本发明属于烟用内衬纸、接装纸、条盒包装纸中有害物质残留的理化检验技术领域，尤其是一种烟用纸张中4-氨基偶氮苯残留量的测定方法，具体说是偶氮物质在碱性溶液中被连二亚硫酸钠还原成芳香胺，然后用叔丁基甲醚提取溶液中的芳香胺，经固相分散萃取后，用液相色谱串联质谱联用仪进行测定，内标法定量。本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟用接装纸、内衬纸和卷烟条与盒包装纸样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件。由于不需要过固相萃取柱，而是使用更为简便的固相分散萃取，无需旋转蒸发等繁琐净化和浓缩的步骤，使得该方法具有操作准确、回收率高、快速简便及灵敏度高等优点。
1.一种烟用纸张中4-氨基偶氮苯残留量的测定方法，其特征在于：将烟用纸剪碎后经还原分解，然后进行液液萃取和固相分散萃取，萃取液离心后直接以液相色谱-串联质谱测定纸张中的4-氨基偶氮苯，具体包括以下步骤：a、将烟用纸试样按照相关规定进行裁剪；
b、样品的提取：将样品剪成5 mm×5 mm左右的碎片，混合均匀；称取1.0 g样品；将碎片置于25 mL具塞离心管中，加入9 mL预热至70±2℃的10% 的氢氧化钠溶液，猛烈摇动，使液体浸透样品，于70±2℃水浴中放置30 min；加入连二亚硫酸钠水溶液1 mL，保持70±2℃，反应30 min；然后将离心管置于冰浴中，并不断振荡，迅速冷却至室温；
c、样品净化：往离心管中分别加入100μL内标工作溶液、10 mL叔丁基甲醚和5 g的无水硫酸钠，以2000 r/min涡旋振荡5min，然后以8000 r/min离心3min，把上层清液全部转移至
25mL的储液管中；继续往离心管中加入10 mL叔丁基甲醚，涡旋振荡5 min，离心3min，取出上清液，并与第一次上清液合并；取10 mL的合并后的上层清液，于15mL 的离心管中，加入
150 mg无水硫酸钠和50 mg C18固相吸附剂，于漩涡混合振荡仪上振荡2 min，以6000 r/min 离心2min，取上清液2mL，氮吹近干，用1mL甲醇复溶，进LC-MS/MS分析；
d、准备标准工作溶液：称取0.01g标准品4-氨基偶氮苯到10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液；
e、液相色谱-串联质谱测定:吸取配制好的不同浓度的标准工作溶液，注入液相色谱-串联质谱仪；色谱柱：规格150 mm×2.1 mm，3.5 μm的 ZORBAX C18柱 ；流动相：甲醇/水溶液，流速：300μL/min；梯度洗脱； 柱温：30 ℃；进样量：5μL；采用的质谱条件：扫描方式：正离子扫描；电喷雾离子源(ESI); 雾化气流量为55 psi; 气帘气流量18 psi；辅助加热气流量为60 psi；离子化温度500 ℃；碰撞气流量为12 psi；4种气体均为氮气；停留时间为100 msec；电离电压5500 V, 检测方式：正离子多离子反应监测（MRM）；
以内标法进行残留量的定量分析，即以目标物和内标的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.999，对提取后的样品进行测定，测得检出分析物和内标的定量离子对峰面积比，代入标准曲线，求得样品中4-氨基偶氮苯的残留量。
2.根据权利要求1所述的烟用纸张中4-氨基偶氮苯残留量的测定方法，其特征在于：所述烟用纸为烟用内衬纸、接装纸、条盒包装纸。
3.根据权利要求1所述的烟用纸张中4-氨基偶氮苯残留量的测定方法，其特征在于：步骤a中的相关规定指的是：烟用接装纸的裁剪方式按照YC 171-2008的规定进行，即准确裁切长200 mm，宽40 mm的接装纸样品，应包含一个单边；烟用内衬纸的裁剪方式按照YC 264-
2008的规定进行，即裁剪面积约170 cm2，即相当于普通卷烟软盒包装所采用的内衬纸面积；卷烟条与盒包装纸的裁剪方式按照YC/T 207-2006的规定进行，即对硬盒包装纸，参照印刷压痕准确裁取主包装面，面积为22.0 cm × 5.5 cm，对软盒包装纸，取一张软盒包装纸，面积为15.5 cm × 10.0 cm，对条包装纸，在包装正面中央区域，准确裁取22.0 cm×
4.根据权利要求1所述的烟用纸张中4-氨基偶氮苯残留量的测定方法，其特征在于：所述内标为D9-4-氨基联苯，内标工作溶液的配制方法如下：称取0.01gD9-4-氨基联苯标准品到10mL容量瓶中，用甲醇稀释得到浓度为1.0μg/mL的内标工作溶液。
5.根据权利要求1所述的烟用纸张中4-氨基偶氮苯残留量的测定方法，其特征在于：标准工作溶液的配制方法如下：称取10 mg标准品4-氨基偶氮苯到10 mL容量瓶中，精确至
0.0001g，用甲醇定容，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液；移取标准储备液100μL于
100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，得到浓度约为1.0μg/mL的工作溶液；分别移取一定体积的工作溶液于10 mL容量瓶中，并加入100μL内标工作溶液，用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的标准工作溶液，系列标准工作溶液浓度分别为：2 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL和100 ng/mL。
一种烟用纸张中4-氨基偶氮苯残留量的测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于烟用内衬纸、接装纸、条盒包装纸中有害物质残留的理化检验技术领域，主要涉及烟用内衬纸、接装纸、条盒包装纸中偶氮染料的测定技术，具体说是偶氮物质在碱性溶液中被连二亚硫酸钠还原成4-氨基偶氮苯，然后用液液提取和分散固相萃取方法提取和净化后，用液相色谱串联质谱联用仪进行测定，内标法定量。
背景技术
[0002] 纸包括内衬纸、接装纸、条盒包装纸等的生产过程中，需要加入各种各样的化学品如漂白剂、加工助剂、印刷油墨、防腐杀菌剂等化学物，以改善其包装性能和美观性。但是研究发现，这些化学品会残留在纸张中，进而迁移到卷烟中，其中一些迁移物具有毒性甚至致癌作用，对消费者的健康构成危害。美国、欧盟、日本等发达国家都对与食品接触的包装材料制定了相应的法规和限量标准，并实施了严格的市场准入管理。偶氮染料就是分子结构中含有偶氮基-N=N-的染料。根据偶氮基数目的多少可分为单偶氮、双偶氮染料及多偶氮染料。目前市场上70%左右的合成染料均为以偶氮结构为基础的偶氮染料。
[0003] 通常研究认为，偶氮染料其结构本身通常不会对人体产生有害影响，但有一些用“芳胺类中间体”合成的偶氮染料，因其与人体皮肤长期接触之后，会因人表面皮肤的弱酸环境，极易发生还原反应并使偶氮基断裂，生成大量芳胺类化合物。其反应式如下：
[0004]
[0005] 而这类化合物往往存在着严重致癌性，极易使人体细胞诱发病变，对人体皮肤甚至膀胱、输尿管等器官会产生极其严重的致癌损害，是应该被明令禁止的。这种违禁的偶氮染料，也被称为“致癌芳香胺染料”， 目前国际上明令禁止使用的芳香胺有24种，4–氨基偶氮苯（4–amino azo benzene）是其中的一种。偶氮染料的检测方法一般是将样品在70℃的柠檬酸缓冲溶液中用连二亚硫酸钠进行还原反应，快速冷却到室温，过硅藻土柱，并用叔丁基甲醚进行多次洗涤，收集合并含有目标物的有机层，用旋转蒸发仪浓缩至近干，最后定容进样分析。而4-氨基偶氮苯在酸性条件下容易还原，会生成苯胺和对苯二胺，而苯胺和对苯二胺本身未被禁用，且是偶氮染料合成的基本成分，因此若检测出苯胺和对苯二胺，并不能说明使用了4–氨基偶氮苯染料。因此4-氨基偶氮苯一般是在碱性条件下进行还原反应。
[0006] 目前，检测芳香胺的方法主要气相色谱法（GC-ECD）、气相色谱串联质谱法（GC-MS/MS）【李英、张焱、荆瑞俊等，气相色谱-质谱法测定纺织品中的芳香胺化合物。印染，2006（3）：40-42】，液相色谱法（HPLC-DAD）【王卉卉，牛增元，叶曦雯等，染色纺织品与皮革制品中23种禁用偶氮染料的高效液相色谱法测定。分析测试学报，28（8）：944-948】和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）【温裕云、欧廷、何明超等。超高效液相色谱-串联质谱法快速测定纺织品和皮革中偶氮染料释放的致癌芳香胺。色谱，31（4）：380-385；钱微君，阮勇，石东亮等。染色纺织品中禁用偶氮染料的高效液相色谱-电喷雾电离质谱联用法测定。纺织学报，31(12):89-92】。GC、HPLC法对仪器设备要求低，但易受到杂质干扰的影响，定性能力较差，因此容易出现假阳性结果。而且芳香胺极性较大、热稳定性较差，采用GC-MS法分析时，灵敏度不高且色谱峰峰型较差。高效液相色谱-串联质谱法中，母离子与子离子一一对应的多重反应监测模式( MRM ) 可以有效去除因复杂基质干扰而引起的假阳性现象在分析速度、灵敏度、选择性方面具有很好的优势，近年来得到快速普及。
发明内容
[0007] 本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种烟用纸张中4-氨基偶氮苯残留量的测定方法，即将样品剪碎，加入还原液，然后进行液液萃取，固相分散萃取、溶剂置换后直接以液相色谱-串联质谱测定纸张中4-氨基偶氮苯的测定方法，该方法能快速、准确检测纸张中4-氨基偶氮苯，测定结果准确，基质干扰少。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种烟用纸张中4-氨基偶氮苯残留量的测定方法，具体包括以下步骤：
[0009] a、将试样进行裁剪：烟用接装纸的裁剪方式按照YC 171-2008的规定进行，即准确裁切长200 mm，宽40 mm的接装纸样品（应包含一个单边）；烟用内衬纸的裁剪方式按照YC 2
264-2008的规定进行，即裁剪面积约170 cm（即相当于普通卷烟软盒包装所采用的内衬纸面积）；卷烟条与盒包装纸的裁剪方式按照YC/T 207-2006的规定进行，即对硬盒包装纸，参照印刷压痕准确裁取主包装面，面积为22.0 cm*5.5 cm，对软盒包装纸，取一张软盒包装纸，面积为15.5 cm*10.0 cm，对条包装纸，在包装正面中央区域，准确裁取22.0 cm*5.5 cm的样品；
[0010] b、样品的提取：将样品剪成5 mm*5 mm左右的碎片，混合均匀；称取1.0 g样品（精确至0.0001 g）；将碎片置于25 mL具塞三角瓶中，加入9 mL预热至70±2℃的10% 的氢氧化钠溶液，猛烈摇动，使液体浸透样品，于70±2℃水浴中放置30 min；加入连二亚硫酸钠水溶液1 mL，保持70±2℃，反应30 min；然后将锥形瓶置于冰浴中，并不断振荡，迅速冷却至室温；
[0011] c、样品净化：往离心管中分别加入100μL内标（D9-4-氨基联苯）工作溶液、10 mL叔丁基甲醚和适量的无水硫酸钠（约5 g），以2000 r/min涡旋振荡5min，然后以8000 r/min离心3min，把上层清液全部转移至25mL的储液管中。继续往离心管中加入10 mL叔丁基甲醚，涡旋振荡5 min，离心3min，取出上清液，并与第一次上清液合并。取10 mL的合并后的上层清液，于15mL 的离心管中，加入150 mg无水硫酸钠和50 mg C18固相吸附剂，于漩涡混合振荡仪上振荡2 min，以6000 r/min 离心2min，取上清液2mL，氮吹近干，用1mL甲醇复溶，进LC-MS/MS分析。
[0012] d、准备内标工作溶液：称取0.01gD9-4-氨基联苯标准品到10 mL容量瓶中，用甲醇稀释得到浓度为1.0μg/mL的内标工作溶液 ；
[0013] 准备标准工作溶液：称取0.01g的4-氨基偶氮苯标准品到10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液。
[0014] e、液相色谱-串联质谱测定:吸取配制好的不同浓度的标准工作溶液，注入液相色谱-串联质谱仪；
[0015] f、4-氨基偶氮苯测定结果的计算
[0016] 以内标法进行残留量的定量分析，即以目标物和内标的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.999，对提取后的样品进行测定，测得检出分析物和内标的定量离子对峰面积比，代入标准曲线，求得样品中4-氨基偶氮苯的残留量。
[0017] 在本发明中，标准工作溶液的配制方式如下：称取10 mg标准品到10 mL容量瓶中，精确至0.0001g，用甲醇定容，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液；移取标准储备液100 μL于100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，得到浓度约为1.0μg/mL的工作溶液；分别移取一定体积的工作溶液于10 mL容量瓶中，并加入100μL内标溶液。用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的标准工作溶液，系列标准工作溶液浓度分别为：2 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL和100 ng/mL；
[0018] 采用的液相色谱条件为：色谱柱：ZORBAX C18柱 (150 mm*2.1 mm，3.5μm)；流动相：甲醇/水溶液，流速：300μL/min；梯度洗脱程序见表1； 柱温：30 ℃；进样量：5μL；采用的质谱条件：扫描方式：正离子扫描; 电喷雾离子源(ESI); 雾化气流量为55 psi; 气帘气流量18 psi; 辅助加热气流量为60 psi; 离子化温度500 ℃; 碰撞气流量为12 psi; 4种气体均为氮气; 停留时间为100 msec; 电离电压5500 V, 检测方式：正离子多离子反应监测（MRM），MRM参数见表2。
[0019]
[0020] 本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟用接装纸、内衬纸和卷烟条与盒包装纸样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：
[0021] （1）本发明萃取液经过液液萃取和C18固相分散萃取，减少了基质的干扰。
[0022] （2）本发明方法利用内标法测定纸张中4-氨基偶氮苯的含量，避免了基质效应，而且同时进行定量和定性分析，无需再使用其他仪器进行定性分析。
[0023] （3）本发明方法由于不需要过固相萃取柱，而是使用更为简便的固相分散萃取，无需旋转蒸发等繁琐净化和浓缩的步骤，使得该方法具有操作准确、回收率高、快速简便及灵敏度高等优点。
[0024] ①本发明方法的检测限：
[0025] 将不同浓度的标准工作溶液注入LC－MS/MS，以3倍信噪比（S/N = 3）计算检测限（LOD），检测限为0.15 mg/kg。
[0026] ②本发明方法的重复性和加标回收率见表3：
[0027] 在空白样品中加入芳香胺的标准溶液，然后分别按本发明的方法进行前处理和LC－MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表3。由表3可以看出方法稳定性良好，平均相对标准偏差（RSD）小于5%，说明本发明重复性好。
[0028]
附图说明
[0029] 图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。
[0030] 图2是内标和4-氨基偶氮苯的标准溶液色谱图。
具体实施方式
[0031] 本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
[0032] 实例1：
[0033] 1．仪器与试剂：
[0034] 叔丁基甲醚、甲醇均为色谱级试剂，氢氧化钠，硫酸钠均为分析纯试剂；蒸馏水，符合GB/T 6682中一级水的要求。
[0035] API 4000四极杆串联质谱仪；水浴恒温振荡器；瑞士Mettler AE 163电子天平（感量：0.0001g）。
[0036] 2．样品处理：
[0037] 先将试样进行裁剪：烟用接装纸的裁剪方式按照YC 171-2008的规定进行，即准确裁切长200 mm，宽40 mm的接装纸样品（应包含一个单边）；烟用内衬纸的裁剪方式按照YC 264-2008的规定进行，即裁剪面积约170 cm（2 即相当于普通卷烟软盒包装所采用的内衬纸面积）；卷烟条与盒包装纸的裁剪方式按照YC/T 207-2006的规定进行，即对硬盒包装纸，参照印刷压痕准确裁取主包装面，面积为22.0 cm*5.5 cm，对软盒包装纸，取一张软盒包装纸，面积为15.5 cm *10.0 cm，对条包装纸，在包装正面中央区域，准确裁取22.0 cm * 5.5 cm的样品；
[0038] 将样品剪成5 mm*5 mm左右的碎片，混合均匀；称取1.0 g样品（精确至0.0001 g）；将碎片置于25 mL具塞三角瓶中，加入9 mL预热至70±2℃的10% 的氢氧化钠溶液，猛烈摇动，使液体浸透样品，于70±2℃水浴中放置30 min；加入连二亚硫酸钠水溶液1 mL，保持70±2℃，反应30 min；然后将锥形瓶置于冰浴中，并不断振荡，迅速冷却至室温；
[0039] 往离心管中分别加入100μL内标（D9-4-氨基联苯）工作溶液、10 mL叔丁基甲醚和适量的无水硫酸钠，以2000 r/min涡旋振荡5min，然后以8000 r/min离心3min，把上层清液全部转移至25mL的储液管中。继续往离心管中加入10 mL叔丁基甲醚，涡旋振荡5 min，离心3min，取出上清液，并与第一次上清液合并。取10 mL的合并后的上层清夜，于15mL 的离心管中，加入150 mg无水硫酸钠和50 mg C18固相吸附剂，于漩涡混合振荡仪上振荡2 min，以
6000 r/min 离心2min，取上清液2mL，氮吹近干，用1mL甲醇复溶，进LC-MS/MS分析；
[0040] 3.准备标准工作溶液：称取10 mg的4-氨基偶氮苯标准品到10 mL容量瓶中，精确至0.0001g，用甲醇定容，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液；移取标准储备液100μL于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，得到浓度约为1.0 μg/mL的工作溶液；分别移取一定体积的工作溶液于10 mL容量瓶中，并加入100μL内标溶液。用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的标准工作溶液，系列标准工作溶液浓度分别为：2 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL和100 ng/mL；
[0041] 4.测定方法: 以内标法进行残留量的定量分析，即以分析物和内标的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.999，对提取后的样品进行测定，测得检出分析物和内标的定量离子对峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的4-氨基偶氮苯的残留量。求得样品中4-氨基偶氮苯的含量分别是1.08 mg/kg。
[0042] 为判断方法的准确性，在此样品中加入1.0 μg的4-氨基偶氮苯标准溶液，进行同上的样品前处理，以LC-MS/MS测得分析物的选择离子峰面积，代入标准曲线，求得此时样品中的4-氨基偶氮苯含量为1.85 mg/kg，即目标物的加标回收率为88.9％，说明此方法是准确的。
[0043] 实例2：
[0044] 如实施例1所述的测定方法，选择另一烟用接装纸样品，样品中4-氨基偶氮苯未检出。
[0045] 实例3：
[0046] 如实施例1所述的测定方法，选择另一烟用内衬纸样品，样品中4-氨基偶氮苯未检出。
