一株克雷伯氏菌及用它制备微生物絮凝剂的方法

摘要

本发明公开了一株克雷伯氏菌及用它制备微生物絮凝剂的方法。该菌株为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)LDX1‑1，已于2015年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11330。该菌株可以经激活发酵法制备微生物絮凝剂。该菌株具有菌株生长速度快、代谢能力强、发酵周期短、产量高、絮凝率高等优点。将本发明制备的微生物絮凝剂应用于生活污水处理，SS絮凝率≥90％，COD去除率≥85％、重金属Mn2+去除率≥85％等，具有广阔的开发前景和很好的应用价值。

权利要求

1.克雷伯氏菌（Klebsiella  sp.）菌株LDX1-1，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.11330。

2.权利要求1所述的克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）菌株LDX1-1在制备微生物絮凝剂方面的应用。

3.一种以权利要求1所述的克雷伯氏菌菌株LDX1-1制备微生物絮凝剂的方法，其特征是，所述方法包括如下步骤：（1）液体菌种培养

将活化培养的斜面菌种接种于液体菌种培养基中，在24-30℃、150-180r/min条件下震荡培养10-18h，得液体菌种备用；

液体菌种培养基的组分及用量为：蔗糖 10-15 g/L，NH4NO3 1.5-2.5 g/L，K2HPO4 0.8-

1.3 g/L，MgSO4 0.3-0.8 g/L，NaCl 0.3-0.8 g/L，FeSO4 0.01-0.04 g/L；

（2）发酵培养

将液体菌种按体积比2-4%的接种量接种于发酵培养基，在发酵罐中进行发酵培养24-

32h，发酵结束得发酵液，将发酵液过滤去除杂质，得液体微生物絮凝剂；

发酵培养基的组分及用量为：蔗糖 15-30 g/L，NH4NO3 1.5-4.5 g/L，K2HPO4 0.8-2.0 g/L，MgSO4 0.2-0.7 g/L，NaCl 0.2-0.8 g/L，FeSO4 0.01-0.04 g/L，MnSO4 0.01-0.05 g/L，松针提取物 0.1-0.4 g/L，玉米淀粉 6-12 g/L，玉米浆 1-3 g/L，ZnSO4 0.018-0.040 g/L。

4.如权利要求3所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征是，所述步骤（2）的发酵控制条件为：温度24-30℃、通气比为0.25-0.8VVM、搅拌转速为200-600r/min。

5.如权利要求3或4所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征是，所述液体菌种培养基的组分及用量为：蔗糖 12 g/L，NH4NO3 2 g/L，K2HPO4 0.8 g/L，MgSO4 0.5 g/L，NaCl 0.4 g/L，FeSO4 0.013 g/L。

6.如权利要求3或4所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征是，所述发酵培养基的组分及用量为：蔗糖 23 g/L，NH4NO3 2 g/L，K2HPO4 1.2 g/L，MgSO4 0.5 g/L，NaCl 0.4 g/L，FeSO4 0.015 g/L，MnSO4 0.02 g/L，松针提取物 0.2 g/L，玉米淀粉 7 g/L，玉米浆 1.8 g/L，ZnSO4 0.03 g/L。

说明书

一株克雷伯氏菌及用它制备微生物絮凝剂的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一株克雷伯氏菌及用它制备微生物絮凝剂的方法，属于生物技术与生物工程领域。

背景技术

[0002] 随着工业迅速发展、人口急增等世界性问题的出现，造成了水质污染加剧，水资源紧张。我国近几年来每年有600亿立方米工业污水和200亿立方米生活污水排放，长江、黄河等七大水系遭到严重污染，生态湖水、近海地域水质也遭到不同程度的破坏，人民健康和经济发展受到严重威胁，水资源保护形势严峻。我国是世界上最缺水的国家之一，人均淡水资源仅为世界人均水平的四分之一。由于人口众多和社会发展，产生的大量工业和生活污水使有限的水资源遭到严重污染。不少缺水的现象，让人触目惊心，水资源危机的警钟已经敲响。《中华人民共和国水法》从立法的角度确立了保护水资源、节约用水、高效用水等法律。水已经成为了最紧缺的资源。

[0003] 几十年来，化学絮凝剂在对保障人类社会、经济和生存环境的水资源的可持续性利用中，在对地表水净化、污水处理方面发挥了巨大作用。但科学研究越来越多地发现：化学絮凝剂具化学毒性和难以降解性质，其在使用后形成的残留和积累、迁移转化对人类健康、生物多样性干扰和生态系统平衡方面产生严重危害。

[0004] 微生物絮凝剂是由微生物产生的天然生物大分子，具有生产条件温和、本质无毒无害、使用高效、环境中生物可降解等特点，是环境友好性产品。微生物絮凝剂是新型生物水处理剂，属当代新型发酵产品。对微生物絮凝剂的研究已成为世界学术研究的热点，科学导向已使微生物絮凝剂形成了强烈的市场需求。2013年国务院《生物产业发展十二五规划》中把新型发酵产品的产业化与推广应用；把大力发展高性能生物环保生物制剂列为重点发展领域。但纵观近30年来微生物絮凝剂的研究现状，仍存在着菌种性能不好、生产基质不经济、发酵工艺不够合理及产品活性低等实际情况，造成产量低、生产成本高、产品价格高，影响了专业化的可操作性和市场的可接受性。

[0005] 十几年来，本发明专利申请的发明人栾兴社致力于微生物絮凝剂的研发，先后取得了两项专利：ZL200310105515.X和ZL201210010801.7。ZL200310105515.X(申请人：栾兴社；发明名称：由节杆菌制备生物絮凝剂的方法)中，申请人由土壤采样筛选了产生微生物絮凝剂的节杆菌。筛选该菌的选择性培养基代谢针对性强，利用该菌种发酵生产微生物絮凝剂的培养基成本低廉。但利用该筛选菌株发酵产生微生物絮凝剂的产率较低(≤42％)和产量也较低(≤0.9％)。ZL201210010801.7(申请人：栾兴社；发明名称：一种高浓度发酵制备生物絮凝剂的方法)中，申请人用分离的微球菌DS16通过菌量优势发酵方法进行发酵达到了产量较高的水平(≥2.0％)。但是该方法在设备方面增加了投资，发酵工艺及操作步骤也略显繁琐。所以，对微生物絮凝剂这一绿色的环保生物制剂来说，在现有技术基础上进一步改善，保持高效、工艺愈加科学合理、提高产量和产率、降低生产与使用成本是产业化和推广应用前必须攻克的技术难题。

发明内容

[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一株克雷伯氏菌及用它制备微生物絮凝剂的方法。该菌株合成微生物絮凝剂的能力强、产率高，该制备方法所采用的发酵基质廉价易得、发酵工艺及条件科学合理，产品活性高，应用效果好。

[0007] 本发明所提供的菌株为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)LDX1-1，它是从山东省济南市的南郊杏树林枯叶下的潮湿土壤中分离得到的，该菌株已于2015年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.11330。该菌株可以用于制备微生物絮凝剂。

[0008] 以上述克雷伯氏菌菌株LDX1-1制备微生物絮凝剂的方法，其特征是，[0009] (1)液体菌种培养

[0010] 将活化培养的斜面菌种接种于液体菌种培养基中，在24-30℃、150-180r/min条件下震荡培养10-18h，得液体菌种备用；

[0011] 液体菌种培养基的组分及用量为(g/L)：蔗糖10-15，NH4NO31.5-2.5，K2HPO40.8-1.3，MgSO40.3-0.8，NaCl 0.3-0.8，FeSO40.01-0.04。

[0012] (2)发酵培养(激活发酵法)

[0013] 将液体菌种按2-4％(体积比)的接种量接种于发酵培养基，在发酵罐中进行发酵培养24-32h，发酵结束得发酵液，将发酵液过滤去除杂质，得液体蛋白多糖(PPS)微生物絮凝剂。发酵液经测定，生物絮凝剂产率≥60％，产量≥2.0％，絮凝率≥94％。

[0014] 发酵控制条件为：温度24-30℃、通气比为0.25-0.8VVM、搅拌转速为200-600r/min。

[0015] 发酵培养基的组分及用量为(g/L)：蔗糖15-30，NH4NO31.5-4.5，K2HPO40.8-2.0，MgSO40.2-0.7，NaCl 0.2-0.8，FeSO40.01-0.04，MnSO40.01-0.05，松针提取物0.1-0.4，玉米淀粉6-12，玉米浆1-3，ZnSO40.018-0.040。上述培养基中的激活剂成分为：MnSO4和松针提取物。

[0016] 该微生物絮凝剂的使用方法为：以液体状态直接混入地表水、生活污水、工业污水、生态湖水、养殖废水、发酵培养液等中。

[0017] 将发明的微生物絮凝剂应用于对生活污水进行处理的操作方法：是往具有搅拌功能絮凝装置的生活污水中加入适量絮凝剂，以120r/min的搅拌转速快速混合40S，然后再以60r/min的搅拌转速缓慢混合120S。静止30min，污染物沉淀分离。吸取上清液测定。对生活污水处理，生物絮凝剂PPS使用量(干重)为每吨水3-5g，SS絮凝率≥90％，COD去除率≥
2+
85％，重金属Mn 去除率≥85％。

[0018] 本发明的技术效果是：本发明筛选到了一种高活性微生物絮凝剂产生菌克雷伯氏菌LDX1-1，采用该菌株进行激活发酵法高产量生产微生物絮凝剂，具有菌株生长速度快、代谢能力强(产率≥60％)、发酵周期短(≤32h)、产量高(≥2.0％)、絮凝率高(≥94％)等优点。将本发明制备的微生物絮凝剂应用于生活污水处理，SS絮凝率≥90％，COD去除率≥85％、重金属Mn2+去除率≥85％等，具有广阔的开发前景和很好的应用价值。

具体实施方式

[0019] 实施例1菌株的筛选

[0020] (1)取样

[0021] 取济南南郊杏树林枯叶下的潮湿土壤，用无菌取样铲刮开土壤表层，取地表下3-10cm之间的土层放入无菌袋，并在无菌袋上标注取样日期、时间、地点、植被，将土壤菌样尽快放入4℃冰箱保存，当天至两天内进入菌种富集筛选程序。

[0022] (2)筛选

[0023] 将富集培养液配方中的诸成分(溶菌酶除外)配制成液体培养基，分装，每一250mL三角瓶50mL，于121℃高压蒸汽灭菌25min，冷却至25-28℃时，在无菌条件下加入对应量的溶菌酶，混匀。接入采集的菌样接入培养好的富集培养液中，摇匀，于20-27℃、120-180r/min进行摇瓶培养至2-3天，得富集培养菌液。

[0024] 配制选择培养基，用Φ9cm平皿制作选择培养基平板。把富集培养菌液进行系列稀释，选择合适的稀释度涂布选择培养基平板，20-27℃培养2-3天，挑选生长快、粘稠度大、有浅色圈的菌落，经纯化，然后挑选典型菌落接种于斜面培养基，培养成熟后于4℃冰箱保存。

[0025] 各培养基如下：

[0026] 富集培养液的组分及用量(g/L)：牛肉浸膏2，蛋白胨9，NaCl 5，MgSO40.6，溶菌酶0.03(50万U/g)，蒸馏水1000mL。

[0027] 选择培养基的组分及用量(g/L)：丙三醇25，NaNO32.5，K2HPO41.2，MgSO40.4，NaCl0.4，FeSO40.015，CuSO42.0，丙酸钠2.0，纯化琼脂粉15。

[0028] 斜面培养基的组分及用量(g/L)：丙三醇12，NaNO32.5，K2HPO40.9，MgSO40.6，NaCl0.6，FeSO40.015，纯化琼脂粉14。

[0029] (3)菌株鉴定

[0030] 筛选菌株的个体形态特征为：长杆状1.5-1.8μm×2.5-5.0μm，短杆状1.5-1.8μm×1.8-2.5μm。单个排列，有丰富的粘液层，不运动，没有芽孢。好氧。

[0031] 筛选菌株的培养特征为：在牛肉浸膏蛋白胨培养基平板上产生中央突起，边缘整齐、有光泽、粘性大的不透明菌落。在斜面上形成稠厚、有光泽、粘性大、淡黄色的菌苔。

[0032] 筛选菌株的生理生化特征为：接触酶阳性。在蛋白胨水培养基中能够强烈发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖产酸产气，发酵果糖、木糖、丙三醇、乳糖产酸产气，缓慢发酵糊精和淀粉产酸产气，不发酵木糖醇产酸产气。甲基红阴性，V-P阳性。耐7％NaCl生长。淀粉水解平板上2天形成Φ17cm庞大菌落。油脂水解阴性。明胶水解阴性。石蕊牛奶还原。脲酶阳性。

[0033] 该菌株16SrDNA序列测定结果如下(SEQ-1)：

[0034]ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGTTGAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTA。

[0035] 该菌株命名为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)LDX1-1，它已于2015年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.11330。

[0036] 实施例2

[0037] 液体菌种培养基的组分及用量(g/L)：蔗糖12，NH4NO32，K2HPO40.8，MgSO40.5，NaCl 0.4，FeSO40.013。

[0038] 发酵培养基的组分及用量(g/L)：蔗糖23，NH4NO32，K2HPO41.2，MgSO40.5，NaCl0.4，FeSO40.015，MnSO40.02，松针提取物(生产企业为西安润雪生物科技有限公司，产品规格为比例提取10:1)0.2，玉米淀粉7，玉米浆1.8，ZnSO40.03。

[0039] (1)液体菌种培养

[0040] 将活化培养的斜面菌种接种于液体菌种培养基中，在26℃、170r/min条件下震荡培养13h，得液体菌种备用；

[0041] (2)发酵培养

[0042] 将液体菌种按2.5％(体积比)的接种量接种于发酵培养基，在发酵罐中进行发酵培养30h，发酵控制条件为：温度26℃、通气比为0.45VVM、搅拌转速为500r/min。发酵结束得发酵液，将发酵液过滤去除杂质，得液体蛋白多糖(PPS)微生物絮凝剂。发酵液经测定，生物絮凝剂产率为61％，产量为2.1％，絮凝率为95％。

[0043] 生物絮凝剂产率的测定方法为：将生物絮凝剂调pH值为7.0，用2.5倍无水乙醇进行混合沉淀，以5000r/min离心5min获得初次沉淀物，然后用6倍无水乙醇洗涤初次沉淀物，以5000r/min离心5min，获取二次沉淀物，把二次沉淀物在40℃真空干燥6h，称干重。产率＝(絮凝剂干重Kg/碳源干重Kg)×100％。

[0044] 絮凝率的测定方法为：配制重量比为0.4％的高岭土悬液和5％的CaCl2溶液，在六联搅拌仪的反应杯中加入体积比98％高岭土悬液、2％CaCl2溶液，混匀，制成絮凝体系备用。测定时每100mL絮凝体系加入20μL发酵液，以120r/min的搅拌转速快速混合40S，然后再以60r/min的搅拌转速缓慢混合120S。静止5min。吸取上清液，测定波长550nm下的OD值B。加蒸馏水替代发酵液重复以上操作测得OD值A。絮凝率＝{(A-B)/A}×100％。

[0045] 实施例3：生物絮凝剂对污水处理的应用

[0046] 将实施例2制备的生物絮凝剂应用于对生活污水进行处理。对生活污水进行处理的操作方法是：往具有搅拌功能絮凝装置的生活污水中加入适量絮凝剂，以120r/min的搅拌转速快速混合40S，然后再以60r/min的搅拌转速缓慢混合120S。静止30min，污染物沉淀分离。吸取上清液测定。

[0047] 对青岛城投大任水务有限公司生活污水原水(COD为859mg/L，总磷为22.9mg/L，2+ 3+
Mn 为0.434mg/L，Fe 为84.6mg/L)进行处理，生物絮凝剂PPS使用量(干重)为每吨水3-5g，达到的优良结果是：SS絮凝率为93％，COD去除率为93％，总磷去除率为86％，重金属Mn2+去除率为87％，Fe3+的去除率为97％。