快速高灵敏同步定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法

摘要

本发明公开了一种快速高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及叶酸衍生物含量的方法，依次包括以下步骤：1)0.05M磷酸缓冲盐提取植物叶片中的叶酸；2)在步骤1)的叶酸提取物中添加老鼠血清轭合酶和鸡胰腺轭合酶；3)使用超滤离心管纯化去轭提取物；4)使用超高效液相色谱串联四极杆质谱常压电喷雾电离(ESI)正极模式分离和测定四氢叶酸、5‑甲基‑四氢叶酸、5‑甲酰‑四氢叶酸、5,10‑次甲基四氢叶酸、10‑甲酰‑叶酸、10‑甲酰‑四氢叶酸、叶酸在内的七种叶酸衍生物；5)叶酸定量测定。采用本发明的方法可以快速、灵敏、批量、同步测量低含量叶酸的植物叶片的总叶酸及七种叶酸衍生物含量。

权利要求

1.快速高灵敏同步定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、提取植物叶片中的叶酸及叶酸衍生物：

利用0.05M磷酸缓冲液煮沸提取植物叶片的叶酸，冷却并离心后，得上清液，上清液为叶酸提取物；

2)、添加两种叶酸轭合酶：

在步骤1)中的叶酸提取物中添加老鼠血清轭合酶和鸡胰腺轭合酶，充入氩气后37℃孵育2小时，100℃水浴5分钟终止酶活，离心后取上清液，上清液为叶酸去轭合提取物；

3)、使用超滤离心管纯化植物叶片叶酸去轭合提取物：

使用10kDa 500μL超滤离心管，活化后，往里加入500μL步骤2)所得的叶酸去轭合提取物，12000g 4℃离心15分钟，获得纯化后的叶酸纯化液；

4)、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸及叶酸衍生物质谱方法：

超高效液相色谱质谱联用检测系统为四极杆串联质谱常压电喷雾电离(ESI)正极模式；Waters IntelliStart Technology通过自动和手动优化所有叶酸衍生物的多离子反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)；每一种叶酸衍生物使用两个或三个产物离子确定，MassLynx 4.1软件用于系统运行、数据采集和数据分析，如下表1；

表1 叶酸及叶酸衍生物的多离子反应检测和化合物指标

5)、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸及叶酸衍生物色谱方法：

使用Waters  ACQUITY  UPLC系统进行叶酸衍生物的色谱分离，运行软件为TargetLynx4.1；柱温箱维持40℃，自动进样器维持4℃；色谱柱是ACQUITY UPLC BEH,C18column，规格为2.1mm×50mm，粒径1.7μm连接一个VanGuard前置柱C18，规格为5mm×

2.1mm，粒径1.8μm；流速0.4mL/min；进样量2μL，运行时间5分钟；流动相为洗脱液A和洗脱液B梯度洗脱，详见表2；针头清洗溶剂为乙腈/水混合液；

洗脱液A为0.1％甲酸溶于水；洗脱液B为0.1％甲酸溶于乙腈；乙腈/水混合液为乙腈/水＝50/50,v/v；

表2、UPLC-MS/MS最佳梯度洗脱

6)、植物叶片叶酸及叶酸衍生物的定量测定。

2.根据权利要求1所述的快速高灵敏同步定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法，其特征是：所述步骤1)中的0.05M磷酸缓冲液为每升加入10g L(+)-抗坏血酸和10ml二巯基丙醇的磷酸缓冲液。

3.根据权利要求2所述的快速高灵敏同步定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法，其特征是：所述步骤2)中在每10mL叶酸提取物中加入2mL鸡胰腺轭合酶，摇匀后，吸取3mL溶液于50mL离心管中，加入100μL老鼠血清轭合酶，摇匀，充入氩气，37℃孵育2小时，100℃水浴5分钟终止酶活。

4.根据权利要求3所述的快速高灵敏同步定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法，其特征是：所述步骤6)为：根据步骤4)和步骤5)的条件，对植物叶片叶酸及其衍生物进行定量测定，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积自动计算得出四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、

5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基-四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的含量，再根据四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的浓度和相对分子质量计算总叶酸含量。

说明书

快速高灵敏同步定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)快速且高灵敏度同步检测植物叶片总叶酸及七种叶酸衍生物含量的方法。

背景技术

[0002] 叶酸是一种具有重要营养价值的水溶性B族维生素，是指四氢叶酸及其衍生物这一类物质，它由蝶啶、对氨基苯甲酸和谷酰基链组成。作为一碳供体，叶酸参与嘌呤、嘧啶的合成和氨基酸的相互转化。人体缺少叶酸会导致一系列的慢性疾病，例如神经管缺陷、先天缺陷、巨红血球性贫血、心血管疾病和癌症等。然而，人类和哺乳动物不能自行合成叶酸，只能通过食物补充。但是，人们通过日常饮食摄入的叶酸含量低于健康标准(400μg每天)，因此，全球许多国家都在致力于通过生物强化的手段增加植物的叶酸含量，从而使人类可通过日常饮食摄入更多的叶酸。蔬菜是人类主要的膳食，蔬菜叶酸的生物强化也是全球目前研究热点之一，然而蔬菜中叶酸的含量很低，并且含有多种不稳定的衍生物，因此建立一种高灵敏度、高效稳定地检测植物叶片中叶酸含量的方法非常必要。

[0003] 由于植物中叶酸有许多结构类似物，并且不稳定，因此分析植物叶片的叶酸含量是一种挑战，而叶酸的提取过程是关键。由于叶酸对光、氧化剂和pH都非常敏感，因此缓冲液的pH和热处理都会影响到叶酸的稳定性。作物中叶酸主要以多谷氨酸盐的形式存在，即便是以单谷氨酸盐形式存在，也常是多种衍生物共存，因此需用叶酸轭合酶达到去轭合作用。叶酸轭合酶可用人类或大鼠的血清、猪肾脏和鸡胰脏等，选择适宜的叶酸轭合酶才能在提取过程中充分发挥去轭合作用。

[0004] 目前测定叶酸的方法有微生物法，但其只能测定总叶酸，不能区分叶酸衍生物，并且实验操作繁琐费时。现在也有越来越多使用气相色谱或液相色谱的方法测定植物和食物中的叶酸，但是气相色谱也不能区分不同的叶酸衍生物。不同的叶酸衍生物的生理功能各不相同，因此有效地区分它们非常重要。液相色谱可以有效区分不同形式的叶酸衍生物，但目前较多报道利用高效液相紫外检测器法检测组成单一、叶酸含量高的样品，不适宜检测叶酸含量低的样品，而且，此种方法检测时间较长，若批量检测则叶酸容易在检测过程中降解，因此只能检测少量样品。所以，建立稳定快速地提取植物叶片的叶酸并快速、高效、高灵敏度、批量同步检测植物叶片中叶酸含量及其不同叶酸衍生物含量的方法对植物生物强化相关领域研究具有重要意义。

[0005] 2011100064527的发明《同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法》存在着叶酸样品准备时间较长、测量时间长、同步只能检测叶酸及四种叶酸衍生物的技术缺陷。而本方法叶酸样品准备时间短、检测时间只需5分钟，可以同步定量检测叶酸及七种叶酸衍生物。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)快速高灵敏度同步测定植物叶片总叶酸及其衍生物含量的方法。应用此种方法可以快速同步测定植物叶片中总叶酸及多种叶酸衍生物的含量。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供快速高灵敏同步定量检测蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法，依次包括以下步骤：

[0008] 1)、提取植物叶片中的叶酸及叶酸衍生物：

[0009] 利用0.05M磷酸缓冲液煮沸提取植物叶片的叶酸，冷却并离心后，得上清液，上清液为叶酸提取物(包括叶酸及叶酸衍生物)；

[0010] 2)、添加两种叶酸轭合酶

[0011] 往步骤1)中的叶酸提取物添加老鼠血清轭合酶和鸡胰腺轭合酶，加入氩气后37℃孵育2小时，100℃水浴5分钟终止酶活，离心后取上清液，上清液为叶酸去轭合提取物；

[0012] 3)、使用超滤离心管纯化植物叶片叶酸去轭合提取物

[0013] 使用10kDa 500μL超滤离心管(Millipore，美国)，活化后，往里加入500μL步骤2)得的叶酸去轭合提取物，12000g 4℃离心15分钟，得到纯化后的叶酸纯化液(为过柱后所得的溶液)；

[0014] 4)、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸衍生物质谱方法

[0015] 超高效液相色谱质谱联用检测系统为四极杆串联质谱(Waters Xevo TQ-S,Waters,美国)常压电喷雾电离(ESI)正极模式。Waters IntelliStart Technology通过自动和手动优化所有叶酸衍生物的多离子反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)。每一种叶酸衍生物使用两个或三个子离子确定，结果如表1。MassLynx 4.1(Waters,美国)软件用于系统运行、数据采集和数据分析。

[0016] 表1 叶酸及叶酸衍生物的多离子反应检测和化合物指标

[0017]

[0018]

[0019] 5)、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸衍生物色谱方法

[0020] 使用Waters ACQUITY UPLC系统(Waters，美国)进行叶酸衍生物的色谱分离，运行软件为TargetLynx 4.1(Waters，美国)。柱温箱维持40℃，自动进样器维持4℃。色谱柱是ACQUITY UPLC BEH,C18column，规格为2.1mm×50mm，粒径1.7μm(Waters，美国)连接一个VanGuard前置柱C18，规格为5mm×2.1mm，粒径1.8μm(Waters，美国)。流速0.4mL/min；进样量2μL，运行时间5分钟。流动相为洗脱液A(0.1％甲酸溶于水)和洗脱液B(0.1％甲酸溶于乙腈)梯度洗脱，详见表2。针头清洗溶剂为乙腈/水混合液(50/50,v/v)；

[0021] 表2 UPLC-MS/MS最佳梯度洗脱

[0022]

[0023]

[0024] 6)、植物叶片叶酸衍生物的定量测定。

[0025] 作为本发明高效高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及其衍生物的方法的改进：步骤1)中的0.05M磷酸缓冲液浓度为每升加入10g L(+)-抗坏血酸和10ml二巯基丙醇的磷酸缓冲液。

[0026] 作为本发明高效高灵敏同步定量测量植物叶片总叶酸及其衍生物的方法的进一步改进：所述步骤2)中在每10mL叶酸提取物中加入2mL鸡胰腺轭合酶，摇匀后，吸取3mL溶液于50mL离心管中，加入100μL老鼠血清轭合酶，摇匀，充入氩气，37℃孵育2小时，100℃水浴5分钟终止酶活。

[0027] 作为本发明高效高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及其衍生物的方法的进一步改进：所述步骤6)为：根据步骤4)和步骤5)的条件，对植物叶片叶酸及其衍生物进行定量测定，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积自动计算得出四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的含量，再根据四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的浓度和相对分子质量计算总叶酸含量。

[0028] 本发明的方法包括以下：(A)提供一种磷酸缓冲液煮沸提取植物叶片中叶酸的方法；(B)提供两种叶酸轭合酶混合使用的方法；(C)提供一种超滤离心管纯化植物叶片叶酸提取物的方法；(D)提供一种检测系统为四极杆串联质谱(Waters Xevo TQ-S,Waters,美国)常压电喷雾电离(ESI)正极模式的质谱分离植物叶片中各种叶酸衍生物的方法；(E)提供一种色谱柱分离植物叶片中各种叶酸衍生物的方法；(F)提供一种用超高效液相色谱-串联质谱高效高灵敏度同步测定植物叶片中不同叶酸衍生物的方法。

[0029] 本发明的植物叶片中不同叶酸及其衍生物含量测定方法，具有以下特点：

[0030] (1)同时添加老鼠血清轭合酶与鸡胰腺轭合酶，预防叶酸的氧化破坏，提高去轭合效率。

[0031] (2)本发明中，使用规格500μL10kDa超滤离心管纯化叶酸提取物，离心机一次可以离心30个样品，既能有效过滤杂质，又大大加快了提取速度，减少叶酸及其衍生物在提取过程中的降解。

[0032] (3)ACQUITY UPLC BEH,C18column色谱柱结合超高效液相色谱四极杆串联质谱(UPLC-MS/MS)(Waters Xevo TQ-S,Waters,美国)结合常压电喷雾电离(ESI)正极模式可以同时分离和定量测定植物叶片七种叶酸衍生物，并且只需5分钟即可检测完毕，进样量只需2μL，检测方法高效灵敏，可批量检测样品。

[0033] 本发明植物叶片中不同叶酸及其衍生物含量测定方法，具有以下有益效果：

[0034] (1)本发明灵敏度高、快速高效,可批量同步检测成分复杂,低叶酸含量的植物叶片的叶酸及其衍生物含量的测定。

[0035] (2)本发明可以分离植物叶片中的七种叶酸衍生物，并可以定量分析总叶酸及七种叶酸衍生物含量。

附图说明

[0036] 下面结合附图对本方法具体实施方式作进一步详细说明。

[0037] 图1是不同叶酸衍生物的结构图；

[0038] 图2是UPLC-MS/MS测定不同形式叶酸衍生物的色谱图。所用样品为市场购得的小白菜，按照本方法制得叶酸提取物，但在步骤1)添加0.05M磷酸缓冲液同时添加混合标样(混合标样为七种叶酸衍生物标准品的混合物，每种衍生物添加量为0.5μg/100g)。样品按照本方法的条件进行测定，进样量为2μl，检测时间5分钟。10-CHO-THF，10-甲酰-四氢叶酸；5-CHO-THF，5-甲酰-四氢叶酸；10-CHO-FA，10-甲酰-叶酸；M-THF，5-甲基-四氢叶酸；5,10-CH+THF，5,10-次甲基四氢叶酸；THF，四氢叶酸；FA，叶酸。

具体实施方式

[0039] 本发明所提供的方法包括以下内容：

[0040] 1.试剂的配制方法

[0041] 本发明所用试剂包括：乙腈(液相色谱质谱联用级)，甲醇(液相色谱质谱联用级)，其他试剂为分析纯级别。L(+)-抗坏血酸(Sigma，美国)，二巯基丙醇(Sigma，美国)，大鼠血清(Sigma，美国，EC编号3-4-22-12)，活性炭(Sigma，美国)，鸡胰腺(WS301，上海物竞化工科技有限公司，中国，EC编号3-4-22-12)，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，乙酸钠，氯化钠(Merck，德国)，蔬菜叶酸标准物质BCR-485(标准参考物质和方法研究院，比利时)，水为超纯水(Millipore,美国)。叶酸对照品、四氢叶酸钠盐(H4folate)对照品、5-甲基-四氢叶酸钠盐(5-CH3–H4folate)对照品、5-甲酰-四氢叶酸钠盐(5-CHO-H4folate)对照品、5,10-次甲基四氢叶酸(5,10CH+-H4folate)对照品和10-甲酰-四氢叶酸(10-CHO-H4folate)均来自Merck&Cie(瑞士)公司，10-甲酰-叶酸钠盐(10-CHO-folic acid)来自Schirck’s实验室(瑞士)。上述对照品均需保存在-80℃条件。

[0042] 1.1、0.05M磷酸缓冲液(pH＝6.1)配置：取41.75ml 1mol/L磷酸二氢钾和8.1ml 1mol/L磷酸氢二钾，加入10g L(+)-抗坏血酸和10ml二巯基丙醇于1L烧杯中，加水至980ml左右，用1mol/L氢氧化钾调节pH至6.1，缓缓倒入1L容量瓶中定容至1L。

[0043] 1.2、标准叶酸衍生物贮存溶液配置：分别称取5mg的叶酸对照品，四氢叶酸钠盐对照品，5-甲基-四氢叶酸钠盐对照品，5-甲酰-四氢叶酸钠盐对照品，5,10-次甲基四氢叶酸对照品，10-甲酰-四氢叶酸对照品，10-甲酰-叶酸钠盐对照品，分别用上述0.05M磷酸缓冲液(pH＝6.1)溶解后，分别定容到25mL容量瓶中，制成200μg/mL的标准品的储备液，使用时用0.05M磷酸缓冲液(pH＝6.1)稀释至所需浓度。

[0044] 1.3两种叶酸轭合酶配置：

[0045] 取1mL老鼠血清，加入1/10体积的活性炭，冰浴搅拌1小时，离心，用0.20μm灭菌后的针式过滤器过滤，装入0.5ml已灭菌的小管于-20℃保存，得老鼠血清轭合酶。

[0046] 取5mg鸡胰腺溶于30ml 0.05M磷酸缓冲盐溶液(pH＝6.1)，于4℃保存；得鸡胰腺轭合酶。

[0047] 2.试验主要操作过程

[0048] 由于叶酸极容易被氧化破坏，因此配置上述1.1-1.3的溶液和试验的操作步骤都需在安装有黄色荧光灯的房间里进行，配置溶液所需要的容量瓶、烧杯等玻璃器皿都需用棕色器皿，或用锡箔纸包裹避光。超高效液相色谱质谱联用自动进样瓶也需用棕色瓶。

[0049] 2.1磷酸缓冲液煮沸提取植物叶片叶酸

[0050] 称取1g新鲜叶片迅速于液氮速冻后捻碎，然后迅速均匀分装到3个2.0ml刻度旋盖细菌保存管(TK372-SN-F/Q,BBI,生工)，每管加入500μL 0.05M磷酸缓冲液(pH＝6.1)和一颗直径5mm的不锈钢珠(拓赫机电科技)，用SCIENTZ-48高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技有限股份公司)于70Hz研磨6分钟。三个管子的样品磨碎后，一起转入至50ml塑料离心管，并用0.05M磷酸缓冲液(pH＝6.1)冲洗保存管使所有样品全部转移，充入氩气(防止提取物氧化分解)并迅速盖上盖子，于100℃水浴12分钟，后迅速冰浴使样品冷却至4℃。转速27000g，4℃离心20分钟，上清液转入10ml容量瓶，用0.05M磷酸缓冲液(pH＝6.1)定容至
10ml，作为植物叶片提取物。

[0051] 2.2添加两种叶酸轭合酶

[0052] 往2.1制得的植物叶片提取物中加入2ml鸡胰腺轭合酶，混匀，吸取3ml混匀后的溶液于新的50ml离心管中，加入100μL老鼠血清轭合酶，混匀，充入氩气迅速盖上盖子，37℃水浴孵育2小时，然后于100℃水浴5分钟终止酶活性，后迅速冰浴冷却至4℃。吸取1.5ml冷却后的溶液于2ml离心管中，转速18000g，4℃离心20分钟，上清为植物叶片叶酸去轭提取物，作下一步纯化。

[0053] 备注说明：上清的体积1.5ml，即离心所导致的体积变化量忽略不计。

[0054] 2.3超滤离心管纯化植物叶片叶酸去轭提取物

[0055] 超滤离心管(10kDa,Millipore,美国)活化后，加入步骤2.2制得的上清液500μL于超滤离心管中，转速12000g，4℃离心15分钟，得纯化后的植物叶片叶酸提取物(过柱后所得的溶液)，于4℃保存待测。

[0056] 2.4超高效液相色谱质谱联用(UPLC-MS/MS)质谱条件

[0057] 超高效液相色谱质谱联用检测系统为四极杆串联质谱(Waters Xevo TQ-S,Waters,美国)常压电喷雾电离(ESI)正极模式。检测样品之前，Waters IntelliStart Technology与MassLynx 4.1软件相整合，用于控制机器(UPLC-MS/MS)自动调整、校正和进行试验分析前的系统检查。Waters IntelliStart Technology通过自动和手动方法优化所有叶酸衍生物的多离子反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)，确定每个叶酸衍生物的产物离子质荷比。每一种叶酸衍生物使用两个或三个子离子确定，结果如表1。流动注射分析过程中自动优化源参数(由Waters IntelliStart Technology与MassLynx 4.1软件自动优化)，详见表2。MassLynx 4.1(Waters,美国)软件用于系统运行、数据采集和数据分析。

[0058] 表1 叶酸及叶酸衍生物的多离子反应检测和化合物指标

[0059]

[0060]

[0061] 表2 叶酸及叶酸衍生物四级杆串联质谱检测器最佳条件

[0062]

[0063] 2.5超高效液相色谱质谱联用(UPLC-MS/MS)色谱条件

[0064] 使用Waters ACQUITY UPLC系统(Waters，美国)进行叶酸衍生物的色谱分离，该系统包括二元液相泵、恒温自动进样器、恒温柱室，运行软件为TargetLynx 4.1(Waters，美国)。柱温箱维持40℃，自动进样器维持4℃。色谱柱是ACQUITY UPLC BEH,C18column，规格为2.1mm×50mm，粒径1.7μm(Waters，美国)连接一个VanGuard前置柱C18，规格为5mm×2.1mm，粒径1.8μm(Waters，美国)。流速0.4mL/min；进样量2μL(为上述步骤2.3所得的“纯化后的植物叶片叶酸提取物”或者是对照样品)，运行时间5分钟。流动相为洗脱液A(0.1％甲酸溶于水)和洗脱液B(0.1％甲酸溶于乙腈)梯度洗脱，详见表3。针头清洗溶剂为乙腈/水混合液(50/50,v/v)。每个样品检测结束将用进样针头清洗溶剂，再进行下个样品检测，针头清洗溶剂进样量同为2μL。

[0065] 表3 UPLC-MS/MS最佳梯度洗脱

[0066]

[0067]

[0068] 备注说明：上述表3中的％均为体积％。

[0069] 2.6植物叶片叶酸及其衍生物定量测定

[0070] 本发明的质谱条件(如2.4所述)和色谱条件(如2.5所述)下，分别进样对照品四氢叶酸(1-100ng/mL)、5-甲基-四氢叶酸(1-100ng/mL)、5-甲酰-四氢叶酸(1-100ng/mL)、5,10-次甲基四氢叶酸(0.05-75ng/mL)、10-甲酰-叶酸(0.05-75ng/mL)、10-甲酰-四氢叶酸(1-100ng/mL)和叶酸(0.05-75ng/mL)，进样量2μL，记录主峰峰面积，建立标准曲线(以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标)。

[0071] 按照本发明的提取方法(如2.1、2.2、2.3所述)，提取植物叶片的叶酸及其衍生物，测定供试样品叶酸，进样量2μL，记录主峰峰面积，TargetLynx 4.1(Waters，美国)按照外标法以峰面积自动计算得出相应各叶酸衍生物的浓度(ng/mL)，然后根据以下公式换算出供试样品中四氢叶酸(μg/100g)、5-甲基-四氢叶酸(μg/100g)、5-甲酰-四氢叶酸(μg/100g)、5,10-次甲基四氢叶酸(μg/100g)、10-甲酰-叶酸(μg/100g)、10-甲酰-四氢叶酸(μg/100g)、叶酸(μg/100g)含量。

[0072] 由于老鼠血清中含有一定量的5-甲基-四氢叶酸，因此计算供试样品5-甲基-四氢叶酸浓度时需先减去空白溶液的5-甲基-四氢叶酸浓度。空白溶液为不添加植物叶片，其余均按2.1、2.2、2.3、2.4、2.5操作所得。

[0073] 1)四氢叶酸含量(μg/100g)＝四氢叶酸(ng/mL)×12(mL)×10-3×100g/植物叶片重量(g)

[0074] 2)5-甲基-四氢叶酸含量(μg/100g)＝(5-甲基-四氢叶酸测定值－空白样品)(ng/mL)×12(mL)×10-3×100g/植物叶片重量(g)

[0075] 3)5-甲酰-四氢叶酸含量(μg/100g)＝5-甲酰-四氢叶酸(ng/mL)×12(mL)×10-3×100g/植物叶片重量(g)

[0076] 4)5,10-次甲基四氢叶酸含量(μg/100g)＝5,10-次甲基四氢叶酸(ng/mL)×12(mL)×10-3×100g/植物叶片重量(g)

[0077] 5)10-甲酰-叶酸含量(μg/100g)＝10-甲酰-叶酸(ng/mL)×12(mL)×10-3×100g/植物叶片重量(g)

[0078] 6)10-甲酰-四氢叶酸含量(μg/100g)＝10-甲酰-四氢叶酸(ng/mL)×12(mL)×10-3×100g/植物叶片重量(g)

[0079] 7)叶酸含量(μg/100g)＝叶酸(ng/mL)×12(mL)×10-3×100g/植物叶片重量(g)[0080] 8)总叶酸含量(μg/100g)＝441.4×(四氢叶酸含量(μg/100g)÷445.4+5-甲基-四氢叶酸含量(μg/100g)÷459.5+5-甲酰-四氢叶酸含量(μg/100g)÷473.5+5,10-次甲基四氢叶酸含量(μg/100g)÷457.1+10-甲酰-叶酸含量(μg/100g)÷469.41+10-甲酰-四氢叶酸含量(μg/100g)÷473.44+叶酸含量(μg/100g)÷441.4)

[0081] 注：445.4是四氢叶酸分子量，459.5是5-甲基-四氢叶酸分子量，473.5是5-甲酰-四氢叶酸分子量，457.1是5,10-次甲基四氢叶酸分子量，469.41是10-甲酰-叶酸分子量，473.44是10-甲酰-四氢叶酸分子量，441.4是叶酸分子量。

[0082] 实施例1.就本发明检测蔬菜叶酸标准物质CRM 485(来自标准参考物质和方法研究院，比利时)的试验事例说明。

[0083] 1.线性关系考察和敏感度试验

[0084] 在本发明的质谱、色谱条件下，分别选用标准叶酸衍生物溶液：四氢叶酸(1,15,30,50,75,90,100ng/mL)、5-甲基-四氢叶酸(1,15,30,50,75,90,100ng/mL)、5-甲酰-四氢叶酸(1,15,30,50,75,90,100ng/mL)、5,10-次甲基四氢叶酸(0.05,0.25,1,15,30,50,
75ng/mL)、10-甲酰-叶酸(0.05,0.25,1,15,30,50,75ng/mL)、10-甲酰-四氢叶酸含量(1,
15,30,50,75,90,100ng/mL)、叶酸(0.05,0.25,1,15,30,50,75ng/mL)，进样量2μl，测得峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归系数、斜率见表4。由表4可见，每个衍生物的回归系数R2均大于0.99，可见回归系数良好。

[0085] 标准叶酸衍生物四氢叶酸(1-100ng/mL)、5-甲基-四氢叶酸(1-100ng/mL)、5-甲酰-四氢叶酸(1-100ng/mL)、5,10-次甲基四氢叶酸(0.05–75ng/mL)、10-甲酰-叶酸(0.05–75ng/mL)、10-甲酰-四氢叶酸(1-100ng/mL)、叶酸(0.05–75ng/mL)以3倍信噪比浓度下对应样品浓度计算四氢叶酸，5-甲基–四氢叶酸，5,10-次甲基四氢叶酸、5-甲酰–四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的检测限，10倍信噪比浓度下对应样品浓度计算四氢叶酸，5-甲基–四氢叶酸，5-甲酰–四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的定量限，结果见表4。本方法测定的四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的检测限分别为0.03,0.06,0.10,0.10,0.07,0.20,0.11ng/ml，定量限分别为0.11,0.20,0.30,0.32,
0.23,0.40,0.35ng/ml，可见本方法灵敏度极高。

[0086] 表4 标准样品线性关系考察，检测限和定量限的测定结果

[0087]

[0088]

[0089] 2.精确度试验

[0090] 称取1g蔬菜类标准物质BCR-485(货号：BCR-485，比利时)，按照“2.1，2.2，2.3”项方法制得纯化后的植物叶片叶酸提取物，同时制备标准叶酸衍生物溶液，按照本方法的质谱条件详见“2.4”和色谱条件详见“2.5”，样品进样量2μL，运行时间5分钟，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积得到各形式叶酸衍生物的含量(ng/mL)，再按照方法“2.6”的公式计算四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸和总叶酸的含量(μg/100g)，详见表5。由于比利时标准参考物质和方法研究院认为5-甲基-四氢叶酸是蔬菜中叶酸的主要形式，因此四氢叶酸和5-甲酰-四氢叶酸的数据并未提供。结果可见，BCR-485主要叶酸衍生物为
5-甲基-四氢叶酸，本发明的UPLC-MS/MS方法测定的BCR-485的5-甲基-四氢叶酸和总叶酸含量在标准参考值范围内，说明本发明方法测定结果准确可靠。

[0091] 表5 蔬菜类标准物质BCR-485精确度试验

[0092]

[0093] aHPLC测定的BCR-485中5-甲基-四氢叶酸标准参考值

[0094] b微生物测定的BCR-485总叶酸标准参考值

[0095] 3.回收率试验

[0096] 称取1g市场购得的小白菜，按照本方法制得叶酸提取物，同时称取1g该小白菜，但在步骤1)添加0.05M磷酸缓冲液同时分别添加两种不同浓度的混合标样(混合标样为七种叶酸衍生物的混合物，低浓度混合标样为0.5μg/100g，高浓度混合标样为7.5μg/100g)，其他步骤完全相同。样品按照本方法的条件进行测定，进样量为2μl，检测时间5分钟。绝对回收率＝(小白菜与混合标样混合所测浓度－小白菜所测浓度)÷添加混合标样的浓度×100％，结果见表6。5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、10-甲酰-叶酸和叶酸的绝对回收率大于90％，而其余叶酸衍生物的回收率也大于70％，可见本方法回收率较高，数据可靠。

[0097] 备注说明：上述添加两种不同浓度的混合标样，以低浓度为例具体为：在500μL0.05M磷酸缓冲液(pH＝6.1)添加七种叶酸衍生物的混合物，从而使这七种叶酸衍生物的浓度均为0.5μg/100g。

[0098] 表6 叶酸衍生物回收率试验

[0099]

[0100] 4.相对标准偏差试验

[0101] 称取1g市场购置的小白菜，按照“2.1，2.2，2.3”项方法制得纯化后的植物叶片叶酸提取物，加入0.5μg/100g混合标准样品(在步骤2.3所得的“纯化后的叶酸纯化液”中加入七种叶酸衍生物的混合物，从而使这七种叶酸衍生物的浓度均为0.5μg/100g)，6个重复，同时制备标准叶酸衍生物溶液，按照本方法的质谱条件详见“2.4”和色谱条件详见“2.5”，样品进样量2μL，运行时间5分钟，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积得到各形式叶酸衍生物的含量(ng/mL)，再按照方法“2.6”的公式计算四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、10-甲酰-叶酸和总叶酸的含量(μg/100g)，记为A；然后对这6个样品重新进样，计算得总叶酸和叶酸衍生物含量，记为B，然后按照公式│B-A│/A计算对应叶酸衍生物的当天检测的相对标准偏差值。当天样品检测过后，放置4℃自动进样器，24小时后重新上样，样品进样量2μL，运行时间5分钟，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积得到各形式叶酸衍生物的含量(ng/mL)，再按照方法“2.6”的公式计算叶酸及叶酸衍生物含量(μg/100g)，记为C，然后按照公式│C-A│/A计算对应叶酸衍生物的隔天检测相对标准偏差值。结果见表7。由表7可见，当天检测的叶酸衍生物相对标准偏差在
1.6至4.1％范围内，隔天检测叶酸衍生物相对标准偏差在2.8至7.8％范围内，表明样品在自动进样器中至少保持24小时稳定，说明本方法至少可以连续检测24小时，可批量检测样品。

[0102] 表7 叶酸衍生物相对标准偏差试验

[0103]

[0104] 实施例1从线性关系考察，检测限和定量限、精确度试验、回收率和相对标准偏差试验证明本方法具有灵敏度极高、精确度高、回收率高、可批量检测样品的特点。本方法测定的叶酸衍生物最低检测限为四氢叶酸0.03ng/ml，最高检测限为10-甲酰四氢叶酸0.20ng/ml，最低定量限为四氢叶酸0.11ng/ml，最高定量限为10-甲酰-四氢叶酸0.40ng/ml，可见本方法灵敏度极高。本方法采用蔬菜类标准物质BCR-485进行精确度试验，检测的
5-甲基-四氢叶酸和总叶酸含量均在标准参考值范围内，可见本方法精确度高，结果准确可靠。本方法5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、10-甲酰-叶酸和叶酸的绝对回收率大于
90％，其余相对不稳定的叶酸衍生物绝对回收率也大于70％，可见本方法测定的数据准确。
本方法样品检测时间为5分钟，样品放置4℃自动进样器里至少可保持稳定24小时，因此本方法可以批量检测样品，提高检测效率。

[0105] 实施例2.就本发明检测市场购得的小白菜、菠菜、生菜和温室种植的水稻叶片中总叶酸及叶酸衍生物含量试验实例说明

[0106] 取市场购买的小白菜、菠菜、生菜和温室种植的水稻叶片样品，按照2.1-2.3方法制得叶酸提取溶液，同时制备标准叶酸衍生物溶液，按照上述2.4-2.5的超高效液相色谱质谱联用的质谱条件和色谱条件测定，进样量2μL，记录峰面积，制得各叶酸衍生物的标准曲线，并根据外标法以峰面积获得叶酸衍生物浓度(ng/mL)，再根据2.6的公式计算供试样品的总叶酸含量和各叶酸衍生物含量(μg/100g)，结果见表8。由表8可见，菠菜总叶酸含量最高，达223.74μg/100g，其次是小白菜，总叶酸含量207.851μg/100g，生菜和水稻叶片总叶酸含量相近，分别是117.458μg/100g和118.303μg/100g。在生菜中，主要叶酸衍生物为5-甲基-四氢叶酸和四氢叶酸；菠菜主要叶酸衍生物为5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸和5,10-次甲基四氢叶酸；小白菜主要叶酸衍生物为5-甲基-四氢叶酸和5-甲酰-四氢叶酸；水稻叶片主要叶酸衍生物为5-甲基-四氢叶酸和5-甲酰-四氢叶酸。

[0107] 表8 生菜、菠菜、小白菜和水稻叶片叶酸及其衍生物含量

[0108]

[0109] 此试验证明，本方法可以有效提取并快速同步检测生菜、菠菜、小白菜、水稻叶片的七种叶酸及叶酸衍生物，分别是四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸和叶酸。并且，本方法灵敏度高，可以检测到叶酸含量低的植物叶片的叶酸及其衍生物，可以有效检测生菜、菠菜、小白菜和水稻叶片的5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰叶酸、10-甲酰四氢叶酸和叶酸的含量，在国内尚属首次。

[0110] 对比例1、将步骤2.2中的“2mL鸡胰腺轭合酶”改成“6μL α-淀粉酶”，其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。

[0111] 对比例2、将步骤2.2中的“2mL鸡胰腺轭合酶”改成“15μL去蛋白酶”，其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。

[0112] 对比例3、将步骤2.2中的“2mL鸡胰腺轭合酶”改成“6μL α-淀粉酶和15μL去蛋白酶”，其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。

[0113] 对比例4、将步骤2.2改成：加完2ml鸡胰腺轭合酶，吸取3ml到新的离心管后，再加“6μL α-淀粉酶和15μL去蛋白酶”和“100μL老鼠血清轭合酶”。其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。

[0114] 上述所有对比例的检测结果如表9所示。表9可见，对比例4与实施例2的使用效果均最佳，但前者需多加6μL α-淀粉酶和15μL去蛋白酶，因此本发明的方法采取的鸡胰腺轭合酶与老鼠血清轭合酶混合使用最为经济高效。

[0115] 表9 不同的轭合酶搭配使用对测定小白菜叶酸总含量影响

[0116]

[0117] 对比例5、步骤2.2中“37℃水浴孵育2小时，”改成“37℃水浴孵育0.5小时，”，其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。

[0118] 对比例6、步骤2.2中“37℃水浴孵育2小时，”改成“37℃水浴孵育1小时，”，其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。

[0119] 对比例7、步骤2.2中“37℃水浴孵育2小时，”改成“37℃水浴孵育4小时，”，其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。

[0120] 对比例8、步骤2.2中“37℃水浴孵育2小时，”改成“37℃水浴孵育6小时，”，其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。

[0121] 对比例9、步骤2.2中“37℃水浴孵育2小时，”改成“37℃水浴孵育24小时，”，其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。

[0122] 上述所有对比例的检测结果如表10所示。表10可见，水浴孵育时长对小白菜总叶酸含量的影响从2小时后开始达到稳定水平，为了节约样品处理时间，本方法采用2小时水浴孵育时长最佳。

[0123] 表10 水浴孵育时长对测定小白菜叶酸总含量影响

[0124]

[0125] 对比例10、步骤2.3中“超滤离心管(10kDa,Millipore,美国)”改成“超滤离心管(5kDa,Millipore,美国)，其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测)。检测结果如表11所示。从表11可见，10kDa规格的超滤离心管效果更佳，且10kDa规格的超滤离心管价格更低。

[0126] 表11 不同超滤离心管规格对测定小白菜叶酸总含量影响

[0127]

[0128] 以上举例仅仅是本发明的两个具体实例。根据以上实例可以证明，本发明所述的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同步测定蔬菜总叶酸及叶酸衍生物含量的方法是高效快速、灵敏度极高、精确度高、回收率高，可以批量同步定量检测低含量叶酸植物叶片的7种叶酸及叶酸衍生物的方法。这种方法可以应用于蔬菜生物强化领域，也可以应用于研究者对植物叶酸及其衍生物方面的研究。该领域的其他技术人员从本发明公开的内容中直接推导出的或联想到的其他变形，均应认为是本发明的保护范围。