抑制剂及其在抗虫中的应用。

背景技术

[0002] 作物害虫是造成农业减产的重要因素之一,据联合国粮农组织统计,全世界每年因病虫害使谷物减产20％～30％,仅仅美国每年因虫害造成的皮棉损失达12％～14％,经济损失达4.5亿美元。传统的杀虫剂主要是一些天然或合成的化学药品,它们在短期内虽然能起到杀灭害虫保护农作物的作用,但长期使用会使毒性在植物体内积累,危害人类及其他动物健康,同时还能导致害虫对杀虫剂产生抗性,从而降低其药效,因此世界上很多国家都已禁止对农作物使用化学杀虫剂,而致力于生物杀虫剂的研究,并取得了重大进展。其中美国的Monsanto公司在生物工程的研究与开发方面起到了举足轻重的作用,1993年美国农业部批准300项转基因作物的田间试验,其中90项是由Monsanto公司提出来的。1989年美国种植转基因大豆0.1亿公顷,主要是由Monsanto公司提供的种子。使用生物杀虫剂可以克服化学杀虫剂的许多弊端,但用作生物杀虫剂的物质许多在自然界并不是大量存在的,通常情况下只是作为一些次生代谢物存在,这使得生物杀虫剂的造价昂贵。随着植物基因工程的兴起与发展,这一问题得到了很大程度的解决。人们将这些抗虫物质的基因克隆并转入植物体内,从而获得抗虫转基因植物。与常规的生物杀虫剂相比,抗虫转基因植物的优点更为显见,例如,它对植物具有连续保护作用,只对目标害虫起作用,而对非危害生物无影响,而且所表达的抗虫物质仅存在于植物体内,不存在环境污染问题；同时它的成本低,有利于推广。目前应用于转基因植物的抗虫基因主要有两大类,一类是来源于微生物的抗虫基因,另一类是来源于植物的抗虫基因,其他还有来源于动物的几种,但人们对此研究较少。寻找可用的抗虫基因资源就成了，发展转基因抗虫农业的关键。

[0003] 半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的块茎，是一种重要的中药材。半夏主要药理作用为内用可燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结；外用则主要用于消炎。近年来研究发现，半夏还具有抗肿瘤、抗生育和抗蚜虫等重要药理作用。

[0004] 蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor，PI)是一类分子量较小的蛋白质，广泛的存在于动植物体中，能与体内蛋白酶结合，形成蛋白酶-蛋白酶抑制剂复合物，从而抑制蛋白酶的水解作用，调节机体很多重要的生命活动，包括蛋白降解、信号传导、炎症、凋亡和血液凝固等。植物蛋白酶抑制剂主要存在于种子器官或者块茎中，其含量往往可以到达总蛋白的10％。目前，豆科植物中大量的植物蛋白酶抑制剂已经被发现、分离纯化和探索，其生理作用和机制研究也已经研究的比较清楚。很多报道表明当植物叶片受到化学处理或者机械损伤时，也可诱导产生大量植物蛋白酶抑制剂。

[0005] 根据蛋白酶抑制剂作用于蛋白酶活性位点的不同，可以将蛋白酶抑制剂分为四大类。其中植物中最多的是丝氨酸蛋白酶，尤其是在豆科植物中，该类蛋白酶抑制剂也是到目前为止研究最广泛、最深入的植物蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶家族又可以主要分为两个家族：Kunitz家族和Bowman-Birk家族。Kunitz蛋白酶抑制剂家族是丝氨酸蛋白酶抑制剂的另一个主要类型。该家族成员分子量一般为20kDa左右，肽链长度为180个氨基酸左右，分子内含有两对分子内二硫键，分子内部只有一个活性结合位点可与蛋白酶结合，因此这类蛋白酶抑制剂也被称为单头抑制剂。

[0006] 不同的蛋白酶抑制剂在动植物体内的功能是多种多样的，目前，尚没有从半夏中分离出蛋白酶抑制剂并且研究其具体功能的报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种半夏胰蛋白酶抑制剂及其在抗虫中的应用。本发明在天然有毒的中药材半夏中克隆得到了一个胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，该基因具有明显的杀灭鳞翅目及半翅目昆虫的作用。

[0008] 一种半夏胰蛋白酶抑制剂，所述半夏胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。

[0009] 所述半夏胰蛋白酶抑制剂的基因序列如序列表SEQ ID NO2所示。

[0010] 一种含所述半夏胰蛋白酶抑制剂的基因载体。

[0011] 含有所述半夏胰蛋白酶抑制剂的基因载体的宿主菌。

[0012] 扩增所述的半夏胰蛋白酶抑制剂中任一片段的引物。

[0013] 一种半夏胰蛋白酶抑制剂突变体，所述半夏胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO3所示。

[0014] 所述半夏胰蛋白酶抑制剂突变体的基因序列如序列表SEQ ID NO4所示。

[0015] 所述半夏胰蛋白酶抑制剂或所述半夏胰蛋白酶抑制剂突变体在抗虫中的应用。

[0016] 所述害虫为鳞翅目和半翅目昆虫。

[0017] 本发明的有益效果：本发明在天然有毒的中药材半夏中克隆得到了一个胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，经研究，该基因具有明显的杀灭鳞翅目昆虫的作用。本发明还发现了上述胰凝乳蛋白酶抑制剂的一个突变体，该突变体蛋白具有更高的抗虫活性，且在体内不容易降解，半衰期长。

附图说明

[0018] 图1为本发明克隆的半夏胰蛋白酶抑制剂基因鉴定电泳图；

[0019] 图中，Maker：1kb Maler，1.p2301-PtTI(13253bp)，2.p2301-PtTI/EcoRI+HindIII(1674bp+11579bp)。

[0020] 图2为本发明构建的pCAMBIA2301-PtTI载体结构示意图。

具体实施方式

[0021] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

[0022] 以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

[0023] 实施例1

[0024] 根据已获得的天南星科海芋属胰蛋白酶抑制剂基因保守区序列设计简并引物：

[0025] Fw:ATGGAGTTTATCCTGCTCCTTGTGTC(SEQ ID NO5)

[0026] Rv:CAGCCAGCCCTTCCTTCACCTTCAC(SEQ ID NO6)

[0027] 利用同源克隆技术以提取的三叶半夏RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR扩增获得了约640bp的基因片段，然后通过3’和5’RACE技术克隆得到了该基因的全长cDNA序列，序列分析表明：该基因cDNA全长为1046bp(SEQ ID NO7)，开放读码框为651bp，编码217个氨基酸的前体蛋白(如图1所示)。该半夏胰蛋白酶抑制剂基因命名为PtTI(Pinellia ternata Inhibitor,PtTI)。

[0028] 1.反转录生成cDNA第一链

[0029] (1)、在0.2mL eppendorf管中加入下列试剂：总RNA 2μg，500μg/mL锚定引物oligo d(T)151μL，补水至15μL，70℃变性5min，迅速置冰上冷却。

[0030] (2)、按顺序加入下列组分：

[0031]

[0032] (3)、混匀后42℃温浴30min，然后99℃温浴5min，最后置于5℃环境中。

[0033] 2.PCR反应获得中间片段

[0034] (1)、按下列组分配制PCR反应液

[0035]

[0036]

[0037] (2)、按以下条件进行PCR反应

[0038]

[0039] 3. 3’RACE(按照Takara公司3’Full RACE Kit操作说明书进行)[0040] (1)、反转录反应体系如下：

[0041]

[0042] 注：总RNA的使用量约为1μg，根据提取的RNA的浓度加入相应体积。(2)、反应条件如下：

[0043]

[0044] (3)、套式PCR反应。

[0045] 使用TaKaRa LA (TaKaRa Code：DRR02AM)进行PCR反应时的实验操作如下。

[0046] ①一轮PCR反应。反应体系如下：

[0047]

[0048] 反应条件如下：

[0049]

[0050] ②二轮PCR反应。反应体系如下：

[0051]

[0052] 反应条件如下：

[0053]

[0054]

[0055] 4. 5’RACE(按照Invitrogen公司5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0操作说明书进行)

[0056] (1)、获得cDNA第一链

[0057] 1、按以下组分配制反应液：

[0058] 合成反转录引物  2.5pmol

[0059] RNA             1-5μg

[0060] DEPC H2O至15.5μl

[0061] 2、于70℃加热10min，使RNA变性，然后置于冰上1min，用离心机离一下，然后加入如下组分：

[0062]

[0063] 提示：对于结构复杂的RNA，在加入体系1后，70℃加热10min，立即转到50℃环境下，体系2也要预热到50℃，且整个反应体系要加倍。

[0064] 3、离心使体系2混匀，在42℃温浴1min。

[0065] 4、加入1μl反转录酶SuperscriptTMⅡRT,于体系2中，混匀。

[0066] 5、在70℃温浴15min，终止反应。

[0067] 6、用离心机离心10-20s，然后置于37℃。

[0068] 7、加入1μl RNase Mix轻轻混匀后于37℃下放置30min，使cDNA:RNA链中RNA降解掉

[0069] 8、离心收集样品，然后置于冰上。

[0070] (2)、S.N.A.P去除包含在cDNA中的蛋白、dNTPs、引物、DNA

[0071] 1、将结合液放置于室温条件下

[0072] 2、每纯化一个样品，取约100μl无菌水，于65℃预热备用

[0073] 3、向cDNA液中加入120μl结合液

[0074] 4、将结合液/cDNA加入柱子中，13000rpm离心20sec

[0075] 5、将吸附柱从收集管中移走，将管中的液体转到另一离心管中，保存该溶液直至确定回收回来了cDNA，然后重新将吸附柱放到收集管中。

[0076] 6、向柱子中加入冰预冷的1x的400μl洗脱液，于13000rpm下离心20sec，抛弃洗脱液，重复此过程4次

[0077] 50μl wash buffer

[0078] 1x洗脱液配制：900μl蒸馏水

[0079] 1050μl无水乙醇

[0080] 7、用400μl 70％乙醇洗涤柱子，按照步骤6的方法洗涤两次

[0081] 8、洗脱完毕后，丢弃70％乙醇，于13000rpm下空甩1min

[0082] 9、将柱子放置到一个新的样品收集管中，向柱子中加入约50μl 65℃预热的灭菌蒸馏水，然后于13000rpm下离心20sec，收集cDNA

[0083] (3)、TdT加尾

[0084] 1、按以下组分配制反应液：

[0085]

[0086] 2、在94℃下孵育2—3min，然后立即置于冰上1min，通过离心收集下样品，然后置于冰上

[0087] 3、向离心管中加入1μl的TdT，轻轻混匀，然后在37℃下孵育10min[0088] 4、然后在65℃下加热10min，然后离心收集样品

[0089] (4)、PCR反应

[0090] 1、一轮反应

[0091] 反应体系如下：

[0092]

[0093] 反应条件如下：

[0094]

[0095] 2、二轮反应

[0096] 反应体系如下：

[0097]

[0098] 反应条件如下：

[0099]

[0100]

[0101] 5.全长的获得

[0102] (1)、根据3’端测序序列和5’端测序序列，进行拼接，然后从编码框两头设计引物，引物的5’端加入合适的酶切位点从cDNA和基因组DNA中进行PCR

[0103] (2)、反应体系如下：

[0104]

[0105] (3)、反应条件如下：

[0106]

[0107] 将获得的胰蛋白酶抑制剂基因构建CaMV35S启动子驱动，CaMV35S-PolA终止的植物表达载体(pCAMBIA2301-PtTI，如图2所示)，并通过农杆菌介导法转化烟草，获得了35S启动子驱动的PtTI基因的转基因烟草植株。

[0108] 克隆得到的PtTI基因表达框：SmaI-CaMV35S-PtTI-CaMV35S-PolA-XbaIR,经双酶切连接载体pCAMBIA2301。

[0109] 实施例2

[0110] 利用p2300-35S-PtTI植物表达载体为模版，通过重叠延伸PCR的方法获得突变体，突变位点为第56和第57位氨基酸残基PP突变为AA。重新构建植物表达载体p2300-35S-PtTI2，并通过农杆菌介导法转化烟草，获得了35S启动子驱动的PtTI2基因的转基因烟草植株。

[0111] 实施例3抗蚜虫(半翅目)试验

[0112] 种植转PtTI基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到60天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转PtTI基因的烟草植株30株，野生型烟草30株，每株烟草上接100头成熟无翅的蚜虫，30小时后，统计蚜虫抑制率：蚜虫抑制率％＝(100-叶片上剩余蚜虫)/100。

[0113] 实验结果：转PtTI基因的烟草的蚜虫抑制率为68％，野生型烟草的蚜虫抑制率为1％。

[0114] 实施例4抗蚜虫(半翅目)试验

[0115] 种植转PtTI2基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到60天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转PtTI2基因的烟草植株30株，野生型烟草30株，每株烟草上接100头成熟无翅的蚜虫，30小时后，统计蚜虫抑制率：蚜虫抑制率％＝(100-叶片上剩余蚜虫)/100。

[0116] 实验结果：转PtTI2基因的烟草的蚜虫抑制率为88％，野生型烟草的蚜虫抑制率为1％。

[0117] 实施例5抗菜青虫(鳞翅目)试验

[0118] 种植转PtTI基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到60天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转PtTI基因的烟草植株30株，野生型烟草30株，每株烟草上接40头大小一致的同龄菜青虫，30小时后，统计菜青虫抑制率：菜青虫抑制率％＝(40-叶片上剩余菜青虫)/40。

[0119] 实验结果：转PtTI基因的烟草的菜青虫抑制率为70％，野生型烟草的菜青虫抑制率为2％。

[0120] 实施例6抗菜青虫(鳞翅目)试验

[0121] 种植转PtTI2基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到60天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转PtTI2基因的烟草植株30株，野生型烟草30株，每株烟草上接40头大小一致的同龄菜青虫，30小时后，统计菜青虫抑制率：菜青虫抑制率％＝(40-叶片上剩余菜青虫)/40。

[0122] 实验结果：转PtTI2基因的烟草的菜青虫抑制率为89％，野生型烟草的菜青虫抑制率为2％。

[0123] 实施例7抗烟青虫(鳞翅目)试验

[0124] 种植转PtTI基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到60天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转PtTI基因的烟草植株30株，野生型烟草30株，每株烟草上接40头大小一致的同龄烟青虫，30小时后，统计烟青虫抑制率：烟青虫抑制率％＝(40-叶片上剩余烟青虫)/40。

[0125] 实验结果：转PtTI基因的烟草的烟青虫抑制率为5％，野生型烟草的烟青虫抑制率为2％。

[0126] 实施例8抗烟青虫(鳞翅目)试验

[0127] 种植转PtTI2基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到60天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转PtTI2基因的烟草植株30株，野生型烟草30株，每株烟草上接40头大小一致的同龄烟青虫，30小时后，统计烟青虫抑制率：烟青虫抑制率％＝(40-叶片上剩余烟青虫)/40。

[0128] 实验结果：转PtTI2基因的烟草的烟青虫抑制率为75％，野生型烟草的烟青虫抑制率为2％。

[0129] 实施例9抗吊丝虫(鳞翅目)试验

[0130] 种植转PtTI基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到60天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转PtTI基因的烟草植株30株，野生型烟草30株，每株烟草上接40头大小一致的同龄吊丝虫幼虫，30小时后，统计吊丝虫抑制率：烟青虫抑制率％＝(40-叶片上剩余吊丝虫)/40。

[0131] 实验结果：转PtTI基因的烟草的烟青虫抑制率为15％，野生型烟草的烟青虫抑制率为2％。

[0132] 实施例10抗吊丝虫(鳞翅目)试验

[0133] 种植转PtTI2基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到60天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转PtTI2基因的烟草植株30株，野生型烟草30株，每株烟草上接40头大小一致的同龄吊丝虫幼虫，30小时后，统计吊丝虫抑制率：吊丝虫抑制率％＝(40-叶片上剩余吊丝虫)/40。

[0134] 实验结果：转PtTI2基因的烟草的烟青虫抑制率为79％，野生型烟草的烟青虫抑制率为2％。

[0135] 发明人通过大量类似试验，证实PtTI2基因可以抗绝大多数类型的半翅目和鳞翅目农业害虫，具有广谱性，PtTI基因能够抗部分类型的半翅目和鳞翅目农业害虫。