基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物及制备方法与应用

摘要

本发明属于核酸标记领域，特别涉及一种基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物及制备方法与应用。所述的DNA标记物，为化合物W‑3和W‑4中的至少一种；所述的W‑3和W‑4结构式如式Ⅰ和Ⅱ所示；本发明制备方法简单温和，反应过程中氧气和水对反应无影响，操作简单，易于普及，可以应用于核酸标记领域。

权利要求

1.一种基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物，其特征在于：该DNA标记物为化合物W-3，其结构式如式Ⅰ所示：

2.权利要求1所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将四唑化合物W-1与氢氧化锂在四氢呋喃甲醇和水的混合液中加热搅拌反应，反应终止后调节溶液的pH值至出现紫色沉淀；得到中间体W-2；

(2)将步骤(1)制得的W-2与NHS和EDC在DMF中搅拌反应以活化W-2；反应终止后，加入饱和食盐水至沉淀析出，得到化合物W-3，即为具有荧光响应的DNA标记物基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物；

所述的四唑化合物W-1的结构式如式Ⅲ所示：

3.根据权利要求2所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的W-1与氢氧化锂的摩尔比为1:(15～20)。

4.根据权利要求2所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的加热搅拌反应的温度为45℃～55℃。

5.根据权利要求2所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的加热搅拌反应的时间为12～14h。

6.根据权利要求2所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的pH值为2～4.5。

7.根据权利要求2所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的W-2与NHS和EDC的摩尔比为1:2:2。

8.权利要求1所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物在核酸标记领域中的应用。

9.根据权利要求8所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物在核酸标记领域中的应用，其特征在于包含如下步骤：将基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物与具有氨基的核酸序列在硼酸钠缓冲液中避光孵育进行缩合反应，用预冷的无水乙醇将核酸沉降出来，得到DNA标记物标记的核酸。

10.根据权利要求8所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物在核酸标记领域中的应用，其特征在于还包括如下步骤：将制得的DNA标记物标记的核酸与二甲胺基丙基丙烯酰胺在紫外光下发生光点击反应，得到具有荧光响应的核酸。

说明书

基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物及制备方法与

应用

技术领域

[0001] 本发明属于核酸标记领域，特别涉及一种基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物及制备方法与应用。

背景技术

[0002] 核酸是一类由核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。目前，核酸修饰技术是医学和生物学领域中的常用研究工具，且已经被广泛地用，核酸分子的修饰在分子识别的基础研究、生物医学诊断和DNA纳米结构构建起重要作用。

[0003] 早期传统的DNA修饰方法是直接在DNA上修饰荧光分子，此方法对技术和设备要求较高操作复杂，纯化手段复杂，不利于大规模推广。近些年生物正交反应备受关注，尤其是应用于核酸和蛋白质的修饰。生物正交反应具有操作简单，反应物易于合成、特异性高等优点，其在分子识别和医学诊断领域应用广泛。

[0004] 近期基于点击化学的生物正交反应备受关注，尤其是利用点击反应对蛋白和核酸的修饰。点击化学是一种叠氮化合物和炔烃的环化加成反应，它是2001年，由诺贝尔化学奖获得者Sharpless报道出来的。它有反应速度快、反应条件较温和、产率高、副产物少和立体选择性高等特点，因此该方法自提出以来在化学、生物医药、分子识别、高分子合成等领域都有广泛应用。

[0005] 目前常用的基于点击化学反应的DNA标记方法有：铜离子催化的叠氮化合物和炔烃的环化加成反应(CuAAC)，此方法微量的铜离子就能催化该反应的发生，反应速度快，但是有报道过渡态金属催化剂铜(I)可以诱导病毒或寡核苷酸的降解，并且铜(I)作为催化剂具有细胞毒素，因此不适合在生物体内的应用。此外还有非铜催化的叠氮化合物和炔烃的环化加成反应，此反应速度慢，反应时间长，降低了该方法的推广及普及性。

[0006] 近几年基于光点击的生物正交反应被广泛报道，如基于光点击反应实现对蛋白质的修饰，是一种光控的且有荧光响应的蛋白质修饰方法。该方法是具有实时光控的生物正交反应，具有光诱导实时可控，非金属催化，无毒，反应速度快，产率高、操作方便简单，应用性广等优点。

[0007] 有文献报道了一种基于光点击反应的DNA修饰方法，该方法首次将光点击反应应用于核酸修饰中，利用LED灯就可以实现核酸的标记，操作方便简单，反应速度快等优点。但是该方法只实现了DNA的修饰，反应后没有荧光响应，不具备多方面的应用。因此开发一种基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物在实际应用中仍具有重要意义。

发明内容

[0008] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物，该标记物具有实时光控的，具有光诱导实时可控、具有荧光响应、应用性广等优点。

[0009] 本发明的另一目的在于提供上DNA标记物的制备方法。

[0010] 本发明的再一目的在于提供上述DNA标记物的应用。

[0011] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0012] 一种基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物，为化合物W-3和W-4中的至少一种；所述的W-3和W-4结构式如式Ⅰ和Ⅱ所示：

[0013]

[0014] 所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物的制备方法，包括如下步骤：

[0015] (1)将四唑化合物W-1(Methyl4-(2-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl)-2H-tetrazol-5-yl)benzoate)与氢氧化锂在四氢呋喃甲醇和水的混合液中加热搅拌反应，反应终止后调节溶液的pH值至出现紫色沉淀；得到中间体W-2；

[0016] (2)将步骤(1)制得的W-2与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中搅拌反应以活化W-2；反应终止后，加入饱和食盐水至沉淀析出，得到化合物W-3，即为具有荧光响应的DNA标记物基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物；

[0017] (3)将乙胺加入二氯甲烷中，然后再加入步骤(2)制得的W-3搅拌反应，减压蒸馏，得到W-4；

[0018] 步骤(1)中所述的W-1与氢氧化锂的摩尔比优选为1:(15～20)；

[0019] 步骤(1)中所述的W-1与氢氧化锂的摩尔比进一步优选为1:20；

[0020] 步骤(1)中所述的甲醇、四氢呋喃和水的混合液中，甲醇、四氢呋喃和水的体积比优选为1：(2～3)：1；

[0021] 步骤(1)中所述的甲醇、四氢呋喃和水的混合液中，甲醇、四氢呋喃和水的体积比进一步优选为1:2:1；

[0022] 步骤(1)中所述的加热搅拌反应的温度优选为45℃～55℃；

[0023] 步骤(1)中所述的加热搅拌反应的温度进一步优选为50℃；

[0024] 步骤(1)中所述的加热搅拌反应的时间优选为12～14h；

[0025] 步骤(1)中所述的加热搅拌反应的时间进一步优选为12h；

[0026] 步骤(1)中所述的pH值优选为2～4.5，更优选为3；

[0027] 步骤(2)中所述的W-2与NHS和EDC的摩尔比优选为1:2:2；

[0028] 步骤(2)中所述的搅拌反应的时间优选为12～14h；

[0029] 步骤(2)中所述的搅拌反应的时间优选为12h；

[0030] 步骤(3)中所述的乙胺与W-3的摩尔比优选为2:1；

[0031] 步骤(3)中所述的搅拌反应的时间优选为0.5～2h；

[0032] 所述的四唑化合物W-1的结构式如式Ⅲ所示：

[0033]

[0034] 所述的中间体W-2的结构式如式Ⅳ所示：

[0035]

[0036] 所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物在核酸标记领域中的应用；

[0037] 所述的基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物在核酸标记领域中的应用，包含如下步骤：

[0038] (1)将基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物与具有氨基的核酸序列在硼酸钠缓冲液中避光孵育进行缩合反应，用预冷的无水乙醇将核酸沉降出来，得到DNA标记物标记的核酸(核酸探针等)；

[0039] (2)将步骤(1)中制得的DNA标记物标记的核酸与二甲胺基丙基丙烯酰胺在紫外光下发生光点击反应，得到具有荧光响应的核酸；

[0040] 步骤(1)中所述的核酸序列优选为5’端氨基标记或3’端氨基标记；

[0041] 步骤(1)中所述的硼酸钠缓冲液的pH优选为7.5～8.5，进一步优选为8.0；

[0042] 步骤(1)中所述的缩合反应的时间优选为12～16小时，进一步优选为14小时；

[0043] 步骤(2)中所述的核酸探针与二甲胺基丙基丙烯酰胺的优选摩尔比是1：(20～50)更优选为1:40；

[0044] 步骤(2)中所述的紫外光的波长优选为302nm；

[0045] 步骤(2)中所述的紫外光照射时间优选是2min；

[0046] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0047] (1)反应过程中生成荧光基团，有荧光响应。反应完后不需要清洗步骤即可。

[0048] (2)反应由光诱导，可控。

[0049] (3)反应速度快，产率高，副产物少。

[0050] (4)反应条件简单温和，反应过程中氧气和水对反应无影响。

[0051] (5)反应原料容易获得，反应产物合成简单(图1)。

[0052] (6)操作简单，易于普及。

附图说明

[0053] 图1是本发明的DNA标记物W-3的制备合成路线图。

[0054] 图2是实施例1得到的DNA标记物W-3的核磁共振氢谱图。

[0055] 图3是实施例1得到的DNA标记物W-3的ESI质谱图。

[0056] 图4是实施例2中的W-4与四种不同烯烃化合物点击之后的荧光光谱图。

[0057] 图5是实施例3中得到的标记四唑化合物W-3的探针的质谱图。

[0058] 图6是实施例4中标记后的探针点击之后在不同pH值的缓冲液中的荧光光谱图。

[0059] 图7是实施例5中得到的核酸探针光点击前后荧光强度的变化结果分析，其中，A：荧光光谱结果分析；B：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析；C：紫外吸收结果分析；D：点击反应后的质谱结果分析。

[0060] 图8是实施例6中在不同紫外光照射下光点击反应速率图。

具体实施方式

[0061] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0062] 实施例中所述的四唑化合物W-1(Methyl4-(2-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl)-2H-tetrazol-5-yl)benzoate)根据参考文献(Zhipeng Yu,Lok Yin Ho,Zhiyong Wang,Qing Lin，Z.Yu et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.21(2011)5033–5036)合成；

[0063] 所述的四唑化合物W-1的结构式如式Ⅲ所示：

[0064]

[0065] 所涉及的化学试剂均由阿拉丁购买，所涉及的DNA产品均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

[0066] 所述的荧光光谱仪(LS 55)购自珀金埃尔默仪器(上海)有限公司；

[0067] 实施例1一种基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物的制备

[0068] (1)将四唑化合物W-1(362mg，1.0mmol)溶于6ml四氢呋喃，然后加入3ml甲醇，得到混合液；将氢氧化锂(840mg,20.0mmol)溶于3ml水，得到氢氧化锂溶液；然后将氢氧化锂溶液滴入混合液中，50℃搅拌过夜(12h)，TLC跟踪检测反应；反应完全后，用1mol/L的碳酸氢钠和1mol/L的盐酸调节反应液的pH值在调节pH值的过程中有紫色沉淀析出，把反应液的pH值调节到3.0至沉淀完全析出；过滤将沉淀收集，并用大量的水反复冲洗沉淀，最后用少量乙醇冲洗沉淀物；用真空泵将沉淀抽干，得到中间体W-2；产物330mg，产率94.8％，其结构式如式Ⅳ所示：

[0069]

[0070] (2)四唑化合物W-2的活化：称取步骤(1)制得的W-2(240mg，0.69mmol)放入25ml单颈瓶中，加入4ml的DMF使搅拌其溶解，得到W-2溶液；称取NHS(208mg，1.38mmol)和EDC(264mg,1.38mmol)放入25ml单颈瓶中，加入3ml DMF搅拌使其溶解，得到NHS/EDC溶液；将W-2溶液缓慢地滴入到NHS/EDC溶液中，搅拌过夜(12h)，TLC跟踪检测反应；反应完全后，向反应液中加入饱和食盐水，沉淀析出；过滤收集沉淀，用水冲洗沉淀；将沉淀烘干，得到化合物W-3，即为基于光点击反应且具有荧光响应的DNA标记物；产物427mg，产率96％，其结构式如式Ⅰ所示，图2和3是其核磁共振氢谱图和ESI质谱图。

[0071]

[0072] 表征数据：1H-NMR(DMSO-d6，500MHz):δ[ppm]＝2.13(s，3H)，5.76(s，1H)，5.96(s，1H)，7.24-7.26(d，J＝5Hz，1H)，7.56-7.58(d，J＝5Hz，1H)，7.62(s，1H)，8.16-8.19(t，J＝
5Hz，4H)，8.28-8.34(q，3H)

[0073] (3)将乙胺(81mg，1.8mmol)加入10ml的二氯甲烷中，然后加入步骤(2)制得的W-3(400mg 0.9mmol)搅拌1小时，反应完后减压蒸馏得最终产品W-4327mg，产率96％，其结构式如式Ⅱ所示：

[0074]

[0075] 表征数据：1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)：δ[ppm]＝1.15-1.17(t，J＝5Hz，3H)，2.57-2.60(d，J＝7.5Hz，2H)，3.00-3.06(q，2H)，6.56(s，1H)，8.07-8.16(q，3H)，8.18-8.19(d，J＝2.5Hz，2H)，8.28-8.29(d，J＝2.5Hz，2H)，8.68-8.70(t，J＝3.3Hz，1H)[0076] 实施例2化合物W-4的光学性质

[0077] 将实施例1中得到的四唑化合物W-4与不同的烯烃反应，丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺、二甲胺基丙基丙烯酰胺(DMAPPA)，1-(2-羟乙基)-吡咯-2,5-二酮。W-4的浓度是1μM，四中烯烃化合物的浓度是40μM，在302nm紫外灯下照射2分钟，测四种反应产物的荧光并计算反应产物的荧光量子产率，结果见表1，图4是W-4与四种不同烯烃化合物点击之后的荧光光谱图。

[0078] 表1化合物W-4的荧光量子产率

[0079]

[0080] 实施例3

[0081] 取一管5’端氨基标记的核酸序列离心12000rpm，20min；将离心管盖轻轻打开，快速加入55μL 0.1M硼酸钠缓冲液(PH8.0)迅速盖上管盖；在漩涡仪上充分振荡10min；加入30μL 50mM的四唑化合物W-3(提前用二甲基亚砜配置成50mM的溶液)；将离心管缠上锡箔纸，放在离心管加上振荡孵育14小时；往离心管中加入1ml预冷订的无水乙醇，上下振荡1min；然后放入超低温冰箱静置2小时；离心，12000rpm，4℃，20min；吸去上层澄清溶液，加入1ml预冷1mL预冷订的无水乙醇，上下振荡1min；然后放入超低温冰箱静置2小时；离心，
12000rpm，4℃，20min；吸去上层澄清溶液，静置30min，加55μl无菌水，充分振荡5min；离心，
12000rpm，10min；吸去上层澄清溶液放入离心管中-20℃保存，得到核酸探针，其结构式如式Ⅴ所示，图5是该探针的质谱图。

[0082]

[0083]

[0084] 实施例4标记四唑化合物探针荧光

[0085] 将实施例3中标记的DNA探针1μM与二甲胺基丙基丙烯酰胺40μM按摩尔1:40的比例在302nm的紫外光下发生点击反应，然后分别在分别在pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的磷酸盐缓冲液中测其荧光；

[0086] 实验结果如图6所示，发生点击之后的化合物连接臂中存在具有孤对电子的叔胺N，酸化溶液使氨基质子化，孤对电子受束缚，PET过程受阻，荧光恢复，所以在酸性条件下点击之后的荧光是四唑环的光，荧光波峰是在485nm；碱化溶液使氨基去质子化，孤对电子向缺电子的四唑环转移，导致四唑环的荧光淬灭，所以发出的是香豆素的光，随着碱性溶液的增强四唑环的光被逐渐淬灭在pH8.5的时候四唑环的光消失只有香豆素的光，荧光波峰是在440nm。

[0087] 实施例5光点击前后荧光强度的变化

[0088] 将实施例3中标记的DNA探针与二甲胺基丙基丙烯酰胺按摩尔1:40的比例用Hepes缓冲液稀释DNA探针的浓度为1μM，体积100μL，分别取两管，实验组在302nm的紫外等下照射2min，对照组不进行光照处理，最后进行荧光信号检测，结果如图7A，没有进行光照处理的几乎没有荧光，进行光照处理的发生光点击反应，荧光强度大幅度增加，由此证明四唑化合物在光点击的作用下产生具有荧光响应的基团。图7B是聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析，其中M代表marker，a是DNA探针加二甲胺基丙基丙烯酰胺紫外光照点击之前，b是DNA探针加二甲胺基丙基丙烯酰胺紫外光照点之后，其实验结果与图7A相对应。图7C是光点击前后的紫外吸收结果分析，光点击前最大吸收在330nm，点击后最大吸收在379nm，图7D是点击之后的质谱分析。

[0089] 实施例6 DNA标记物在365nm和302nm紫外光照射下的反应速率

[0090] 将实施例3中标记的DNA探针与异丙基丙烯酰胺按摩尔1:40的比例用5mmol，PH7.5的Hepes缓冲液稀释DNA探针的终浓度是0.5μM，分别用302nm和365nm的紫外光照射。在302nm的紫外光照射下分别测50s、100s、150s、200s、250s的紫外吸收。在365nm的紫外光照射下分别测5min、10min、20min、30min、40min的紫外吸收值。然后计算反应速率。实验的反应条件见表2。

[0091] 其中，k302nm＝164S-1M-1，k365nm＝10.6S-1M-1，图8为在不同紫外光照射下光点击反应速率图。

[0092] 表2本实施例反应条件

[0093]

[0094] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。