一种采用高效液相色谱法测定样品中甲卡西酮含量的方法

摘要

本发明公开一种采用高效液相色谱法测定样品中甲卡西酮含量的方法，包括如下步骤：(1)工作液的配制；(2)样品溶液的配制；(3)检测条件的设置；(4)甲卡西酮样品含量的测定。本发明采用反相色谱等度洗脱，在12分钟内完成分析；其具有高效、准确的检测效果，可用于甲卡西酮样品含量的测定，为司法部门定罪量刑提供技术支持。

权利要求

1.一种采用高效液相色谱法测定样品中甲卡西酮含量的方法，其包括如下步骤：(1)工作液的配制；所述工作液的配制，采用内标法定量，选择2-苯乙胺作为内标物质；

步骤(1)中，取甲卡西酮标准储备溶液，用质量浓度为0.1mg/mL的内标物质的溶液依次稀释成甲卡西酮质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液，并保持内标溶液的浓度均为0.01mg/mL；

(2)样品溶液的配制；在步骤(2)中：称取样品，加入流动相溶解，振荡，离心，离心后取上清液，加入内标物质，并加入流动相，振荡均匀后即得到样品溶液；流动相与步骤(3)中的流动相相同；

(3)检测条件的设置；步骤(3)中，色谱柱规格为250mm×4.6mm,5μm，柱温为35℃，检测波长254nm；

(4)样品中甲卡西酮含量的测定；

(5)实验结果计算，

其中，步骤(3)中，色谱柱采用反相苯基色谱柱，流动相为A-1～5mM乙酸铵缓冲液：B-乙腈，A:B＝(20～40):(60-80),流速为1.0-1.5mL/min；流动相使用前经0.45μm微孔过滤膜过滤后放入超声波清洗器中超声10～15min，充分脱出流动相中的气体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，A-pH＝5.0的4mM乙酸铵缓冲液：B-乙腈，A:B＝20:80,流速为1.2mL/min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在向样品中加入流动相之前，使用苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的混合溶液萃取样品中的甲卡西酮，苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的体积比为

5:2:1.5，向分离出的有机相中加入HCl质量分数为15％的盐酸,除去有机相后将剩余物置于35℃快速浓缩仪上浓缩至干。

说明书

一种采用高效液相色谱法测定样品中甲卡西酮含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及刑侦领域毒品检测领域，特别涉及采用高效液相色谱法测定样品中甲卡西酮含量的方法。

背景技术

[0002] 甲卡西酮是近年来出现的对人体有相当危害的新型毒品。这种危害不仅影响人体的生理状况，还会影响人的心理活动，过量还会导致死亡。甲卡西酮的滥用不仅对人体有危害，而且对社会的发展也会造成不利影响。在国家食品药品监管总局、公安部、国家卫生计生委发布的2007版《麻醉药品和精神药品品种目录》中，将甲卡西酮列为一类精神药品予以管制。

[0003] 甲卡西酮系统化学命名为：N-甲基卡西酮，其化学结构式如式(1)所示：

[0004]

[0005] 现有技术有采用气相色谱/质谱联用法、红外光谱分析法、高效液相色谱法以及液质联用技术等测定甲卡西酮样品含量。其中，在利用液相色谱法检测的过程中，仍然存在检测时间长，检测效率低下的技术问题，导致刑侦工作效率的降低。故急需一种高精度的，并能够在更短时间内实现样品中甲卡西酮检测的方法。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明在于提供一种精密度高、检测时间短的高效液相色谱法测定甲卡西酮样品含量的方法。

[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的：一种采用高效液相色谱法测定样品中甲卡西酮含量的方法，其包括如下步骤：

[0008] (1)工作液的配制；

[0009] (2)样品溶液的配制；

[0010] (3)检测条件的设置；

[0011] (4)样品中甲卡西酮含量的测定；

[0012] (5)实验结果计算，

[0013] 其中，步骤(3)中，色谱柱采用反相苯基色谱柱，流动相为A-1～5mM乙酸铵缓冲液：B-乙腈，A:B＝(20～40):(60-80),流速为1.0-1.5mL/min。

[0014] 上述方法的步骤(3)中，步骤(3)中，A-pH＝5.0的4mM乙酸铵缓冲液：B-乙腈，A:B＝20:80,流速为1.2mL/min。

[0015] 上述方法采用内标法定量，选择2-苯乙胺作为内标物质。

[0016] 上述方法的步骤(1)中，取甲卡西酮标准储备溶液，用质量浓度为0.1mg/mL的内标物质的溶液依次稀释成甲卡西酮质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液，并保持内标溶液的浓度均为0.01mg/mL。

[0017] 上述方法的步骤(2)中：称取样品，加入流动相溶解，振荡，离心，离心后取上清液，加入内标物质，并加入流动相，振荡均匀后即得到样品溶液；流动相与步骤(3)中的流动相相同。

[0018] 上述方法采用外标法定量，其中，步骤(1)中，取甲卡西酮标准储备溶液，依次稀释成质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液。

[0019] 上述方法的步骤(2)中：称取样品，加入流动相溶解，振荡，离心，离心后取上清液，加入流动相，振荡均匀后即得到样品溶液；流动相与步骤(3)中的流动相相同。

[0020] 上述方法的步骤(3)中色谱柱规格为250mm×4.6mm,5μm，柱温为35℃，检测波长254nm。

[0021] 上述方法中，流动相使用前经0.45μm微孔过滤膜过滤后放入超声波清洗器中超声10～15min，充分脱出流动相中的气体。

[0022] 上述方法中，在向样品中加入流动相之前，使用苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的混合溶液萃取样品中的甲卡西酮，苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的体积比为5:2:1.5，向分离出的有机相中加入HCl质量分数为15％的盐酸,除去有机相后将剩余物置于35℃快速浓缩仪上浓缩至干。

[0023] 本发明的有益效果是：

[0024] 1)现有技术中，由于甲卡西酮与黄麻碱在色谱检测中难于分离，为了确保获得良好的分离度，只能采取降低流速的方式，提高分离度、改善峰形，导致甲卡西酮的检测时间通常在20分钟以上；而发明人通过大量试验发现，导致现有技术中检测时间长的主要因素在于流动相中酸性改性剂选择的不当，有机相比例不能过高，通过筛选大量改性剂，发明人发现当使用酸性乙酸铵缓冲液时，可以通过增加有机相比例，大大缩短检测时间，同时还能确保待测物质甲卡西酮与相关杂质黄麻碱的高分离度、高理论塔板数等技术效果，通过试验证明，本发明可以将甲卡西酮的检测时间缩短至12分钟左右，将近现有技术用时的一半，大大提高检测效率，为实际中刑侦工作的有效开展提供了有力保障。

[0025] 2)本发明采用了内标法定量，相比于现有技术中的外标法定量，由于内标法避免了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的偶然误差，因而，它的分析精密度比较高，是一种比较理想的定量分析方法，本发明中标准工作曲线R2达到1；其中，内标物质种类的确定是建立内标分析方法中的难点之一，内标物种类将直接影响检测结果的精确度、准确性，内标选择不当将直接导致检测无法实现，发明人通过大量试验，确定2-苯乙胺作为内标物质，其与甲卡西酮分离度良好，实现了甲卡西酮的精确定量。

附图说明

[0026] 图1是甲卡西酮及其合成前体麻黄碱的液相色谱图，1-甲卡西酮，2-黄麻碱；

[0027] 图2是甲卡西酮和内标的液相色谱图，1-甲卡西酮，2-内标；

[0028] 图3是甲卡西酮的内标工作曲线；

[0029] 图4甲卡西酮的紫外吸收光谱；

[0030] 图5水-甲醇(90:10)液相图谱；

[0031] 图6pH＝3.5的甲酸水溶液–乙腈(95:5)液相图谱；

[0032] 图7pH＝4的甲酸水溶液–乙腈(95:5)液相图谱；

[0033] 图8 0.05％三氟乙酸做为流动相的液相图谱；

[0034] 图9 150mm苯基柱的液相图谱；

[0035] 图10卡西酮、麻黄碱、甲卡西酮和4-甲基甲卡西酮的混标图；

[0036] 图11三氟乙酸做为流动相的液相色谱图；

[0037] 图12A-图12C各缓冲盐浓度与柱效曲线。

具体实施方式

[0038] 实施例1：内标法定量检测

[0039] 本发明采用高效液相色谱法测定样品中甲卡西酮含量的方法，包括如下步骤：

[0040] (1)工作液的配制：取甲卡西酮标准储备溶液，用质量浓度为0.1mg/mL的内标物质2-苯乙胺的溶液依次稀释成甲卡西酮质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、
0.0005mg/mL的系列标准溶液，并保持内标溶液的浓度均为0.01mg/mL。

[0041] (2)样品溶液的配制：称取样品检材约45mg(本实施例的样品检材是使用甲卡西酮标准品与其它物质混合后制备的，甲卡西酮含量为51.32wt％)，用瓶口移液器加入20mL流动相提取，振荡10分钟，离心5分钟，离心后用1mL移液器吸取上清液1mL，加入约0.1mg内标物质2-苯乙胺，并用瓶口移液器加入10mL流动相，振荡均匀后取1.5mL装自动进样瓶，即得到样品溶液；

[0042] (3)检测条件的设置：采用Agilent SB-Phenyl色谱柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，色谱条件：A-pH＝5.0的4mM乙酸铵缓冲液：B-乙腈＝20:80【本发明中，乙酸铵缓冲液是以乙酸根的浓度计算，4mM即为4mmol/L,乙酸铵缓冲溶液与乙腈的比例为体积比】，流速1.2mL/min，柱温35℃，检测波长254nm；

[0043] (4)样品中甲卡西酮含量的测定，取样品溶液5μL进样检测；

[0044] (5)实验结果计算，利用内标法定量计算，即利用标准工作曲线，最终得到的待测甲卡西酮样品中甲卡西酮的质量含量为：51.22wt％。

[0045] 其中，流动相使用前经0.45μm微孔过滤膜过滤后放入超声波清洗器中超声10～15min，充分脱出流动相中的气体。

[0046] 结果显示，甲卡西酮拖尾因子1.586，理论塔板数为13726，甲卡西酮峰形较好，和麻黄碱能完全分开，液相色谱图如图1所示。

[0047] 实施例2：外标法定量检测

[0048] (1)工作液的配制；取甲卡西酮标准储备溶液，依次稀释成质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液。

[0049] (2)样品溶液的配制：称取样品检材约45mg(本实施例的样品检材是使用甲卡西酮标准品与其它物质混合后制备的，甲卡西酮含量为51.32wt％)，用瓶口移液器加入20mL流动相提取，振荡10分钟，离心5分钟，离心后用1mL移液器吸取上清液1mL，用瓶口移液器加入10mL流动相，振荡均匀后取1.5mL装自动进样瓶，即得到样品溶液；

[0050] (3)检测条件的设置：采用Agilent SB-Phenyl色谱柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，色谱条件：A-pH＝5.0的4mM乙酸铵缓冲液：B-乙腈＝20:80，流速1.2mL/min，柱温35℃，检测波长254nm；

[0051] (4)样品中甲卡西酮含量的测定，取样品溶液5μL进样检测；

[0052] (5)实验结果计算，利用外标法定量计算，即利用标准工作曲线，最终得到的待测甲卡西酮样品中甲卡西酮的质量含量为：51.01wt％。

[0053] 其中，流动相使用前经0.45μm微孔过滤膜过滤后放入超声波清洗器中超声10～15min，充分脱出流动相中的气体。

[0054] 实施例3

[0055] 本实施例与实施例1的区别在于样品及样品前处理过程不同：所用样品为甲卡西酮含量为51.32wt％的血液45mg，即取空白血液，添加甲卡西酮标准品；向样品中加入苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的混合溶液17mL，萃取样品中的甲卡西酮，苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的体积比为5:2:1.5，向分离出的有机相中加入HCl质量分数为15％的盐酸10mL,除去有机相后将剩余物置于35℃快速浓缩仪上浓缩至干，用瓶口移液器加入20mL流动相提取，振荡10分钟，离心5分钟，离心后用1mL移液器吸取上清液1mL，加入约0.1mg内标物质2-苯乙胺，并用瓶口移液器加入10mL流动相，振荡均匀后取1.5mL装自动进样瓶，即得到样品溶液。本实施例最终得到样品中甲卡西酮的质量含量为：50.96wt％。

[0056] 实施例4

[0057] 本实施例与实施例2的区别在于样品及样品前处理过程不同：所用样品为甲卡西酮含量为51.32wt％的血液，即取空白血液，添加甲卡西酮标准品。向样品中加入苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的混合溶液17mL，萃取样品中的甲卡西酮，苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的体积比为5:2:1.5，向分离出的有机相中加入HCl质量分数为15％的盐酸10mL,除去有机相后将剩余物置于35℃快速浓缩仪上浓缩至干，用瓶口移液器加入20mL流动相提取，振荡10分钟，离心5分钟，离心后用1mL移液器吸取上清液1mL，用瓶口移液器加入10mL流动相，振荡均匀后取1.5mL装自动进样瓶，即得到样品溶液。本实施例最终得到样品中甲卡西酮的质量含量为：50.44wt％。

[0058] 验证例1

[0059] (1)选择2-苯乙胺作为内标物质的过程。

[0060] 配制浓度分别为0.1mg/mL的甲卡西酮和0.1mg/mL的内标溶液，采用实施例中的色谱条件，获得的液相色谱图如图2所示，可见两者有较好的分离度。

[0061] (2)内标工作曲线的建立

[0062] 实验方法：取甲卡西酮标准储备溶液，用质量浓度为0.1mg/mL的内标溶液依次稀释成质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液，并保持内标溶液的浓度均为0.01mg/mL。分别取不同浓度的标准液5μL进样，记录响应的峰面积。每个浓度进样3次，并对3次峰面积比值的平均值A及质量浓度比值c(mg/mL)进行线性回归。

[0063] 实验结果表明，甲卡西酮的线性范围为0.005-0.5mg/mL，线性方程为A＝0.6664c-0.0172，R2＝1，图3为甲卡西酮的内标工作曲线。

[0064] 验证例2

[0065] 外标工作曲线的建立

[0066] 取甲卡西酮标准储备溶液，依次稀释成质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液。分别取不同浓度的标准液5μL进样，记录响应的峰面积。每个浓度进样3次，并对3次峰面积的平均值A及质量浓度c(mg/mL)进行线性回归。

[0067] 实验结果表明，甲卡西酮的线性范围为0.005-0.5mg/mL，线性方程为A＝6×106c+11143，R2＝0.9999，检出限为0.2μg/mL(S/N≥3)。

[0068] 比较例

[0069] 考察现有技术中酸性改性剂对实验结果的影响

[0070] (1)考察磷酸对实验结果的影响

[0071] 流动相：A-0.5％磷酸水溶液；B-乙腈。

[0072] 结论：用磷酸做流动相，随着有机相比例降低，拖尾严重，和麻黄碱分得不好。

[0073] (2)考察乙酸对实验结果的影响

[0074] 流动相：A-0.5％乙酸水溶液；B-乙腈。

[0075] 结论：甲卡西酮的峰形较好，但和麻黄碱不能分开。

[0076] (3)考察三氟乙酸对实验结果的影响

[0077] 流动相：A-三氟乙酸(pH＝3.5)的水溶液；B-乙腈。

[0078] 结论：用三氟乙酸(pH＝3.5)的水溶液做流动相，低流速时得到较好的峰形，但理论塔板数较低；高流速时变成双峰。

[0079] 可见，现有的酸性改性剂无法满足高流速、高理论塔板数、峰形好的检测要求。

[0080] 检测条件的优化选择实验

[0081] 1.1甲卡西酮的紫外吸收光谱

[0082] 从图4中可见，甲卡西酮的最大吸收波长为254nm，因此选择254nm做为主定量波长。由于其只有一个吸收峰，因此不存在辅定量波长。

[0083] 1.2液相条件的选择

[0084] 仪器：岛津超快速液相色谱(UFLC)仪，包括LC-20AD型泵、SIL-20AC型进样器、SPD-M20A型检测器、CTD-20AC型柱温箱、数据处理软件LC solution。

[0085] 1.2.1考察醇、水系统对实验结果的影响

[0086] 色谱条件：XR-ODS色谱柱(75mm×2.0mm,2.2μm)；柱温：35℃；检测波长254nm；流动相：水-甲醇(90:10)，流速0.2mL/min；进样量：10μL。

[0087] 结论：从图5中可见，醇、水系统不适合甲卡西酮的分析，峰形呈巨大的馒头峰。

[0088] 1.2.2考察不同种类的酸对实验结果的影响

[0089] 色谱条件：XR-ODS色谱柱(75mm×2.0mm,2.2μm)；柱温：35℃；检测波长254nm。

[0090] 考察酸的种类包括甲酸和三氟乙酸。

[0091] 1.2.2.1考察不同甲酸比例对实验结果的影响

[0092] 流动相：A-0.1％甲酸水溶液；B-乙腈

[0093] 表1.不同流动相比例对实验结果的影响

[0094]

[0095]

[0096] 结论：变换几种流动相比例，实验结果均不理想，峰形不好，且保留时间过短。

[0097] 1.2.2.2考察不同pH值甲酸对实验结果的影响

[0098] (1)pH＝3的甲酸溶液对实验结果的影响

[0099] 流动相：A-pH＝3的甲酸水溶液；B-乙腈。

[0100] 表2.不同流动相比例对实验结果的影响

[0101]

[0102] 结论：峰形不好，保留时间太短。

[0103] (2)pH＝3.5的甲酸溶液对实验结果的影响

[0104] 流动相：A-pH＝3.5的甲酸水溶液，B-乙腈，A:B＝95:5。

[0105] 结论：如图6所示，色谱峰拖尾，出峰时间太快，在溶剂峰前出峰。

[0106] (3)pH＝4的甲酸溶液对实验结果的影响

[0107] 流动相：A-pH＝4的甲酸水溶液，B-乙腈，A:B＝95:5。

[0108] 结论：如图7所示，色谱峰拖尾，出峰时间太快，在溶剂峰前出峰。

[0109] (4)pH＝4.5的甲酸溶液对实验结果的影响

[0110] 流动相：A-pH＝4.5的甲酸水溶液，B-乙腈。

[0111] 表3.不同流动相比例对实验结果的影响

[0112]

[0113]

[0114] 结论：流动相的酸性越弱，甲卡西酮的保留时间越短，峰形均有拖尾。

[0115] 1.2.2.2考察三氟乙酸对实验结果的影响

[0116] 流动相：A-0.05％三氟乙酸水溶液；B-乙腈；A:B＝90:10。

[0117] 结论：如图8所示，使用三氟乙酸，峰形得到较大改善，但色谱峰拖尾，需进一步优化条件。

[0118] 1.2.3考察缓冲盐对实验结果的影响

[0119] 色谱条件：XR-ODS色谱柱(75mm×2.0mm,2.2μm)；柱温：35℃；检测波长254nm；流动相：1mM乙酸铵(pH＝4.5)-乙腈，流速0.2mL/min；进样量：10μL。

[0120] 表4.不同流动相比例对实验结果的影响

[0121]

[0122] 结论：峰形均不理想，随着有机相比例的增加，出峰时间太快，用乙酸铵做流动相未得到较满意的实验结果。

[0123] 1.2.4考察色谱柱对实验结果的影响

[0124] 通过上述实验，所得到的甲卡西酮的色谱峰多不理想，峰形和保留时间都存在缺陷。另外，在上述实验条件下，甲卡西酮和其合成前体麻黄碱均不能得到完全分离，因此从色谱柱的角度考虑是否应更换柱子。

[0125] 色谱条件：柱温：35℃；检测波长254nm；进样量：10μL。

[0126] 1.2.4.1不同规格苯基柱对实验结果的影响

[0127] (1)色谱柱：Agilent SB-Phenyl色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm)

[0128] 流动相：A-pH＝3.5的三氟乙酸水溶液；B-乙腈。

[0129] 表5.不同流动相条件对实验结果的影响

[0130]

[0131] 结论：使用100mm的柱子，甲卡西酮峰形拖尾，和麻黄碱不能完全分离。

[0132] (2)色谱柱：Agilent SB-Phenyl色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)。

[0133] 流动相：A-pH＝3.5的三氟乙酸水溶液；B-乙腈。流速：0.2mL/min。

[0134] 结论：如图9所示，用150mm的柱子，甲卡西酮和麻黄碱分不开。

[0135] (3)色谱柱：Agilent SB-Phenyl色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)

[0136] 流动相：A-pH＝3.5的三氟乙酸水溶液；B-乙腈。流速：0.2mL/min。

[0137] 结论：如图10所示，使用250mm的柱子，4个标样得到很好的峰形，且卡西酮、麻黄碱和甲卡西酮得到较好的分离。因此最终选择该色谱柱进行后续试验。

[0138] 1.2.4.2考察不同种类酸对实验结果的影响

[0139] (1)考察磷酸对实验结果的影响

[0140] 流动相：A-0.5％磷酸水溶液；B-乙腈。

[0141] 表6.不同流动相条件对实验结果的影响

[0142]

[0143] 结论：用磷酸做流动相，随着有机相比例降低，拖尾严重，和麻黄碱分得不好。

[0144] (2)考察乙酸对实验结果的影响

[0145] 流动相：A-0.5％乙酸水溶液；B-乙腈。

[0146] 结论：甲卡西酮的峰形较好，但和麻黄碱不能分开。

[0147] (3)考察三氟乙酸对实验结果的影响

[0148] 流动相：A-三氟乙酸(pH＝3.5)的水溶液；B-乙腈。

[0149] 结论：如图11所示，用三氟乙酸(pH＝3.5)的水溶液做流动相，低流速时得到较好的峰形，但理论塔板数较低；高流速时变成双峰。

[0150] 1.2.4.3考察缓冲盐对实验结果的影响

[0151] 由于改用250mm的苯基柱，再次考察乙酸铵缓冲溶液对实验结果的影响。

[0152] (1)考察不同pH值的缓冲盐对实验结果的影响

[0153] A.流动相A为pH3.5的1mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈。

[0154] 考察不同流动相比例对实验结果的影响，考察的指标包括保留时间、拖尾因子和理论塔板数。

[0155] 表7.考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0156]

[0157] 结论：有机相比例从10％至40％时，保留时间依次减少，之后随着有机相比例的增加，保留时间增加，原因可能是由于流动相比例不同导致的溶液pH值的变化；拖尾因子在有机相比例为30％时最小，之后逐渐增大，但在有机相比例达到90％时，突然降到0.637；理论塔板数随有机相浓度的增大而增大，到有机相比例达到85％时，达到最大，之后又变小。

[0158] B.流动相A为pH4.0的1mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈。

[0159] 表8.考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0160]

[0161]

[0162] 结论：随着pH值的增大，各流动相比例的保留时间均增大。随有机相比例的增加，保留时间先减小后增大；但拖尾因子随有机相比例的增加而减小，在有机相比例为85％时最小；理论塔板数也是随流动相比例的增大而增大，在有机相比例为85％时最大，之后又突然减小。但在该pH值条件下，甲卡西酮及其合成前体麻黄碱不能完全分离。

[0163] C.流动相A为pH4.5的1mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈。

[0164] 表9.考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0165]

[0166]

[0167] 结论：随着pH值的增大，各流动相比例的保留时间均增大。随有机相比例的增加，保留时间先减小后增大；但拖尾因子随有机相比例的增加而减小，在有机相比例为85％时最小；理论塔板数也是随流动相比例的增大而增大，在有机相比例为85％时最大，之后又突然减小。综合考虑保留时间、拖尾因子和理论塔板数3因素，选择有机相比例为80％的条件，考察流速对实验结果的影响。

[0168] 表10.考察不同流速对实验结果的影响

[0169]

[0170] 结论：在该pH值条件下，随着流速增加，保留时间减小，甲卡西酮和麻黄碱的拖尾因子均减小，但理论塔板数也随之降低。分离度只有在流速为1.4时达到最大为1.532，甲卡西酮及其合成前体麻黄碱不能完全分离。

[0171] D.流动相A为pH5.0的1mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈。

[0172] 表11.考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0173]

[0174] 结论：随着pH值的增大，各流动相比例的保留时间均增大。随有机相比例的增加，保留时间先减小后增大；但拖尾因子随有机相比例的增加而减小，在有机相比例为80％时最小随后增大；理论塔板数也是随流动相比例的增大而增大，在有机相比例为80％时最大，之后又突然减小。综合考虑保留时间、拖尾因子和理论塔板数3因素，选择有机相比例为80％的条件，考察流速对实验结果的影响。

[0175] 表12.考察不同流速对实验结果的影响

[0176]

[0177]

[0178] 结论：在该pH值条件下，随着流速增加，保留时间减小，甲卡西酮和麻黄碱的拖尾因子变化不明显，但理论塔板数随之降低。分离度较好，在各流速下均达到4.5以上，甲卡西酮及其合成前体麻黄碱能够完全分离。因而pH值为5.0是较好的pH值。

[0179] (2)考察不同缓冲盐浓度对实验结果的影响

[0180] A.流动相A为pH5.0的2mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈。

[0181] 表13.考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0182]

[0183]

[0184] 结论：与相同pH值的浓度为1mM的乙酸铵缓冲液比较，有机相比例为10％和20％时，保留时间略有增加，但有机相比例达到30％以后，保留时间明显减小；拖尾因子比同有机相比例的要小；理论塔板数在有机相比例为70％之前均有明显增加，80％之后略有减少。综合各因素分析，缓冲液浓度为2mM时，峰参数要好于1mM时。考虑保留时间、拖尾因子和理论塔板数3因素，选择有机相比例为80％的条件，考察流速对实验结果的影响。

[0185] 表14.考察不同流速对实验结果的影响

[0186]

[0187] 结论：在该缓冲盐浓度条件下，随着流速增加，保留时间减小，甲卡西酮和麻黄碱的拖尾因子比缓冲盐浓度为1mM时减小，更接近1，峰形较好，但理论塔板数随之降低。甲卡西酮及其合成前体麻黄碱能够完全分离。

[0188] B.流动相A为pH5.0的3mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈。

[0189] 表15.考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0190]

[0191] 结论：与相同pH值的浓度为1mM、2mM的乙酸铵缓冲液比较，有机相比例为10％时，保留时间略有增加，但有机相比例达到20％以后，保留时间明显减小；拖尾因子比同有机相比例的要小；理论塔板数在有机相比例为70％之前均有明显增加，80％之后略有减少。综合各因素分析，缓冲液浓度为3mM时，峰参数要好于1mM和2mM时。考虑保留时间、拖尾因子和理论塔板数3因素，选择有机相比例为80％的条件，考察流速对实验结果的影响。

[0192] 表16.考察不同流速对实验结果的影响

[0193]

[0194]

[0195] 结论：在该缓冲盐浓度条件下，随着流速增加，保留时间减小，甲卡西酮和麻黄碱的拖尾因子比缓冲盐浓度为1mM、2mM时增大，理论塔板数也随之降低。甲卡西酮及其合成前体麻黄碱虽能够完全分离，但峰参数与缓冲盐浓度为2mM比较不具有优势。

[0196] C.流动相A为pH5.0的4mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈。

[0197] 表17.考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0198]

[0199]

[0200] 结论：与相同pH值的浓度为1mM-3mM的乙酸铵缓冲液比较，保留时间均略有减少；拖尾因子与同有机相比例的比较无明显差异；理论塔板数明显增加，在有机相比例达到
80％时塔板数最高。综合各因素分析，缓冲液浓度为4mM时，峰参数要好于1mM至3mM时。考虑保留时间、拖尾因子和理论塔板数3因素，选择有机相比例为80％的条件，考察流速对实验结果的影响。

[0201] 表18.考察不同流速对实验结果的影响

[0202]

[0203]

[0204] 结论：在该缓冲盐浓度条件下，随着流速增加，保留时间减小；甲卡西酮和麻黄碱的拖尾因子保持在1.5左右，随流速变化不明显；理论塔板数虽随流速增加而降低，但均保持较高值。甲卡西酮及其合成前体麻黄碱能够完全分离，该缓冲盐浓度为一较好浓度。

[0205] D.流动相A为pH5.0的5mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈。

[0206] 表19.考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0207]

[0208] 结论：与相同pH值的浓度为4mM的乙酸铵缓冲液比较，保留时间在有机相比例为40％之前略有增加，之后减小；拖尾因子与同有机相比例的比较略有减小但差异不大；理论塔板数增加，在有机相比例达到80％时塔板数最高。综合各因素分析，缓冲液浓度为5mM时峰参数与4mM比较无明显差异。考虑保留时间、拖尾因子和理论塔板数3因素，选择有机相比例为80％的条件，考察流速对实验结果的影响。

[0209] 表20.考察不同流速对实验结果的影响

[0210]

[0211]

[0212] 结论：在该缓冲盐浓度条件下，随着流速增加，保留时间减小；甲卡西酮和麻黄碱的拖尾因子保持在1.3左右，随流速变化不明显；理论塔板数虽随流速增加而降低，但均保持较高值。甲卡西酮及其合成前体麻黄碱能够完全分离，该缓冲盐浓度为一较好浓度。

[0213] E.流动相A为pH5.0的10mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈。

[0214] 表21.考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0215]

[0216]

[0217] 结论：与相同pH值的浓度为5mM的乙酸铵缓冲液比较，保留时间在明显减小；拖尾因子与同有机相比例的比较略有减小但差异不大；理论塔板数增加，在有机相比例达到80％时塔板数最高。综合各因素分析，缓冲液浓度为10mM时峰参数与4mM、5mM比较无明显差异。考虑保留时间、拖尾因子和理论塔板数3因素，选择有机相比例为80％的条件，考察流速对实验结果的影响。

[0218] 表22.考察不同流速对实验结果的影响

[0219]

[0220] 结论：在该缓冲盐浓度条件下，随着流速增加，保留时间减小；甲卡西酮和麻黄碱的拖尾因子保持在1.5左右，与5mM比较拖尾因子变大；理论塔板数虽随流速增加而降低，但均保持较高值。甲卡西酮及其合成前体麻黄碱能够完全分离，但分离度均明显减少。我们绘制各缓冲盐浓度与柱效的曲线(数据见表23，图12A-C)，随缓冲盐浓度增加，保留时间明显减少；拖尾因子虽有变化，但不成线性，规律不明显；理论塔板数也成曲线变化，但缓冲盐浓度增加，甲卡西酮与麻黄碱的分离度降低。综合各影响因素，最终选择4mM为最佳的缓冲盐浓度。

[0221] 表23.各缓冲盐浓度与柱效参数

[0222]

[0223] (3)考察不同流动相比例对实验结果的影响

[0224] 由于已经选择了流动相A为pH5.0的4mM乙酸铵缓冲液，B为乙腈，从表17的数据中可以看出，流动相A：B＝80:20时，理论塔板数达到最大，同时拖尾因子最小，因而选择的最佳流动相比例为80:20。

[0225] (4)考察不同流速对实验结果的影响

[0226] 在流动相A：B＝80:20条件下，从表18的数据中可以看出，随着流速增加，保留时间减小；甲卡西酮和麻黄碱的拖尾因子保持在1.5左右，随流速变化不明显；理论塔板数虽随流速增加而降低，但均保持较高值。考虑分析时间对实验的影响，最终选择的最佳流速为1.2mL/min。