一种检测小麦冬春性和光周期特性的方法

摘要

本发明公开了一种检测小麦冬春性和光周期特性的方法。本发明提供了一种检测或辅助检测小麦冬春性的方法，包括如下步骤：1)将待测种子分批进行春化0天和春化60天处理，得到待测小麦春化0天种子和待测小麦春化60天种子；2)将所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子分别依次进行移栽和培育，分别检测所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子从移栽至开花的时间，根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性。本发明方法更加简便、省力，且准确率高，可为育种人员提供简易、可靠的辅助检测手段，提高育种效率。

权利要求

1.一种检测或辅助检测小麦冬春性的方法，包括如下步骤：

1)将待测种子分批进行春化0天和春化60天处理，得到待测小麦春化0天种子和待测小麦春化60天种子；

2)将所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子分别依次进行移栽和培育，分别检测所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子从移栽至开花的时间，根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性；

所述根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性为如下1)或2)：

1)为：

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值小于等于7，则待测小麦为或候选为春性小麦；

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值大于7，则待测小麦为或候选为冬性小麦；

2)为：

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值小于等于7，则待测小麦为或候选为春性小麦；

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于7且小于等于13，则待测小麦为或候选为半冬性小麦；

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于13且小于等于19，则待测小麦为或候选为冬性小麦；

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于19，则待测小麦为或候选为强冬性小麦。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

在步骤1)前，还包括如下步骤：将每批待测种子春化前2天进行萌动处理。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述春化的温度为3℃。

4.一种检测或辅助检测小麦冬春性和光周期特性的方法，包括如下步骤：

1)将待测种子分批进行春化0天和春化60天处理，得到待测小麦春化0天种子和待测小麦春化60天种子；

2)将所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子分别依次进行移栽和培育，分别检测所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子从移栽至开花的时间，根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性和光周期；

所述根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性和光周期如下1)或2)：

1)为：

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值小于等于7，则待测小麦为或候选为春性小麦；

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值大于7，则待测小麦为或候选为冬性小麦；

若所述待测小麦春化60天种从移栽至开花天数小于等于63，则待测小麦为或候选为光钝型小麦；

若所述待测小麦春化60天种从移栽至开花天数大于63，则待测小麦为或候选为光敏型小麦；

2)为：

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值小于等于7，则待测小麦为或候选为春性小麦；

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于7且小于等于13，则待测小麦为或候选为半冬性小麦；

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于13且小于等于19，则待测小麦为或候选为冬性小麦；

若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于19，则待测小麦为或候选为强冬性小麦；

若所述待测小麦春化60天种从移栽至开花天数小于等于63，则待测小麦为或候选为光钝型小麦；

若所述待测小麦春化60天种从移栽至开花天数大于63，则待测小麦为或候选为光敏型小麦。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

在步骤1)前，还包括如下步骤：将每批待测种子春化前2天进行萌动处理。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述春化的温度为3℃。

说明书

一种检测小麦冬春性和光周期特性的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测小麦冬春性和光周期特性的方法。

背景技术

[0002] 小麦作为世界最重要的粮食作物之一，其最基本的特征是其广泛的适应性，起源于中东地区的小麦已分布到世界大部分地区。在各种不同气候条件下种植的小麦品种分别具有特定的环境适应性，其中春化和光周期特性是对不同气候条件适应性具有决定性的发育特性。而近年来气候波动加剧，干扰了作物发育的稳定性，粮食生产受到很大影响。小麦“生殖物候”的稳定性在品种间存在明显差异，而春化特性与光周期反应等则是影响该“生殖物候”稳定性的性状。

[0003] 从20世纪初前苏联学者李森科(Lysenko)提出春化理论以来，有关其春化作用一直是植物学家们研究的热点，近年来，由于小麦春化反应的复杂性和反应类型的多样性，国内外学者从不同角度和层次对小麦春化特性进行了大量的研究。目前，小麦冬春性鉴定有大田鉴定与分子标记鉴定2种。小麦品种冬春性的大田鉴定方法：首先看苗期的苗相，一般认为苗期匍匐、半匍匐或直立苗相可分别认为该品种为冬性、半冬性或春性，其次从起身、拔节、抽穗、开花的时间来看，早者为春性，晚者为冬性。在大田鉴定中，认为采取分期播种方法鉴定冬春性能较为准确的反映品种的冬春性，具体可参照《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南-普通小麦》(国家标准，GB/T19557.3-2004)的鉴定方法。

[0004] 由于小麦冬春性的田间鉴定易受环境和人为因素及光周期反应的影响，鉴定结果具有一定的误差、且较费时费力，周期较长。随着分子生物学的发展，多种分子标记手段被用于小麦春化基因的研究中。最初有的学者曾认为冬性对春性为显性，而后来的许多学者都得出春性对冬性基本上为显性的结论。当前的研究表明，至少有5个基因控制小麦春化作用，早期定名为Vrn1、Vrn2、Vrn3、Vrn4和Vrn5，大部分也开发出相应的标记用于实践，但常常单一方法均存在鉴定不准确，需要2者结合才能更为准确的鉴定品种的冬春性。

[0005] 小麦对光照的反应可分为迟钝型、中等敏锐型和敏感型三个类型。光周期反应主要由3个部分同源基因控制，即Ppd-D1、Ppd-B1和Ppd-A1(以前分别定名为Ppdl、Ppd2和Ppd3)，分别被定位于小麦第二染色体2D、2B和2A染色体短臂上，相关标记也已开发。但对于冬春性、光周期反应的鉴定也很难同时进行，目前的鉴定通常分别按照各自分子标记检测结果结合大田表现数据判定，费事、费工。因此，建立一种简单、快速的小麦冬春性和光周期反应鉴定方法显得尤为重要。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测小麦冬春性的方法。

[0007] 本发明提供的方法，包括如下步骤：

[0008] 1)将待测种子分批进行春化0天和春化60天处理，得到待测小麦春化0天种子和待测小麦春化60天种子；

[0009] 2)将所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子分别依次进行移栽和培育，分别检测所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子从移栽至开花的时间，根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性。

[0010] 上述方法中，所述根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性为如下：

[0011] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值小于等于7，则待测小麦为或候选为春性小麦；

[0012] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值大于7，则待测小麦为或候选为冬性小麦。

[0013] 上述方法中，所述根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性为如下：

[0014] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值小于等于7，则待测小麦为或候选为春性小麦；

[0015] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于7且小于等于13，则待测小麦为或候选为半冬性小麦；

[0016] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于13且小于等于19，则待测小麦为或候选为冬性小麦；

[0017] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于19，则待测小麦为或候选为强冬性小麦。

[0018] 上述方法中，在步骤1)前，还包括如下步骤：将每批待测种子春化前2天进行萌动处理。

[0019] 上述方法中，所述春化的温度为3℃。

[0020] 本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测小麦冬春性和光周期特性的方法。

[0021] 本发明提供的方法，包括如下步骤：

[0022] 1)将待测种子分批进行春化0天和春化60天处理，得到待测小麦春化0天种子和待测小麦春化60天种子；

[0023] 2)将所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子分别依次进行移栽和培育，分别检测所述待测小麦春化0天种子和所述待测小麦春化60天种子从移栽至开花的时间，根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性和光周期。

[0024] 上述方法中，

[0025] 所述根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性和光周期如下：

[0026] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值小于等于7，则待测小麦为或候选为春性小麦；

[0027] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值大于7，则待测小麦为或候选为冬性小麦。

[0028] 若所述待测小麦春化60天种从移栽至开花天数小于等于63，则待测小麦为或候选为光钝型小麦；

[0029] 若所述待测小麦春化60天种从移栽至开花天数大于63，则待测小麦为或候选为光敏型小麦。

[0030] 上述方法中，

[0031] 所述根据不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性和光周期如下：

[0032] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子从移栽至开花天数的差值小于等于7，则待测小麦为或候选为春性小麦；

[0033] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于7且小于等于13，则待测小麦为或候选为半冬性小麦；

[0034] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于13且小于等于19，则待测小麦为或候选为冬性小麦；

[0035] 若所述待测小麦春化60天种子与所述待测小麦春化0天种子移栽至开花天数的差值大于19，则待测小麦为或候选为强冬性小麦；

[0036] 若所述待测小麦春化60天种从移栽至开花天数小于等于63，则待测小麦为或候选为光钝型小麦；

[0037] 若所述待测小麦春化60天种从移栽至开花天数大于63，则待测小麦为或候选为光敏型小麦。

[0038] 上述方法中，在步骤1)前，还包括如下步骤：将每批待测种子春化前2天进行萌动处理。

[0039] 上述方法中，所述春化的温度为3℃。

[0040] 本发明的实验证明，本发明通过将待测种子分批进行春化0天和春化60天处理，更加不同春化时间小麦种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性及光周期；相对于传统冬春性及光周期特性检测方法，本发明更加简便、省力，且准确率高，可为育种人员提供简易、可靠的辅助检测手段，提高育种效率。

附图说明

[0041] 图1为分期播种材料的大田表现。

[0042] 图2为Ppd-D1a标记检测部分材料电泳图。

具体实施方式

[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0045] 冬性小麦为温度在0～5℃，经历大于等于15天春化的小麦；

[0046] 春性小麦是温度在0～5℃，经历小于15天时间春化的小麦。

[0047] 其中，冬性小麦又分为强冬性小麦和半冬性小麦

[0048] 强冬性小麦为温度在0～5℃，经历大于等于30天春化的小麦；

[0049] 半冬性小麦为温度在0～5℃，经历大于等于15天且小于30天春化的小麦；

[0050] 光钝型小麦是指小麦发育进程不受光照时间及光照强度影响的小麦；

[0051] 光敏型小麦是指小麦发育进程受光照时间及光照强度影响的小麦。

[0052] 实施例1、检测小麦冬春性和光周期特性的方法确定

[0053] 一、本发明方法的确立

[0054] 试验材料：泰山1号、济南13、济南16、济南17、济麦19、济麦20、济麦21、济麦22、汶农14、汶农19、20104188、鲁原502、R502无芒-2、泰农18、泰农9236、山农17、山农20、山农22、山农辐63、LS6109、SH5099、SN055849、SN056035、SN086218、鲁麦14、鲁麦21、烟农19、烟农25、烟农321、烟5158、烟农5286、洲元9369、11鉴142、山农6343、AR132、农大3743、农大3753、农大3744、农大3588、小偃13-1-1、Jagger、冀师02-1、冀糯200、豫麦34、白糯麦、苏麦3号、渝麦0926、绵麦37、WHEAR、等49个品种(系)。

[0055] 试验方法：每个品种挑选籽粒饱满、均匀一致的籽粒60粒，分为3等份(每份20粒)，放入培养皿，分别萌动(室温条件下在水中浸泡种子)2天，得到3批处理后小麦种子；

[0056] 将3批处理后小麦种子分别置于冰箱3℃下春化60、30和0天后，同一天移栽大田，统计待测小麦第一批春化种子、待测小麦第二批春化种子、待测小麦第三批春化种子从移栽至开花的时间。

[0057] 上述试验连续2年进行，萌动、春化、移栽处理时间表(分别在2012-2013，2013-2014年度进行2次重复)如下：

[0058] 第一批春化处理时间：12月14日萌动，12月16日—2月20春化60天；

[0059] 第二批春化处理时间：1月18日萌动，1月20日—2月20春化30天；

[0060] 第三批春化处理时间：2月18日萌动，2月20日—2月20春化0天；

[0061] 2月21日，3批材料移栽大田。

[0062] 统计各批次种子从移栽至开花的时间并计算第二批与第一批移栽至开花天数的差值、第三批与第一批移栽至开花天数的差值、第三批与第二批移栽至开花天数的差值，结果见表1所示，可以看出，第一批春化60天后，从移栽至开花天数，最短为山农辐射63，仅为56天；最长的为Jagger，达69天，平均为62天。第二批春化30天后，从移栽至开花天数，最短为山农辐射63，为59天；最长的为山农6343，达77天，平均为66天；第三批春化0天后，从移栽至开花天数，最短为山农辐射63，为66天；最长的为山农6343，达84天，平均为72天。可见，春化时间越长，从移栽至开花天数愈短。为此，结合3批移栽至开花天数差值及多年的田间育种经验，总结出判定冬春性及光周期反应的标准。

[0063] 判定冬春性的标准：

[0064] 第三批与第一批移栽至开花天数的差值：≤7：春性

[0065] 7<第三批与第一批移栽至开花天数的差值≤13：半冬性

[0066] 13<第三批与第一批移栽至开花天数的差值≥19：冬性

[0067] 第三批与第一批移栽至开花天数的差值>19：强冬性

[0068] 判定光钝型和光敏型反应判定标准：

[0069] 第一批移栽至开花天数≤63：光钝型

[0070] 第一批移栽至开花天数＞63：光敏型。

[0071] 通过上述标准，判断待测品种的春冬性和/或光敏性光钝型，结果也如表1所示。

[0072] 表1统计移栽至开花的天数及移栽至开花天数差值及判定结论

[0073]

[0074]

[0075] 因此，可以通过检测待测小麦第一批春化种子、待测小麦第二批春化种子、待测小麦第三批春化种子从移栽至开花的时间，根据不同批次小麦春化种子从移栽至开花的时间确定待测小麦冬春性、光敏型或光钝型。

[0076] 二、验证本发明的方法

[0077] 1、冬春性鉴定

[0078] 冬春性鉴定具体方法为：分别以钱交麦、泰山1号和中国春作为冬性、半冬性和春性对照。将上述材料及对照材料分6次进行播种，第1期正常播种(2013年10月19日)，第2期至第6期延期播种，播种时间分别为2014年2月25日、3月5日、3月19日、3月26日、4月2日，正常田间管理。

[0079] 2014年6月4日，根据延期播种的第2-6期抽穗结果，结合冬性、半冬性、春性品种的抽穗情况，综合判定供试材料的冬春性：

[0080] 强冬性品种钱交麦在第4-6期无法正常抽穗，仅表现为无效分蘖的生长，不能由营养生长转变为生殖生长；

[0081] 半冬性品种泰山1号在第2-3期能抽穗，但抽穗不完全，第4-6期所有单株均无法正常抽穗，只表现为无效分蘖生长；

[0082] 春性品种中国春在所有第2-4期延期播种中均能正常抽穗，无效分蘖基本退化，5-6期也无法正常抽穗，只表现为无效分蘖的生长。

[0083] 根据以上分析，

[0084] 第2期就无法抽穗的材料，可以判定为强冬性；

[0085] 第2期能正常抽穗，从第3期抽穗不完全或无法抽穗的材料，可以判定为冬性；

[0086] 第2、3期可以正常抽穗，从第4期开始未能正常抽穗，可以判定为半冬性；

[0087] 第2-6期仍能抽穗，无效分蘖已基本退化或者存在极少无效分蘖未完全退化，可以判定为春性。

[0088] 根据田间调查结果，判定冬春类型见表2。

[0089] 与上述一表1本发明的方法判断的结果比较，仅济麦21的冬春性鉴定有差异，本发明的方法鉴定为半冬性，分期播种鉴定为冬性。可见，本发明的方法具有一定的准确性，是可靠可行的。

[0090] 表2为分期播种的冬春性鉴定结果

[0091]品名 冬春性类型 品名 冬春性类型 品名 冬春性类型
泰山1号 半冬性 山农22 半冬性 山农6343 强冬性
济南13 半冬性 山农辐63 半冬性 AR132 春性
济南16 半冬性 LS6109 冬性 农大3743 半冬性
济南17 半冬性 SH5099 半冬性 农大3753 半冬性
济麦19 冬性 SN055849 半冬性 农大3744 半冬性
济麦20 半冬性 SN056035 半冬性 农大3588 半冬性
济麦21 冬性 SN086218 半冬性 小偃13-1-1 半冬性
济麦22 半冬性 鲁麦14 半冬性 Jagger 春性
汶农14 半冬性 鲁麦21 半冬性 冀师02-1 半冬性
汶农19 半冬性 烟农19 冬性 冀糯200 春性
20104188 半冬性 烟农25 半冬性 豫麦34 春性
鲁原502 半冬性 烟农321 冬性 白糯麦 春性
R502无芒-2 半冬性 烟5158 半冬性 苏麦3号 春性
泰农18 半冬性 烟农5286 半冬性 渝麦0926 春性
泰农9236 强冬性 洲元9369 半冬性 绵麦37 春性
山农17 冬性 11鉴142 半冬性 WHEAR 春性
山农20 半冬性        

[0092] 2、光周期反应鉴定

[0093] 光周期反应鉴定以Ppd-D1位点等位变异类型Ppd-D1a和Ppd-D1b的标记鉴定结果判定引物分别为：Ppd-D1b(F：ACGCCTCCCACTACACTG(序列1)；R：TGTTGGTTCAAACAGAGAGC(序列2))；Ppd-D1a(F：ACGCCTCCCACTACACTG(序列3)；R：CACTGGTGGTAGCTGAGATT(序列4))。携带Ppd-D1a的材料为光周期非敏感型(简称光钝型)，否则为光周期敏感型(简称光敏型)。

[0094] 具体方法：在上述49个材料3叶期时，采用SDS法对其进行基因组DNA的提取，作为Ppd-D1位点等位变异类型Ppd-D1a和Ppd-D1b的标记PCR扩增的模板。

[0095] PCR反应总体系为20μL，其中，2×PCR MIX溶液10μl，引物各溶液0.6μl，待检测DNA模板(DNA浓度100ng/μl，用量约为1μl)，用ddH2O调终体积20μl。同时设置阴性对照，阴性对照不加模板。

[0096] PCR反应程序为：首先94℃，3min；然后94℃30s，52℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min；4℃，保存，严格按此执行。PCR产物在1.2％琼脂糖胶进行电泳，拍照并统计结果。

[0097] Ppd-D1a基因检测结果如图2所示，1-24分别为1：济南13；2：济麦17；3：济南16；4：20104188；5：济麦19；6：SN086218；7：济麦20；8：济麦21；9：洲元9369；10：济麦22；11：11鉴
142；12：WHEAR；13：LS6109；14：SH5099；15：山农22；16：农大3753；17：农大3743；18：AR132；
19：烟农321；20：泰农9236；21：渝麦0926；22：白糯麦；23：农大3588；24：山农辐63，有288bp目的条带，则含有Ppd-D1a基因。

[0098] 同样将Ppd-D1b基因的扩增产物进行电泳，有414bp目的条带，则含有Ppd-D1b基因。

[0099] 将有288bp目的条带或有414bp目的条带定义为1，没有288bp目的条带或没有414bp目的条带，定义为0，统计结果见表2。结果表明：含有Ppd-D1a基因的材料为光钝型，含有Ppd-D1b基因的为光敏型。分子标记检测结果表明：仅有3个材料与本发明的方法所得结论不太相符，其余均一致(图1、表2)；分析，可能与这些分子标记的准确、可靠程度等有关。
综合分期播种及分子标记结果可以证明本发明专利可靠、准确，且简单、易操作、准确性高，为小麦冬春性、光周期鉴定提供了一种行之有效的简易方法。

[0100] 表2为光周期基因在参试材料的检测结果

[0101]