CK19联合OV6在制备肝癌分子分型试剂盒及肝癌个体化治疗中的应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，本发明涉及CK19联合OV6在制备肝癌分子分型试剂盒及肝癌个体化治疗中的应用。本发明提供了CK19和OV6联合作为肝癌分子分型标志物的应用价值，以及CK19和OV6组合在制备肝癌分子分型试剂盒中的应用。本发明还建立了肝癌组织中CK19和OV6的检测方法，通过对肝癌组织连续切片进行CK19和OV6的免疫组织化学染色和分析，发现CK19+OV6+肝癌来源于肝前体细胞，且病人预后更差，提示CK19和OV6联合应用可以指导肝癌的分子分型和预后评估。进一步地，使用src抑制剂Dasatinib能显著抑制恶性转化的肝前体细胞的功能，提示Dasatinib可用于肝前体细胞来源的CK19+OV6+肝癌的个性化治疗。

权利要求

1.src激酶抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的肝癌是指CK19+OV6+HCC。

2.根据权利要求1所述的src激酶抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的src激酶抑制剂是指达沙替尼。

说明书

CK19联合OV6在制备肝癌分子分型试剂盒及肝癌个体化治疗

中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及CK19和OV6蛋白的联合应用，具体涉及CK19和OV6蛋白组合在制备肝癌分子分型试剂盒中的应用。本发明中的CK19和OV6蛋白及相应的试剂盒可以用于判定肝前体细胞来源的肝癌(即CK19+OV6+的肝癌)，并可以用于评估此类肝癌病人预后和指导Dasatinib对此类病人进行个性化治疗。

背景技术

[0002] 原发性肝癌是全球第六大常见肿瘤，其病死率位居世界第二位。原发性肝癌按照细胞来源主要分为三种类型：肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(ICC)及混合型肝癌(CHC)。其中HCC是最常见的肝癌类型，约占78％(参见文献Ferlay J,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.International Journal of Cancer2015；136:E359-E386.Laursen L.)。虽然HCC主要起源于肝细胞，但HCC的高度异质性以及部分HCC表达干细胞标志物支持部分HCC来源于肝前体细胞的假设(参见文献Roskams T.Liver stem cells and their implication in hepatocellular and cholangiocarcinoma.Oncogene 2006；25:3818-3822.)。已知约十分之一的HCC表达胆管细胞标志物CK19，CK19的表达与肝癌病人预后不良相关，而且CK19阳性肝癌细胞对常规化疗药和sorafenib不敏感。研究发现CK19+HCC中肝前体细胞相关基因表达明显高于CK19-HCC(参见文献Govaere O,Komuta M,Berkers J,et al.Keratin 19:a key role player in the invasion of human hepatocellular carcinomas.Gut 2013:
gutjnl-2012-304351.)，提示恶性转化的肝前体细胞可能是CK19+HCC的来源之一。恶性转化的肝前体细胞与肝癌干细胞极度类似，与肝癌的复发转移和化疗抵抗密切相关。当然CK19+HCC之所以表达CK19也可能是由于肝细胞去分化表达了胆系的标志物造成的，这种来源的CK19+HCC在病人中也较常见。但是，目前临床上尚没有方法可以鉴别由肝前体细胞恶性转化而来的肝癌和由肝细胞去分化表达胆系标志物如CK19的肝癌，我们认为鉴定肝前体细胞来源的HCC将有助于优化HCC的分子分型及肝癌病人的预后评估和个性化治疗。

[0003] 肝前体细胞主要位于肝脏赫令氏管，具有分化为肝细胞和胆管细胞的双向分化潜能，有研究报道肝前体细胞表达某些特异的标志物如OV6(参见文献Crosby HA,Hubscher SG,Joplin RE,et al.Immunolocalization of OV-6,a putative progenitor cell marker in human fetal and diseased pediatric liver.Hepatology 1998；28:980-985.)。当肝脏发生病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝硬化等慢性损伤时，肝细胞的增殖被抑制，则肝前体细胞会代偿性扩增，其扩增程度与疾病程度呈正相关(参见文献Libbrecht L,et al.Deep intralobular extension of human hepatic‘progenitor cells’correlates with parenchymal inflammation in chronic viral hepatitis:can‘progenitor cells’migrate？The Journal of pathology 2000；192:373-378.)。本发明人所在生物信号转导实验室前期研究发现，HBx的整合或细胞因子TNF-α、TGF-β的长期刺激均能导致肝前体细胞发生恶性转化，参与肝炎、肝硬化引起的肝癌发生(参见文献Wu K,et al.Hepatic transforming growth factor beta gives rise to tumor-initiating cells and promotes liver cancer development.Hepatology 2012；56:2255-2267.)。而且本实验室发现OV6阳性的肝癌细胞具有肿瘤干细胞的特征如化疗抵抗等。以上结果提示肝前体细胞可以作为肝癌的细胞来源，区分肝前体细胞恶性转化来源的肝癌并发现其关键调控因子有助于这部分肝癌的预后判定和个体化治疗。

[0004] 目前CK19和OV6联合作为肝癌分子分型标志物并指导预后和个性化治疗未见文献报道。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供CK19和OV6蛋白的联合应用，特别是在制备肝癌分子分型试剂盒中的应用。

[0006] 本发明的另一个目的是提供一个基于CK19和OV6的肝癌分子分型试剂盒，及该试剂盒在肝前体细胞来源的肝癌类型判定、预后评估及治疗指导中的应用。

[0007] 本发明前期统计发现，本发明人所在的中国人民解放军第二军医大学附属东方肝胆外科医院手术切除的HCC中胆系标志物CK19阳性比例约为9％。由于肝前体细胞表达肝细胞和胆管细胞的标志物，因此其可能是CK19+HCC的主要来源。OV6是公认且常用的肝前体细胞标志物，通过对CK19+HCC进行OV6免疫组织化学染色，我们发现其中约65％呈OV6阳性，说明这部分CK19+OV6+HCC来源于肝前体细胞，提示CK19和OV6的联合应用可指导肝癌的分子分型。

[0008] 进一步地，本发明对CK19+OV6+HCC和CK19+OV6-HCC病人的临床病理特征和预后进行了统计分析，结果发现CK19+OV6+HCC具有更侵袭性的病理特征，且病人预后更差，提示CK19和OV6的联合应用可以用于肝癌的预后评估。

[0009] 更进一步地，本发明经实验发现恶性转化的肝前体细胞中src活性显著增强，是细胞中重要的调控因子；使用src抑制剂Dasatinib能显著抑制其自我更新能力，提示Dasatinib可能用于肝前体细胞来源的CK19+OV6+HCC的个性化治疗。由于Dasatinib已经处于治疗胃肠间质肿瘤的II期临床试验，使得我们的发现能较好地转化至临床。

[0010] 因此，本发明认为，CK19和OV6的联合应用具备作为肝癌分子分型标志物的可能性，并可指导肝癌预后和个性化治疗。

[0011] 本发明的第一方面，提供了CK19和OV6联用在制备肝癌分子分型标志物中的应用。

[0012] 本发明的第二方面，提供了CK19和OV6联用在制备肝癌分子分型试剂盒中的应用。

[0013] 所述的肝癌分子分型试剂盒，鉴别CK19+OV6+HCC和CK19+OV6-HCC。

[0014] 所述的试剂盒，是通过免疫组织化学方法检测生物样品中CK19和OV6的表达情况。

[0015] 所述的试剂盒，包括：特异性识别人CK19的抗体、特异性识别人OV6的抗体、免疫组化实验试剂等。

[0016] 所述的生物样品，为病人肝癌的石蜡包埋组织。

[0017] 本发明的第三方面，提供了上述用于检测肝癌组织中CK19和OV6试剂盒的检测方法，具体步骤如下：

[0018] 1.脱蜡至水

[0019] (1)4μm厚石蜡切片，每个肿瘤组织2张连续切片，60℃烤箱烤1h；

[0020] (2)二甲苯10min x 3次；

[0021] (3)依次经过100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、双蒸水，各5min。

[0022] 2.抗原修复

[0023] (1)3％H2O2甲醇液20min；

[0024] (2)双蒸水洗5minx 3次；

[0025] (3)抗原修复(高压修复)：

[0026] 切片放入盛有EDTA碱性修复液(2mM EDTA、2mM Na2HPO4)的高压锅中，高压煮沸2min，自然冷却至室温。

[0027] 3.一抗孵育

[0028] (1)PBS洗5min；

[0029] (2)50μl 1％BSA覆盖组织，37℃封闭30min；

[0030] (3)吸去封闭液，2张连续切片分别滴加CK19、OV6一抗50μl，湿盒中4℃孵育过夜。

[0031] 4.二抗孵育

[0032] (1)吸走一抗，PBS洗5minx 4次；

[0033] (2)滴加50μl带HRP标记的二抗，37℃孵育30-45min；

[0034] 5.显色、反蓝

[0035] (1)PBS洗5minx 4次；

[0036] (2)DAB(1:50)显色3-10min，至出现砖红色沉淀，双蒸水终止显色；

[0037] (3)苏木素复染10min，盐酸酒精分化后自来水冲洗反蓝20-30min。

[0038] 6.脱水封片

[0039] (1)依次经过双蒸水、75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、石炭酸、二甲苯，各5min。滴加树脂封片。

[0040] 7.分析

[0041] 显微镜下判读CK19和OV6的表达是否为阳性。

[0042] 本发明的第四方面，提供了上述检测肝癌组织中CK19和OV6表达的试剂盒在制备肝癌分子分型试剂盒中的应用。

[0043] 本发明提供了一种肝癌分子分型试剂盒，用于鉴别CK19+OV6+HCC和CK19+OV6-HCC。

[0044] 所述的试剂盒通过免疫组织化学方法检测生物样品中CK19和OV6的表达情况。

[0045] 所述的试剂盒，包括：特异性识别人CK19的抗体、特异性识别人OV6的抗体、免疫组化实验试剂等。

[0046] 所述的生物样品，为病人肝癌的石蜡包埋组织。

[0047] 所述的肝癌，为原发性肝细胞癌。

[0048] 本发明的第五方面，提供了src(肉瘤促癌基因，sarcoma pro-oncogene)激酶抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用，所述的肝癌是指CK19+OV6+HCC。

[0049] 所述的src抑制剂是指Dasatinib(达沙替尼)。

[0050] 本发明提出联合CK19和OV6作为肝癌分子分型标志物，为来源于前体肝细胞的CK19+OV6+肝癌预后评估及个性化治疗提供了重要指导。

附图说明

[0051] 图1为肝癌组织连续切片CK19(A)和OV6(B)的免疫组化染色；

[0052] 图2为CK19+OV6+与CK19+OV6-HCC病人的无瘤生存曲线；

[0053] 图3为正常和恶性转化的肝前体细胞在Dasatinib作用下的成球实验；

[0054] 图4为CK19+OV6+病例肝癌组织切片CK19(A)和OV6(B)的免疫组化染色；

[0055] 图5为CK19+OV6+病例肝癌组织切片CK19(A)和OV6(B)的免疫组化染色；

[0056] 图6为CK19+OV6-病例肝癌组织切片CK19(A)和OV6(B)的免疫组化染色；

[0057] 图7为CK19+OV6-病例肝癌组织切片CK19(A)和OV6(B)的免疫组化染色。

具体实施方式

[0058] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

[0059] 实施例1：CK19阳性肝癌病人组织中OV6表达的检测

[0060] 我们通过检索东方肝胆外科医院手术切除的肝癌的病理信息，发现肝癌中胆系标志物CK19阳性比例约为9％。然后随机选取102例CK19+HCC进行肝前体细胞标志物OV6的免疫组织化学染色，OV6抗体购自R&D公司，稀释比例为1:100，抗原修复条件为高压碱性修复。结果发现其中约65％为CK19+OV6+HCC(见图1)，这部分CK19+OV6+HCC可能来源于肝前体细胞，提示CK19和OV6的联合应用可指导肝癌的分子分型。

[0061] 实施例2：CK19+OV6+HCC与CK19+OV6-HCC病人的预后分析

[0062] 我们对上述102例CK19+肝癌病人进行随访，记录病人复发时间(复发时间指从手术日至诊断肿瘤复发日)。根据免疫组织化学结果，CK19+肝癌被分为CK19+OV6+HCC与CK19+OV6-HCC，采用Kaplan–Meier法对CK19+OV6+HCC与CK19+OV6-HCC病人的无瘤生存期进行比较分析，发现CK19+OV6+HCC病人无瘤生存期更短，预后更差(见图2)。这一结果提示CK19和OV6的联合应用可指导肝癌病人的预后判定。

[0063] 实施例3：src抑制剂Dasatinib对恶性转化的肝前体细胞的作用

[0064] 我们建立了恶性转化的肝前体细胞系WB-TNF(肝前体细胞系WB-F344经1ng/ml TNF-α连续刺激20周后稳定成系)，构建方法如下：

[0065] 1.含0.5％胎牛血清的DMEM贴壁培养肝前体细胞系WB-F344，培养基中加入1ng/ml TNF-α；

[0066] 2.每两天进行胰酶消化、细胞传代，待细胞贴壁后继续向培养基中加入1ng/ml TNF-α；

[0067] 3.如1、2所述培养20周，建成恶性转化的肝前体细胞系WB-TNF。

[0068] 结果发现恶性转化的肝前体细胞中p-src水平明显升高，且对细胞具有重要的调控作用。

[0069] 之后，我们采用src抑制剂Dasatinib(购自Selleck公司)处理WB-TNF进行成球实验，结果发现Dasatinib能显著抑制恶性转化的肝前体细胞的自我更新(见图3)，提示+ +Dasatinib可用于肝前体细胞恶性转化来的HCC(CK19OV6 )的个性化治疗。

[0070] 实施例4：检测实例一

[0071] 样本：某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法检测CK19和OV6蛋白在肝癌组织中的表达情况。肝癌组织的显微图片如图4所示。经镜下观察，其癌组织中CK19+OV6+。

[0072] 经术后随访，该患者术后13个月死亡，无瘤生存期仅5个月。

[0073] 实施例5：检测实例二

[0074] 样本：某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法检测CK19和OV6蛋白在肝癌组织中的表达情况。肝癌组织的显微图片如图5所示。经镜下观察，其癌组织中CK19+OV6+。

[0075] 经术后随访，该患者术后7个月死亡，无瘤生存期仅3个月。

[0076] 实施例6：检测实例三

[0077] 样本：某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法检测CK19和OV6蛋白在肝癌组织中的表达情况。肝癌组织的显微图片如图6所示。经镜下观察，其癌组织中+ -CK19OV6。

[0078] 经术后随访，该患者术后60个月仍健在，无复发。

[0079] 实施例7：检测实例四

[0080] 样本：某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法检测CK19和OV6蛋白在肝癌组织中的表达情况。肝癌组织的显微图片如图7所示。经镜下观察，其癌组织中CK19+OV6-。

[0081] 经术后随访，该患者术后60个月仍健在，无复发。

[0082] 由以上实验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测CK19和OV6蛋白表达能预测肝细胞癌患者术后的生存或死亡。当癌组织中CK19+OV6+时，肝细胞癌易复发，肝癌患者术后易死亡。因此，以CK19联合OV6作为分子分型标志物对其表达进行检测能预测肝细胞癌手术后复发等事件，并判断预后。相应的，特异性抗CK19和OV6的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备肝癌分子分型的制剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。

[0083] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。