靶向免疫治疗胰腺癌的载药纳米微粒及其应用

摘要

本发明提供了一种用于治疗胰腺癌的靶向载体，其包括：用于靶向识别胰腺癌细胞的CD44v6单链抗体、以及纳米载体IONP‑PEI；其中CD44v6单链抗体与纳米载体IONP‑PEI偶联。另一方面，本发明提供了一种用于治疗胰腺癌的纳米微粒，其包括前述靶向载体、沉默RNA、以及吉西他滨化疗药物，其中，沉默RNA和吉西他滨复合于前述靶向载体上。本发明构建了高效、安全、具有靶向功能的非病毒基因载体。将沉默RNA和吉西他滨通过纳米载体偶联，并且与抗CD44v6单链抗体偶联，将基因治疗、化疗和生物靶向治疗联合应用，为抗胰腺癌新型药物研发提供了新思路和科学依据。

权利要求

1.一种用于治疗胰腺癌的纳米微粒，其包括靶向载体、以及沉默RNA，其中，所述沉默RNA搭载于所述靶向载体上；

所述靶向载体包括用于靶向识别胰腺癌细胞的CD44v6单链抗体、以及纳米载体IONP-PEI，其中所述CD44v6单链抗体与所述纳米载体IONP-PEI偶联；

所述沉默RNA为Bmi-1基因的沉默RNAs，即siBmi-1；

所述纳米微粒进一步包括吉西他滨化疗药物，所述吉西他滨化疗药物与所述siBmi-1共载于所述胰腺癌靶向载体上。

说明书

靶向免疫治疗胰腺癌的载药纳米微粒及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及用于治疗胰腺癌的靶向载体、纳米微粒及其应用

背景技术

[0002] 胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，具有发病隐匿、易转移、长期生存率低的特点。根治性手术切除是治疗胰腺癌的首选方法，但大多数胰腺癌患者确诊时已属晚期，手术切除率<20％，化疗是主要治疗手段，但由于肿瘤化疗耐药的存在，化疗药物效果不甚理想，开发新的药物以更有效地治疗胰腺癌是临床迫切需要解决的问题。自1997年起，吉西他滨是临床抗胰腺癌治疗的一线药物，但在远期疗效和预后方面并未取得突破性进展，其原因可能与肿瘤细胞对吉西他滨耐药有关。B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入区1(B lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion region 1，Bmi-1)蛋白在人类多种恶性肿瘤中高表达，如头颈部肿瘤、乳腺癌、胰腺癌，其表达与肿瘤的发生发展有关。Bmi-1参与细胞周期、干细胞增殖、分化与衰老的调控，也可以诱导细胞的早期转化。研究表明抑制Bmi-1的表达可以抑制胰腺癌细胞的增殖，甚至可以逆转胰腺癌细胞的恶性特性、增加胰腺癌细胞的药物敏感性。siRNAs(small interference RNA)诱导的RNA干扰是特异性沉默靶基因的有利工具，但是缺乏有效载体限制了其体内应用。目前聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)是最为广泛应用的纳米载体，其具有阳性电荷，能与带阴性电荷的细胞膜结合，获得较高的转染率，从而将siRNA带入细胞内发挥作用。将吉西他滨和生物靶向药物联合应用来提高疗效和降低反应毒性是近年来研究最为活跃的领域之一。联合使用siRNAs和化疗药物，将化疗和基因治疗联合应用得到更强大、更持久的协同抗肿瘤作用。利用纳米材料将化疗药物包封，和包载siRNAs的纳米载体同时输送至胞内，可减低药物的急性毒性并提高疗效。另外，纳米载体还可以偶联抗体，利用抗体靶向识别抗原的特性，将包载的基因或药物靶向输送到肿瘤细胞，在增强抗瘤效应的同时减低对正常组织细胞的非特异毒性。IONP(magnetic iron oxide nanoparticles)是一种能向 细胞输送药物且具有磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)成像功能的载体。胰腺癌细胞高表达抗粘附因子CD44v6，可作为识别胰腺癌的标靶。抗CD44v6单链抗体(the anti-CD44v6single chain variable fragment，scFvCD44v6)具有高度亲和力和靶向性，能够靶向地识别胰腺癌细胞。
发明人前期研究表明，载药(基因)纳米微粒与单链抗体进行交联制成免疫纳米微粒，可提高药物对肿瘤细胞的选择性，达到提高疗效、降低毒副作用的目的。

发明内容

[0003] 本发明提供了一种用于治疗胰腺癌的靶向载体，其包括：用于靶向识别胰腺癌细胞的CD44v6单链抗体、以及纳米载体IONP-PEI；其中CD44v6单链抗体与纳米载体IONP-PEI偶联。CD44v6单链抗体与纳米载体IONP-PEI偶联后在体内外均能够靶向地识别胰腺癌细胞。

[0004] 另一方面，本发明提供了一种用于治疗胰腺癌的纳米微粒，其包括前述靶向载体、以及沉默RNA，其中，沉默RNA搭载于前述靶向载体上。

[0005] 具体而言，沉默RNA为Bmi-1基因的沉默RNAs，即siBmi-1。该搭载了siBmi-1的纳米微粒可沉默胰腺癌细胞Bmi-1基因表达，引起Panc-1细胞克隆形成能力减弱、细胞周期阻滞、增殖受抑、迁移和侵袭减少。

[0006] 进一步地，纳米微粒包括吉西他滨化疗药物(以下简称吉西他滨)，吉西他滨与siBmi-1共载(复合)于胰腺癌靶向载体上。该共载了吉西他滨和siBmi-1的纳米微粒可有效地沉默Bmi-1基因表达，诱导细胞凋亡，在抑瘤方面具有协同效应。

[0007] 本发明构建了高效、安全、具有靶向功能的非病毒基因载体。将siRNAs和吉西他滨通过纳米载体偶联，并且与抗CD44v6单链抗体偶联，将基因治疗、化疗和生物靶向治疗联合应用，为抗胰腺癌新型药物研发提供了新思路和科学依据。

附图说明

[0008] 图1为实施例1中，N/P比值为20时IONP-PEI(非靶向组)和scFv-IONP-PEI(靶向组)转染Panc-1细胞后荧光显微镜下观察；

[0009] 图2为实施例1中，scFv-IP/siRNAs纳米微粒的细胞内吞及在细胞内的分布，FITC-标记的小鼠抗人6×His tag抗体特异性与scFvCD44v6结合，因此内吞scFv-IP/siRNAs的Panc-1细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光；

[0010] 图3为实施例1中，N/P比值为20时IONP-PEI(非靶向组)和scFv-IONP-PEI(靶向组)的转染率，(*vs lipo,#vs scFv-IONP-PEI,P<0.05)；

[0011] 图4为实施例1中，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1转染Panc-1细胞后对细胞增殖的影响；

[0012] 图5为实施例1中，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1转染Panc-1细胞后对细胞克隆形成能力的影响；

[0013] 图6为实施例1中，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1转染Panc-1细胞后对细胞迁移、侵袭能力的影响；

[0014] 图7为实施例1中的活体荧光呈像：IP/siRNAs和scFv-IP/siRNAs在体内不同时间段的分布(小鼠尾静脉注射IP/siRNAs和scFv-IP/siRNAs后不同时间点荧光物质在体内的分布)；

[0015] 图8为实施例1中的离体荧光呈像：小鼠尾静脉分别注射IP/siRNAs和scFv-IP/siRNAs后，48小时后将小鼠安乐死，取出各组织器官进行离体组织呈像；

[0016] 图9为实施例2中，scFv-Gem-IONP复合物的透射电镜图；

[0017] 图10为实施例2中，scFv-Gem-IONP复合物中吉西他滨释放曲线；

[0018] 图11为实施例2中，Panc-1细胞经过不同处理组后细胞毒性(Gem，Gem-IONP，scFv-Gem-IONP，scFv-Gem-IONP/siBmi-1在不同浓度作用于Panc-1细胞后对细胞的杀伤作用)；

[0019] 图12为实施例2中，不同处理组裸鼠移植瘤组织学检查，小鼠尾静脉注射PBS (control)、IP-SCR、IP-siBmi-1及scFv-IP-siBmi-1后，实验终点将各组移植瘤组织进行Bmi-1染色检测各组织Bmi-1蛋白表达情况检测各组体内沉默Bmi-1表达情况；

[0020] 图13为实施例2中，不同处理组裸鼠移植瘤组织学检查，小鼠尾静脉注射PBS(control)、Gem、Gem-IONP、scFv-Gem-IONP、scFv-Gem-IONP/siBmi-1，实验终点将各组移植瘤组织进行Bmi-1、Bcl-2、Bax染色检测各组Bmi-1基因沉默效果及凋亡相关蛋白表达。

具体实施方式

[0021] 实施例1

[0022] 本实施例的靶向载体包括CD44v6单链抗体、以及纳米载体IONP-PEI，其搭载了siBmi-1。本实施例的内容包括实验方法和结论分析两部分。

[0023] 一、实验方法

[0024] 1、细胞培养

[0025] 人胰腺癌细胞株Panc-1在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，恒温37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0026] 2、靶向载体构建

[0027] scFvCD44v6(CD44v6单链抗体)按照中国专利2011102402903、2011102402871所披露的方法合成。scFvCD44v6与PEI按质量比1：1偶联，过程简述如下：

[0028] ①按照比例制备IONP-PEI复合物，将mal-PEG-NHS溶于灭菌去离子水，与scFv按照摩尔比为1:10加入复合物中，混匀，室温孵育30min；

[0029] ②将已制备的scFvCD44v6与PEI按照质量比为1:1加入上述复合物中，4℃过夜；

[0030] ③使用前5KD的MILLIPORE超滤离心管3000r/min离心10min去除游离的抗体，得到纯化的靶向载体scFv-IONP-PEI(scFv-IP)。

[0031] 3、scFv-IP/siRNAs复合物(搭载siBmi-1的靶向载体)的制备

[0032] 按IONP质量为5μg，IONP和PEI质量比为0.75，制备IONP-PEI复合物；按照不同的N/P比值，将一定量的siRNAs溶液与IP溶液在去离子水中轻轻混匀(中号加样枪轻轻吹吸5次)，室温静置孵育20分钟，即得到不同N/P值的IP/siRNAs复合物。

[0033] 4、荧光显微镜观察scFv-IP/siRNAs纳米微粒在细胞内的分布

[0034] (1)分别以IP/siRNAs、scFv-IP/siRNAs转染Panc-1细胞，具体过程如下：

[0035] A、Panc-1细胞接种在24孔板，5×104/孔，无抗生素完全培养基中贴壁生长24小时。

[0036] B、siRNAs浓度为100nmol/L。按N/P比值＝20制备IP/FAM-siRNAs复合物，混匀后室温静置20分钟，然后加入100μl转染专用培养基Opti-MEM中混匀。

[0037] C、弃去24孔板中旧DMEM培养基，每孔加入400ul新鲜的无血清DMEM培养基。然后将上述100μl混合物逐滴加入孔板中，轻轻摇匀。37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0038] D、为观察IP/FAM-siRNAs复合物在Panc-1细胞内的分布情况，转染6小时后，去除旧培养基，PBS轻轻洗细胞一遍后，加入1ml PBS。然后在荧光显微镜下观察细胞荧光图像。避光操作。

[0039] (2)转染6小时后，弃去旧培养基，以PBS洗三次，每孔加入500μl多聚甲醛 (4％)室温固定5分钟。

[0040] (3)PBS轻轻洗细胞2次。

[0041] (4)每孔加入200μl 1％BSA/PBS，室温下低速摇床封闭30min。

[0042] (5)去除封闭液，PBS轻轻洗细胞2次。

[0043] (6)孵育二抗。加入FITC标记小鼠抗6×His tag单克隆抗体(10μg/ml)，室温下低速摇床、避光孵育30min。

[0044] (7)去除二抗，加入PBS轻轻洗细胞2次。

[0045] (8)染核。Hoechest 33342工作液染核5min。

[0046] (9)PBS轻轻洗细胞2次。加入少量PBS，然后在荧光显微镜下观察、拍照。

[0047] 5、转染率分析

[0048] 按N/P比值20形成scFv-IP/FAM-siRNAs复合物，并以IP/FAM-siRNAs复合物作为对照，转染Panc-1细胞。siRNAs浓度为100nmol/L，流式细胞仪检测各组转染率。转染过程具体如下：

[0049] (1)为测定IP/FAM-siRNAs对Panc-1细胞的转染率，将不同NP比值的IP/FAM-siRNAs复合物转染6小时后弃上清，用PBS洗涤3次，用0.25％的胰酶-Na2EDTA把细胞从24孔板上消化下来，900rpm离心4分钟，弃上清。

[0050] (2)PBS重悬细胞，900rpm离心4分钟，去上清。

[0051] (3)用0.5ml PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。以上均为避光操作。

[0052] 6、siBmi-1转染Panc-1细胞

[0053] 按N/P比值20形成scFv-IP/siBmi-1或IP/si Bmi-1复合物，转染Panc-1细胞，以IP/SCR作为对照。siRNAs浓度为100nmol/L，选取N/P＝20通过IP向Panc-1细胞转染siBmi-1。Panc-1细胞转染前一天铺板密度为2×105/孔(6孔板)。siBmi-1 浓度为100nmol/L。按N/P比值＝20制备IP/FAM-siRNAs复合物，混匀后室温静置20分钟，然后加入100μl转染专用培养基Opti-MEM中混匀。弃去24孔板中旧DMEM培养基，每孔加入400ul新鲜的无血清DMEM培养基。然后将上述100μl混合物逐滴加入孔板中，轻轻摇匀。37℃，5％CO2培养箱中培养。转染6小时后弃上清，加入新鲜的完全DMEM培养基继续培养48小时或72小时，分别进行后续实验。

[0054] 7、qRT-PCR试验

[0055] (1)Trizol法抽提RNA

[0056] ①转染48小时后，DEPC处理过的PBS轻轻洗涤细胞3次，6孔板每孔加1ml Trizol，室温静置3分钟，反复吹打细胞，并转移至1.5mlEP管，用1ml加样枪反复吹吸至无肉眼可以沉淀，然后室温静置5分钟。

[0057] ②每个EP管加入1/5体积(0.2ml)氯仿，盖紧盖子后，用力摇晃15秒，室温静5分钟。

[0058] ③4℃，12,000×g离心15分钟。

[0059] ④小心吸取上层水相(约400ul)到另一新的1.5mlEP管中，内含有细胞总RNA。

[0060] ⑤加入等体积异丙醇(约400ul)，上下颠倒8次，室温静置10分钟。

[0061] ⑥4℃，12,000×g离心10分钟。

[0062] ⑦去上清，每个EP管加入1ml冰上预冷的75％乙醇(用DEPC水配)，清洗管壁，尽量勿触及白色絮状沉淀物(为RNA)。

[0063] ⑧4℃，12,000×g离心5分钟。

[0064] ⑨去上清，室温干燥10分钟(为控制RNA中盐含量，尽量除净乙醇)。

[0065] ⑩每管加入20-30ul DEPC水，溶解干燥后的RNA。

[0066] (2)RNA琼脂糖电泳

[0067] ①电泳槽处理：去污剂洗干净；水冲洗；乙醇干燥；灌满3％的双氧水溶液，静置10min；0.1％DEPC冲洗。

[0068] ②电泳缓冲液(5×TBE)：用时稀释至0.5×TBE工作液。

[0069] ③制备2％琼脂糖凝胶：0.80g琼脂糖+40ml 0.5×TBE缓冲液于微波炉中融化。

[0070] ④待熔化的琼脂糖冷却至60℃左右，加入3ul胶体金混匀后缓慢倒入电泳槽中，注意勿引起气泡，插上梳子，室温静置60分钟。

[0071] ⑤拔去梳子，将10ulRNA溶液与2ul 6×上样缓冲液混匀后小心加入加样孔中。

[0072] ⑥在5v/cm的电压下电泳30分钟左右，此时溴酚蓝带跑到电泳槽中央，在凝胶呈像仪以UV照射下观察条带，以确定RNA的纯度。

[0073] (3)微量核酸蛋白测定仪测定RNA的OD260和OD280值

[0074] 微量核酸测定仪测定提取RNA的OD值，以评估其纯度和计算其浓度，其中OD230值代表盐含量，OD260代表核酸含量，OD280值代表蛋白质含量，OD320值代表溶剂的吸光度。OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间，表明RNA无明显蛋白质污染。RNA原液浓度＝(OD260-OD320)×稀释倍数×40(ng/μl)。

[0075] (4)cDNA的合成

[0076] ①在PCR管中加入以下反应混合物(冰上操作)

[0077]

[0078]

[0079] ②轻轻混匀，微型离心机离心3-5秒。

[0080] ③反转录反应条件如下

[0081] 37℃  15min

[0082] 85℃  5sec

[0083] ④合成的cDNA放-20℃保存备用。

[0084] (5)Real Time PCR反应

[0085] ①在96孔PCR板中每孔加入以下PCR反应液(冰上操作)

[0086]

[0087] ②4℃，3,000×g离心3分钟。

[0088] ③按下列反应条件进行Real Time PCR反应

[0089]

[0090] 8、Western blot试验

[0091] (1)细胞总蛋白提取

[0092] 转染72小时后提取细胞总蛋白，过程如下：

[0093] ①弃去旧培养基，用PBS轻轻洗细胞一遍。

[0094] ②每孔加入100μl RIPA和1μl PMSF(终浓度为1mM)。

[0095] ③细胞刮刮数下，使裂解液与细胞充分接触，冰上裂解30分钟。

[0096] ④4℃，12,000×g离心30分钟。

[0097] ⑤小心吸取上清，内含有细胞总蛋白。

[0098] (2)蛋白浓度测定

[0099] BCA-100蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度(96孔板法)，具体过程如下：

[0100] 按A：B＝50：1制备A+B混合液，即每个反应使用200μl Solution A+4μl Solution B，混匀后使用，即配即用。每个样品要做3个平行孔。

[0101] ①BSA标准品和样品的准备：样品用PBS配制，稀释5倍(5μl蛋白原液+20μlPBS)，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备3个平行测定。标准曲线一般取5-6个点即可，根据样品的浓度确定各点的具体浓度。BSA也用PBS稀释。按下表的次序加入BSA标准品或样品及Solution A+B混合液，混匀。

[0102]

[0103] ③盖上盖子混合30秒，37℃孵育30分钟。

[0104] ④冷却至室温。

[0105] ⑤酶标仪上测定490nm的吸光度值(OD值)。

[0106] ⑥用Excel软件分析并绘制标准曲线，R2＞0.99曲线可用。根据未知样品的吸光度值，用公式：y＝0.2729x+0.0793(y＝吸光度，x＝蛋白浓度，R2＝0.9994) 可以得出未知样品的浓度，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。

[0107] (3)制胶。依次制备12％分离胶和5％浓缩胶。

[0108] (4)蛋白标本的制备：每孔上样标本量相同(25μg)，在0.2mlEP管中分别加入：样品蛋白(25μg)+4μl 5×loading buffer+RIPA(含1％PMSF),总体积20μl。

[0109] (5)蛋白变性。蛋白样品与5×蛋白上样缓冲液混匀，置于100℃水浴8分钟，瞬时离心，冷却至室温，直接上样或-80℃保存备用。

[0110] (6)上样。每孔20μl，空白孔加15μl RIPA+5μl 5×蛋白上样缓冲液，在边缘孔上预染蛋白marker。

[0111] (7)电泳。浓缩胶60V恒压电泳，当溴酚蓝至分离胶时，改用120V恒压电泳，至溴酚蓝至分离胶底部，停止电泳。

[0112] (8)转膜。PVDF膜剪去右上角以标记方向，然后将标记好的PVDF膜置于甲醇中活化10min后放入转移缓冲液中备用。从玻璃板中取下凝胶，按照一定的顺序将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜置放于电转夹上，放入电转槽中，150mA恒流电转60min。

[0113] (9)封闭。转膜后，取出PVDF膜，TBST洗5min×3次，置于封闭缓冲液中室温封闭2h。

[0114] (10)孵育一抗。用抗体稀释液稀释一抗(Tubulin mAb 1:1000，Bmi-1mAb 1：2000)。根据预染蛋白marker大小切PVDF膜，分别孵育一抗，4℃摇床过夜。TBST洗膜5min×3次。

[0115] (11)孵育二抗。用抗体稀释液稀释二抗(1：1000)，室温孵育二抗2小时。TBST洗膜5min×3次。

[0116] (12)曝光。把PVDF膜置于曝光盒内，均匀涂上化学发光液，盖上胶片，暗室 内曝光0.5-5min。把胶片置于显影液中显影，定影液中定影。观察条带。用Image J软件分析图像。

[0117] 9、细胞增殖试验

[0118] (1)Panc-1细胞接种在96孔板，1×104/孔，无抗生素完全培养基中贴壁生长24小时。

[0119] (2)去除旧培养基，分别加入IP/SCR和IP/siBmi-1(N/P＝20)复合物及新鲜培养基共100μl进行转染，各复合物所含siRNAs量设定为100nM。

[0120] (3)37℃，5％CO2培养箱中培养6小时后更换为新鲜无抗生素完全培养基，每孔100ul，继续培养7天。每24小时随机取出一块板，用MTS法测定细胞吸光度。

[0121] 10、细胞周期分析

[0122] (1)Panc-1细胞经IP/SCR或IP/siBmi-1转染后继续培养48小时，弃上清，预冷PBS洗两次，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞到离心管内，900rpm离心3分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，900rpm离心3分钟，沉淀细胞，小心吸除上清，残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

[0123] (2)细胞固定：加入1毫升冰浴预冷70％乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定过夜。900rpm离心3分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，共洗涤两次。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

[0124] (3)碘化丙啶染色液的配制：根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色 液，即配即用：

[0125]

[0126] (4)染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后立即上流式细胞仪进行检测。

[0127] (5)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用Cellquest和ModFit软件进行设门、光散射分析和细胞DNA含量分析。

[0128] 11、克隆形成试验

[0129] (1)Panc-1细胞接种在24孔板，5×104/孔，无抗生素完全培养基中贴壁生长24小时。

[0130] (2)去除旧培养基，分别加入IP/SCR和IP/siBmi-1(N/P＝20)复合物及新鲜培养基共500μl进行转染，各复合物所含siRNAs量设定为100nM。

[0131] (3)37℃，5％CO2培养箱中培养6小时后更换为新鲜无抗生素完全培养基，每孔500ul，继续培养48小时。

[0132] (4)弃去旧培养基，PBS洗细胞三次，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，制备单个细胞悬液，把细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM完全培养基中备用。

[0133] (5)平板克隆形成试验：

[0134] (a)取2000个细胞接种于6孔板中，每孔加完全培养基2ml，并轻轻转动，使 细胞分散均匀。置37℃，5％CO2培养箱中静置培养14天，出现较多肉眼可见的克隆。重复接种三孔。

[0135] (b)弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加入纯甲醇2mL，固定15分钟。然后去固定液，加适量Wright-Giemsa应用染色液染色10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥，直接肉眼观察。

[0136] (6)软琼脂克隆形成试验：

[0137] (a)将1.2％低熔点琼脂糖与2×DMEM完全培养基(含有2×抗生素和20％FBS)以1:1的体积比混合制备0.6％的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固。

[0138] (b)将1.2％低熔点琼脂糖与2×DMEM完全培养基(含有2×抗生素和20％FBS)以1:1的体积比在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液(共5000个细胞)，充分混匀，注入铺有0.6％的底层琼脂培养板中，逐形成双琼脂层。室温静置约1小时，待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温箱中培养14天。每三天补充含10％FBS的完全DMEM培养基1ml。

[0139] (c)低倍显微镜下计数含50个细胞以上的克隆，计算细胞集落形成率，SpotII采集图像。

[0140] 12、迁移和侵袭试验

[0141] (1)侵袭试验前，在Transwell小室的上室铺250μg/ml Matrigel胶，置于37℃4小时，待胶凝固后备用。迁移试验无需铺胶。迁移和侵袭试验以下步骤相同。

[0142] (2)Panc-1细胞经IP/SCR或IP/siBmi-1转染48小时后，从24孔板消化下来，并用无血清高糖DMEM培养基重悬，按1×104/孔接种在Transwell小室的上室，并加入0.1％BAS平衡渗透压。在下室加入500μl含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基诱导其迁移、穿过8μm孔径的聚碳酸酯膜。

[0143] (3)37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养20小时(迁移试验)或40小时(侵袭试验)。

[0144] (4)取出小室，用棉签轻轻擦去上室面细胞，室温充分干燥。

[0145] (5)纯甲醇室温下固定下室面细胞15min。

[0146] (6)PBS洗2次，棉签擦干上室面，室温下风干5min。

[0147] (7)Wright-Giemsa应用染色液染色30分钟，用双蒸水洗3次，室温充分风干。

[0148] (8)置于显微镜下观察，每小室各取6个100×视野，计数穿膜细胞数，求得单个视野的平均穿膜细胞数。

[0149] 13、体内胰腺癌靶向性研究

[0150] (1)裸鼠皮下移植瘤形成

[0151] 选取体重为14g±1g的雌性BALB/C(nu/nu)裸鼠，将1×107处于对数生长期的Panc-1细胞用300μlPBS制成细胞悬液，皮下注射于裸鼠背部肩胛区，成瘤率＞90％。

[0152] (2)活体荧光成像

[0153] scFv-IP与近红外染料Cy5.5标记的20μg siRNAs按N/P＝20混合，形成scFv-IP/Cy5.5-siRNAs复合物，用PBS稀释后经裸鼠尾静脉注射。注射前行荧光成像扫描。注射后于12h，24h，48h再次行荧光成像扫描。观察Panc-1皮下移植瘤的荧光信号改变。

[0154] (3)离体荧光成像

[0155] 注射24h后，靶向组肿瘤部位仍然呈现强荧光，而非靶向组肿瘤区域荧光信号明显减弱，至48小时靶向组肿瘤区域仍有较强荧光，而非靶向组荧光强度减弱非常明显。将裸鼠过度麻醉处死，剥离肿瘤以及心、肝、脾、肾等重要组织器 官，再次进行荧光成像。

[0156] 14、统计方法

[0157] 两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析。应用SPSS 17.0for windows统计软件进行统计学处理。显著性差异水平为p＜0.05。

[0158] 二、结论分析

[0159] 1、scFv-IP/siRNAs纳米微粒的细胞内吞及在细胞内的分布

[0160] scFv-IP/Cy3-siRNAs转染Panc-1细胞后如图1所示，siRNAs分布在细胞质内，且靶向组转染后的荧光强度明显地高于非靶向组。FITC标记的小鼠抗6×Histag单克隆抗体荧光显微镜下显示绿色荧光，其可以特异性地与scFvCD44v6结合，因此只有内吞scFv-IP/siRNAs的细胞才显示出绿色荧光。如图2所示：所有有Cy3-siRNAs红色荧光出现的细胞均有绿色荧光出现，表明scFvCD44v6成功连接到IP上并被细胞内吞，将siRNAs带入到细胞质中。

[0161] 2、转染率分析

[0162] 成功转染的细胞在流式细胞仪检测时为绿色荧光，绿色荧光细胞的比列简介表示转染细胞的转染率。如图3所示：IP/FAM-siRNAs组的转染率为(59.87％±5.53％)；scFv-IP/FAM-siRNAs组的转染率为(89.75％±2.21％)。结果表明，在siRNAs转染浓度相同时，靶向组的转染率高于非靶向组，说明scFvCD44v6可以促使更多的siRNAs转运至细胞内。

[0163] 3、siBmi-1沉默Bmi-1基因表达的验证

[0164] IP/siBmi-1和scFv-IP/siBmi-1处理Panc-1细胞后，Bmi-1基因在mRNA和蛋白的表达量分别降至对照的(60.00％±7.07％)vs(37.00％±2.83％)(p＜0.05)，(40.80％±4.92％)vs(36.85％±7.93％)(p＜0.05)。提示scFv-IP靶向组有更好的 基因沉默功能。

[0165] 4、细胞增殖实验

[0166] 为了验证靶向组基因沉默后与非靶向组在影响Panc-1细胞的生物学功能方面对比进行了后续实验。如图4所示，处理后，在细胞生长的7天时间里，靶向组的细胞数一直低于非靶向组，在实验终点时，两组的细胞数分别为(0.98±0.04)×104(靶向组)vs(1.23±4
0.06)×10(非靶向组)(p＜0.05)。

[0167] 5、细胞周期分析

[0168] 靶向组和非靶向组处理细胞后，处于G0/G1期的细胞数分别为(69.27％±2.46％)vs(57.25％±1.33％)(p＜0.05)，S期的细胞数分别为(12.47％±2.46％)vs(26.39％±1.34％)(p＜0.05)。结果表明，靶向组将更多的细胞阻滞在G0/G1期。

[0169] 6、克隆形成试验

[0170] 如图5所示，靶向组处理细胞后，形成的细胞集落更少、更小，克隆形成能力更弱。

[0171] 7、迁移和侵袭试验

[0172] 如图6所示，当靶向组和非靶向组分别沉默Bmi-1基因后Panc-1细胞迁移和侵袭均较对照组明显减少，且靶向组少于非靶向组分别为：(89±8.02)vs(158±7.78)(p＜0.05)和(89.3±8.02)vs(137±9.61)(p＜0.05)。

[0173] 8、体内胰腺癌靶向性

[0174] 建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察scFv-IP在裸鼠体内对胰腺癌的靶向结合。尾静脉注射scFv-IP/Cy5.5-siRNAs复合物，Cy5.5-siRNAs用量为20μg/动物。NIRF成像可观察到Cy5.5-siRNAs NPs在肿瘤组织的聚集。如图7所示：在注射后12 小时，靶向组和非靶向组均表现出较多荧光物质聚集在肿瘤组织，达到最强。在24小时和48小时继续观察，靶向组肿瘤部位和非靶向组肿瘤部位荧光都逐渐减弱。但靶向组肿瘤部位荧光强度始终高于非靶向组。48小时后将动物安乐死，剥离出肿瘤组织和心、肝、脾、肾等重要器官再次进行荧光呈像，如图8所示，靶向组的肿瘤组织显出较高的荧光强度，提示scFv-IP/Cy5.5-siRNAs NPs主要被肿瘤组织摄取，非靶向组肿瘤组织的荧光强度明显低于靶向组，提示被肿瘤组织所摄取的Cy5.5-siRNAs量少于靶向组。

[0175] 实施例2

[0176] 本实施例的靶向载体包括CD44v6单链抗体、以及纳米载体IONP-PEI，其共载了吉西他滨和siBmi-1。本实施例的内容包括实验方法和结论分析两部分。

[0177] 一、实验方法

[0178] 1、细胞培养

[0179] 人胰腺癌细胞株Panc-1在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，恒温37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0180] 2、Gem-IONP(搭载吉西他滨的载体IONP)以及svFv-Gem-IONP(搭载吉西他滨和siBmi-1的靶向载体)的制备及表征

[0181] (1)在冰浴中，将三乙胺(Triethylamine)和酸敏四肽(9–fluorenylm ethoxycarbonyl(Fmoc)-Gly-Phe-Leu-Gly(GFLG)-nitrophenyl ester peptide)按照7.5umol：6.8μmol加入到1.0mol的乙腈溶液中。

[0182] (2)将吉西他滨和三乙胺(Triethylamine)按照13.6umol：13.6umol溶于1ml去离子水中。

[0183] (3)将上述(2)的溶液加入到(1)中，旋转混匀5min后，将混合液置于冰盐浴中反应100min。

[0184] (4)梯度压力法去除混合液中的乙腈和水，加水定容至1ml。用6M盐酸滴定至PH 2.0,将得到的混合物4℃保存。

[0185] (5)用1M盐酸反复洗涤得到的溶液，并用梯度压力法去除最后的溶液。最后得到的固体在真空干燥器中彻底抽干得到固体粉末(Fmoc)-GFLG-Gem。

[0186] (6)用0.4ml的二甲基亚酰胺(N,N-dimethylmethanamide)将得到的固体溶解，向溶液中加入100ul哌啶(piperidine)，室温震荡5min混匀，将反应液置于冰盐浴，立即加入乙酸。用二氯甲烷(dichloromethane)萃取反应液后，真空干燥器冻干的到GFLG-Gem复合物。

[0187] (7)向1mg的IONPs溶液中加入108.6μg的二亚胺(EDAC)和196.9μg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，室温反应15min。将得到的酰胺化的IONPs和420.4ug GFLG-Gem复合物4℃酰胺化反应得到Gem-IONP复合物。

[0188] (8)将1.33mg PEI加入到IONP-Gem溶液中室温反应30min得到Gem-IONP-PEI。

[0189] (9)将47.1ug马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mal-PEG-NHS)加入到上述溶液中室温反应30min。将750ug scFvCD44v6加入到上述溶液，4℃过夜得到scFv-Gem-IONP(即scFv-Gem-IONP-PEI，可以复合siBmi-1)。最后得到的(GFLG)-Gem-IONP和scFv-(GFLG)-Gem-IONP复合物用磁力分离器纯化，过滤器过滤除菌。

[0190] (10)将Gem-IONP及svFv-Gem-IONP用透射电镜观察其表面特征及粒径大小。

[0191] 3、吉西他滨药物释放试验

[0192] (1)将10ul scFv-Gem-IONP溶于90ul PBS缓冲液中(cathepsin B的终浓度是 1uM)，每个时间点制备两管，将PH值分别调至5.5和7.4。

[0193] (2)37℃温箱孵育，在0，6，12，24，36，48，72，96小时，每个PH值分别取出一管，超滤管过滤去除IONP，收集过滤液，高效液相分析法(乙腈：水(20:80,v/v)，含有0.01％三氟乙酸，流速0.3mL/min,波长270nm)，上机检测溶液中吉西他滨浓度。

[0194] (3)计算每个时间点释放的吉西他滨药物量，作图。

[0195] 4、细胞毒性试验

[0196] 为评估siBmi-1联合吉西他滨免疫纳米复合物对Panc-1的细胞毒性，进行MTS实验。每组设3个复孔，该实验独立重复3次，所得数值表示为均数±标准误。

[0197] (1)Panc-1细胞接种在96孔板，1×104/孔，无抗生素完全培养基中贴壁生长24小时。加入不同处理，实验分组为：Gem，Gem-IONP，svFv-Gem-IONP，和scFv-Gem-IONP/siBmi-1，siRNAs量为每孔10pmol。Gem浓度为1-20uM，PEI-IONP依据不同浓度Gem而定。未处理细胞作为空白对照。37℃，5％CO2培养箱中培养72小时。

[0198] (2)去除培养基，每孔加入100μl含有20ul MTS溶液的无血清培养基，37℃，5％CO2培养箱中继续培养4小时。

[0199] (3)以空白组调零，酶标仪检测490nm吸光度值。

[0200] 细胞存活率(％)＝(A实验组/A对照组)×100％。

[0201] 5、细胞凋亡试验

[0202] (1)Panc-1细胞接种在6孔板，2×105/孔，无抗生素完全培养基中贴壁生长24小时。加入不同处理，①Control②Gem③Gem-IONP④scFv-Gem-IONP⑤ scFv-Gem-IONP/siBmi-1。siRNAs量为每孔10pmol，Gem浓度为5uM，37℃，5％CO2培养箱中培养72小时。

[0203] (2)具体转染方法如下：

[0204] A、siRNAs浓度为100nmol/L。按N/P比值＝20制备IP/FAM-siRNAs复合物，混匀后室温静置20分钟，然后加入100μl转染专用培养基Opti-MEM中混匀。

[0205] B、弃去24孔板中旧DMEM培养基，每孔加入400ul新鲜的无血清DMEM培养基。然后将上述100μl混合物逐滴加入孔板中，轻轻摇匀。37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0206] (3)检测细胞凋亡：FITC-ANNEXIN V/PI染色流式细胞仪检测法

[0207] 原理：在细胞发生凋亡的早期，位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸(PS)会外翻到细胞膜外侧。FITC标记的Annexin V选择性与PS结合，呈绿色荧光。坏死细胞或凋亡晚期细胞，细胞膜完整性丧失，Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)均可使其染色。因此，用Annexin V-FITC和PI染色后，正常的活细胞不被染色；凋亡早期的细胞FITC阳性、PI阴性；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC和PI染色。

[0208] 染色方法：

[0209] ①弃旧培养基，用PBS轻洗两次，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞到离心管内，900rpm离心3分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，避免吸走细胞。加入约1毫升PBS，重悬细胞，
900rpm离心3分钟，沉淀细胞，小心吸除上清。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

[0210] ②每管加入500μl Binding Buffer，轻轻吹打制备单细胞悬液。

[0211] ③每管加入FITC/ANNEXIN V 5ul，混匀后室温避光孵育15分钟，然后每管加 入PI染液5ul，室温孵育5分钟后立即上流式细胞仪检测。

[0212] 6、Western blot试验

[0213] 凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax的检测用Western blot法，具体如下：

[0214] (1)细胞总蛋白提取

[0215] 转染72小时后提取细胞总蛋白，过程如下：

[0216] A、弃去旧培养基，用PBS轻轻洗细胞一遍。

[0217] B、每孔加入100μl RIPA和1μl PMSF(终浓度为1mM)。

[0218] C、细胞刮刮数下，使裂解液与细胞充分接触，冰上裂解30分钟。

[0219] D、4℃，12,000×g离心30分钟。

[0220] E、小心吸取上清，内含有细胞总蛋白。

[0221] (2)蛋白浓度测定

[0222] BCA-100蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度(96孔板法)，具体过程如下：

[0223] A、按A：B＝50：1制备A+B混合液，即每个反应使用200μl Solution A+4μl Solution B，混匀后使用，即配即用。每个样品要做3个平行孔。

[0224] B、BSA标准品和样品的准备：样品用PBS配制，稀释5倍(5μl蛋白原液+20μlPBS)，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备3个平行测定。标准曲线一般取5-6个点即可，根据样品的浓度确定各点的具体浓度。BSA也用PBS稀释。按下表的次序加入BSA标准品或样品及Solution A+B混合液，混匀。

[0225]

[0226]

[0227] C、盖上盖子混合30秒，37℃孵育30分钟。

[0228] D、冷却至室温。

[0229] E、酶标仪上测定490nm的吸光度值(OD值)。

[0230] F、用Excel软件分析并绘制标准曲线，R2＞0.99曲线可用。根据未知样品的吸[0231] 光度值，用公式：y＝0.2729x+0.0793(y＝吸光度，x＝蛋白浓度，R2＝0.9994)可以得出未知样品的浓度，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。

[0232] (3)制胶。依次制备12％分离胶和5％浓缩胶。

[0233] (4)蛋白标本的制备：每孔上样标本量相同(25μg)，在0.2mlEP管中分别加入：样品蛋白(25μg)+4μl 5×loading buffer+RIPA(含1％PMSF),总体积20μl。

[0234] (5)蛋白变性。蛋白样品与5×蛋白上样缓冲液混匀，置于100℃水浴8分钟，瞬时离心，冷却至室温，直接上样或-80℃保存备用。

[0235] (6)上样。每孔20μl，空白孔加15μl RIPA+5μl 5×蛋白上样缓冲液，在边缘孔上预染蛋白marker。

[0236] (7)电泳。浓缩胶60V恒压电泳，当溴酚蓝至分离胶时，改用120V恒压电泳，至溴酚蓝至分离胶底部，停止电泳。

[0237] (8)转膜。PVDF膜剪去右上角以标记方向，然后将标记好的PVDF膜置于甲醇中活化10min后放入转移缓冲液中备用。从玻璃板中取下凝胶，按照一定的顺序将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜置放于电转夹上，放入电转槽中，150mA恒流电转60min。

[0238] (9)封闭。转膜后，取出PVDF膜，TBST洗5min×3次，置于封闭缓冲液中室 温封闭2h。

[0239] (10)孵育一抗。用抗体稀释液稀释一抗(Tubulin mAb 1:1000，Bmi-1mAb 1：2000)。根据预染蛋白marker大小切PVDF膜，分别孵育一抗，4℃摇床过夜。TBST洗膜5min×3次。

[0240] (11)孵育二抗。用抗体稀释液稀释二抗(1：1000)，室温孵育二抗2小时。TBST洗膜5min×3次。

[0241] (12)曝光。把PVDF膜置于曝光盒内，均匀涂上化学发光液，盖上胶片，暗室内曝光0.5-5min。把胶片置于显影液中显影，定影液中定影。观察条带。用Image J软件分析图像。

[0242] 7、体内抑制胰腺癌研究

[0243] 当肿瘤体积达～100mm3,荷瘤小鼠随机分为8组(n＝6)，分别接受不同药物的单剂量处理：(i)PBS(control)，(ii)IP/SCR，(iii)IP/siBmi-1，(iv)scFv-IP/siBmi-1，(v)Gem，(vi)Gem-IONP，(vii)scFv-Gem-IONP，(viii)scFv-Gem-IONP/siBmi-1(20μg/动物)。每三天观察动物一般情况和肿瘤生长情况。用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积＝(L×W2)/2,其中L是肿瘤最长径，W与L垂直。实验终点设置为21天，到达实验终点时将动物安乐死。取出肿瘤组织进行组织病理学分析。剥离的肿瘤马上以4％多聚甲醛固定，石蜡包埋、制备6μm切片，分别进行H&E染色、免疫组化染色分析。

[0244] 二、结论分析

[0245] 1、Gem-IONP和scFv-Gem-IONP纳米微粒的制备及测定

[0246] 吉西他滨通过化学反应与酸敏四肽形成GFLG-Gem，在加入EDAC和sulfo-NHS反应条件下，通过酰胺化反应及正负电荷之间吸引作用，将scFv、Gem 和IONP偶联复合形成scFv-Gem-IONP，并最终形成既可以偶联吉西他滨，又可以负载siRNAs的复合物scFv-Gem-IONP-PEI。如图9所示，通过透射电镜进一步验证聚合物的形成和形貌。形成的复合物为规则的球形，分布均匀，以3-5个IONP小粒子为中心，周围环绕单链抗体、吉西他滨、PEI和siRNA。这些微粒的直径分布在60nm左右，粒径小，利于细胞的内吞。粒子表面所带的电荷引起染色剂过度吸附，从而造成粒子颜色较深。

[0247] 2、吉西他滨药物释放试验

[0248] 将10ul scFv-Gem-IONP溶于含有1uM(终浓度)组织蛋白酶B(cathepsin B)的90ul PBS缓冲液，IONP和Gem之间的链接是通过酸敏四肽(9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-Gly-Phe-Leu-Gly(GFLG)-nitrophenyl ester peptide)之间的化学反应偶联在一起，组织蛋白酶B可特异性地水解这种多肽，从而将链接的化学键断开，将吉西他滨释放出来。组织蛋白酶B在细胞内主要存在于溶酶体中，这种环境模拟了细胞内环境。纳米微粒进入胞内，被溶酶体中的组织蛋白酶水解，释放吉西他滨，发挥抑瘤作用。如图10所示：在PH5.5时候，吉西他滨释放速度及量均较PH7.4高。肿瘤细胞代谢旺盛，使得肿瘤组织区域呈弱酸性，根据实验结果可知，纳米药物在肿瘤组织会更快更大量释放，在正常组织释放较少，从而既可以减少对正常细胞的杀伤作用，又可以提高抑瘤效果。

[0249] 3、细胞毒性试验

[0250] 如11图所示：在不同吉西他滨浓度时，Gem，Gem-IONP，scFv-Gem-IONP，scFv-Gem-IONP/siBmi-1各组细胞毒性逐渐增强：靶向的Gem联合siBmi-1纳米用药组高于单用靶向Gem纳米，靶向组的细胞毒性作用又强于非靶向组，这三组的细胞毒性作用均高于单用吉西他滨药物组。在吉西他滨浓度为1μM，Gem、 Gem-IONP、scFv-Gem-IONP、scFv-Gem-IONP/siBmi-1细胞活力分别为(98.33％±0.80％)、(94.73％±1.46％)、(89.79％±1.94％)、(89.36％±2.81％)(p＜0.05)；5μM时分别为(79.80％±1.71％)、(72.91％±1.82％)、(62.13％±2.87％)、(56.33％±5.13％)(p＜0.05)；浓度为20μM时细胞活力分别(60.67％±4.04％)、(51.67％±3.51％)、(44.00％±2.65％)、(39.00％±1.73％)(p＜0.05)。实验结果表明，吉西他滨纳米微粒和siBmi-1有协同抑瘤作用。

[0251] 4、细胞凋亡试验

[0252] 各组细胞凋亡比例：Control 0％，Gem 8.46％，Gem-IONP 9.54％，scFv-Gem-IONP 13.59％，scFv-Gem-IONP/siBmi-117.53％。流式检测提示吉西他滨纳米微粒较吉西他滨药物组有更强的细胞毒性，siBmi-1和吉西他滨有协同作用，该实验结果与细胞毒性实验结果一致。

[0253] 5、凋亡相关蛋白表达情况

[0254] 凋亡相关蛋白Bcl2在Gem，Gem-IONP，scFv-Gem-IONP，scFv-Gem-IONP/siBmi-1四组中表达量逐渐降低，相对表达量分别是100，(58.56±1.99)，(52.93±1.99)，(10.77±1.97)。而Bax则出现递增趋势，相对表达量是100，(188.65±11.50)，(216.74±2.96)，(668.42±16.92)。结果表明这四组处理细胞后促进细胞调亡的能力是逐渐增强的。scFv-Gem-IONP/siBmi-1组较scFv-Gem-IONP有更强的促凋亡能力，则进一步可以说明吉西他滨和siBmi-1之间存在协同抑瘤作用。

[0255] 6、体内抑瘤实验及组织切片免疫组化结果

[0256] 在以上实验中，我们已证实沉默Bmi-1基因可在细胞学实验层面抑制胰腺癌细胞的生长，并且活体荧光成像实验显示靶向纳米载体可将siRNA靶向地导入到肿瘤细胞内。并且在体外实验验证各药物组Gem、Gem-IONP、scFv-Gem-IONP、 scFv-Gem-IONP/siBmi-1对胰腺癌细胞的毒性作用的影响。在此基础上将裸鼠分组(i)PBS(control)，(ii)IP/SCR，(iii)IP/siBmi-1，(iv)scFv-IP/siBmi-1，(v)Gem，(vi)Gem-IONP，(vii)scFv-Gem-IONP，(viii)scFv-Gem-IONP/siBmi-1(20μg/动物)。将药物经尾静脉注射入裸鼠体内，观察抑制胰腺癌细胞生长。所有处理组肿瘤均较对照组(PBS)组肿瘤小，非靶向基因治疗组IP/siBmi-1与SCR组相比，肿瘤体积及重量降低不明显，不具有统计学意义。但是靶向基因组scFv-IP/siBmi-1较SCR对照组及非靶向组均有明显降低，体积更小，重量更轻。在吉西他滨药物组中，靶向药物组scFv-Gem-IONP也较非靶向药物组Gem-IONP及单纯Gem组更小、更轻；并且共载Gem及siBmi-1组在所有分组中体重最轻，体积最小。对PBS(control)、IP/SCR、IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1组肿瘤组织切片进行免疫组化染色观察Bmi-1基因在各组的表达。结果如图12所示：PBS组和SCR组Bmi-1的表达量较高，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1表达量明显降低，靶向组降低更多；提示靶向组和非靶向组均可以将siBmi-1带入肿瘤细胞内，并且靶向组达到了更好的干扰效果。对PBS(control)、Gem、Gem-IONP、scFv-Gem-IONP、scFv-Gem-IONP/siBmi-1进行Bmi-1、Bcl-2、Bax染色。结果如图13所示：与其他各组相比，scFv-Gem-IONP/siBmi-1组Bmi-1表达量降低。Bcl-2的表达量呈逐渐降低趋势，Gem联合siBmi-1组的表达量最低；Bax的表达则呈现出相反的趋势，逐渐升高，在scFv-Gem-IONP/siBmi-1组表达量最高。与Western blot结果一致。以上结果提示，scFvCD44v6修饰的载体可获得高度的肿瘤特异性，增加肿瘤局部的siRNAs浓度，增强siBmi-1的抗肿瘤效应；吉西他滨和siBmi-1联合应用有更强的协同抗肿瘤效应。