葡萄串样纳米粒子、免疫探针、其制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种葡萄串样纳米粒子(GCNPs)，其可通过采用表面吸附蛋白的纳米银三角片为模板、氯金酸为氧化剂，经伽凡尼取代反应而制备，并具有比表面积大，分散性良好等特点。本发明还公开了基于所述GCNPs的信号放大GCNPs‑酶‑免疫探针，其可以通过将酶标记抗体吸附在GCNPs表面而得到。本发明还提供了所述的GCNPs‑酶‑免疫探针在酶联免疫检测方法中的应用。较之传统的酶标记抗体免疫探针，本发明的GCNPs‑酶‑免疫探针信号和检测灵敏度显著提升，而基于该免疫探针的酶联免疫检测分析方法在较少改变传统检测方法的成本的前提下，检测性能也显著地提高。

权利要求

1.一种葡萄串样纳米粒子的制备方法，其特征在于包括：

(1)将牛血清蛋白加入尺寸为15nm～30nm的纳米银三角片的溶液中混合均匀，使形成的混合溶液中牛血清蛋白的浓度为0.01mg/mL～5mg/mL，且牛血清蛋白与纳米银三角片的摩尔比为5:1～20:1，并静置过夜；

(2)向步骤(1)所获混合反应溶液中加入抗坏血酸，使形成的混合物中抗坏血酸的浓度为0.08mM～5mM，之后以0.1mL/min～2mL/min的速度注入浓度为0.01mM～0.5mM的HAuCl4溶液，获得葡萄串样纳米粒子。

2.由权利要求1所述方法制备的葡萄串样纳米粒子，其粒径为20nm～50nm。

3.一种免疫探针，其特征在于包含权利要求2所述的葡萄串样纳米粒子，所述葡萄串样纳米粒子上修饰有辣根过氧化物酶标记的抗体，所述辣根过氧化物酶标记的抗体包括辣根过氧化物酶标记单克隆抗体或多克隆抗体。

4.一种免疫探针的制备方法，其特征在于包括：将权利要求2所述的葡萄串样纳米粒子分散于含有0.1mM～10mM碳酸钾或碳酸钠的0.01～0.2mg/mL辣根过氧化物酶标记的抗体溶液中，0℃～8℃震荡1h～5h，之后于8000rpm～10000rpm离心10min～20min，进而于沉淀中获得所述免疫探针。

5.根据权利要求4所述的免疫探针的制备方法，其特征在于还包括：将离心获得的沉淀以含有0.01mg/mL～0.1mg/mL辣根过氧化物酶的溶液重悬，备用。

6.权利要求3所述的免疫探针或由权利要求4-5中任一项方法制备的免疫探针在酶联免疫检测中的应用。

7.一种酶联免疫检测方法，其特征在于包括：

将权利要求3所述的免疫探针或由权利要求4-5中任一项方法制备的免疫探针与一系列不同浓度的目标抗原标准样品在适于使免疫探针中所含抗体与所述抗原特异性结合的液相环境中进行酶联免疫反应，并记录检测型号，由此建立免疫探针检测信号与抗原浓度之间的标准对应关系；

以及，将所述免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品在适于使免疫探针中所含抗体与所述抗原特异性结合的液相环境中进行酶联免疫反应，并依据检测型号及所述标准对应关系而确定待测样品中的目标抗原浓度。

8.一种基于权利要求3所述的免疫探针或由权利要求4-5中任一项方法制备的免疫探针的间接竞争酶联免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：a.将作为包被抗原的小分子半抗原与卵清蛋白或牛血清蛋白的偶联物溶于碳酸盐缓冲液而形成包被液，并加入酶标板的不同孔中，25℃～37℃孵育1～4h，再以磷酸盐缓冲液洗涤后，加入以作为封闭液的、浓度为0.001wt％的分子量为2000～10000的聚乙二醇溶液于0℃～8℃封闭过夜；

b.将一系列不同浓度的小分子标准品的磷酸盐缓冲液溶液与步骤a所获的、分布于前述酶标板的不同孔中的包被抗原溶液混合，再加入含小分子抗体的酶标稀释液，25℃～37℃孵育后，以磷酸盐缓冲液洗涤，所述酶标稀释液采用包含0.1wt％明胶和0.05v/v％吐温-

20的pH值为7.0～8.0、浓度为0.01M～0.05M的磷酸盐缓冲液；

c.向步骤b所获的、分布于前述酶标板的不同孔中的各竞争反应混合体系中加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，所述抗体稀释液采用包含0.1wt％明胶和0.05v/v％吐温-20的pH值为7.0～8.0、浓度为0.01M～0.05M的磷酸盐缓冲液，25℃～37℃孵育0.5h～2h后，以磷酸盐缓冲液洗涤；

d.向步骤c所获的、分布于前述酶标板的不同孔中的各混合反应体系中分别加入显色液，25℃～37℃显色10min～30min，再加入作为终止液的、浓度为2M～4M的硫酸溶液，之后测量各混合反应体系于波长为450nm～650nm时的吸光值A，建立A与抗原量的标准对应关系。

9.一种基于权利要求3所述的免疫探针或由权利要求4-5中任一项方法制备的免疫探针的夹心酶联免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：a.将抗体溶于分布于酶标板的不同孔中的、浓度为0.01M～0.1M、pH值为9～10的碳酸盐包被缓冲液，形成蛋白质含量为1μg/ml～20μg/ml的溶液，再于25℃～37℃孵育1h～4h，之后以磷酸盐缓冲液洗涤，之后加入作为封闭液的、浓度为0.1wt％～5wt％的牛血清蛋白溶液，并于0℃～8℃封闭过夜；

b.将一系列不同浓度的大分子标准品的磷酸盐缓冲溶液与步骤a所获的、分布于酶标板的不同孔中的包被抗体溶液混合，25℃～37℃孵育0.5h～2h，之后以磷酸盐缓冲液洗涤；

c.向步骤b所获的、分布于前述酶标板的不同孔中的各结合反应混合体系中加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，所述抗体稀释液采用包含0.1wt％明胶和0.05v/v％吐温-20的pH值为7.0～8.0、浓度为0.01M～0.05M的磷酸盐缓冲液，25℃～37℃孵育0.5h～3h，以磷酸盐缓冲液洗涤；

d.向步骤c所获的、分布于前述酶标板的不同孔中的各混合反应体系中分别加入显色液，25℃～37℃显色10min～30min，再加入作为终止液的、浓度为2M～4M的硫酸溶液，之后测量各混合反应体系于波长为450nm～650nm时的吸光值A，建立A与抗原量的标准对应关系。

说明书

葡萄串样纳米粒子、免疫探针、其制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种葡萄串样纳米颗粒(GCNPs)-酶-免疫探针的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 酶联免疫分析技术是一种非常成熟的固相免疫分析模式，在临床诊断分析中已经获得了多年的应用，同时，近十年来，也在环境监测、食品安全危害物检测等领域中获得了广泛的应用。临床诊断和食品安全检测领域所面临的重要问题是低浓度抗原的免疫检测，以及其检测的准确性和可靠性。提高免疫检测灵敏度的方法之一就是制备高灵敏的免疫探针。

[0003] 贵金属纳米材料是一种重要的纳米材料，不仅具有纳米材料的宏观特征，同时其自身的物理化学性质也与纳米材料的性能有机结合了起来，具有粒径均一，分散性好，比表面积大等特性，因此可用于纳米免疫探针的制备。

[0004] 目前，在环境监测、食品危害物分析等许多领域，都对更高灵敏度的免疫分析方法具有迫切的需求，因此，提高传统的酶联免疫分析方法的检测性能，具有重要的应用价值。许多研究采用新的检测模式，如化学发光、电化学发光，与传统酶联免疫分析方法相比，它们具有更灵敏的检测能力，但是这些免疫分析方法需要较昂贵的设备和试剂，因此，检测成本显著提高，这极大地阻碍了其在环境监测、食品危害物分析等许多领域的应用。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种葡萄串样纳米粒子(GCNPs)及其制备方法。

[0006] 本发明的目的之二在于提供所述葡萄串样纳米粒子的用途，例如，其在制备免疫探针中的用途。

[0007] 本发明的目的之三在于提供一种基于所述葡萄串样纳米粒子的免疫探针(葡萄串样纳米-酶-免疫探针，或称GCNPs-酶-免疫探针，或者信号放大GCNPs-酶-免疫探针，简称免疫探针)及其制备方法。

[0008] 本发明的目的之四在于提供所述免疫探针在酶联免疫检测中的应用，例如，基于所述免疫探针的酶联免疫检测方法。

[0009] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

[0010] 一种葡萄串样纳米粒子(GCNPs)的制备方法，其包括：以蛋白修饰的纳米银三角片作为模板，并以氯金酸作为氧化剂，通过伽凡尼取代反应制备葡萄串样纳米粒子。

[0011] 所述GCNPs具有比表面积大、分散性良好等特性。

[0012] 其中，所述纳米银三角片可以采用常规方法制备，例如可参考Zhang,Q.；Li,N.；Goebl,J.；Lu,Z.；Yin,Y.J.Am.Chem.Soc.2011,133,18931-18939等文献制备。

[0013] 在一较佳实施方案之中，所述的葡萄串样纳米粒子的制备方法包括：

[0014] (1)将牛血清蛋白加入尺寸为15nm～30nm的纳米银三角片的溶液中混合均匀，使形成的混合溶液中牛血清蛋白的浓度为0.01mg/mL～5mg/mL，且牛血清蛋白与纳米银三角片的摩尔比为5:1～20:1，并静置过夜；

[0015] (2)向步骤(1)所获混合反应溶液中加入抗坏血酸，使形成的混合物中抗坏血酸的浓度为0.08mM～5mM之后以0.1mL/min～2mL/min的速度注入浓度为0.01mM～0.5mM的HAuCl4溶液，获得葡萄串样纳米粒子。

[0016] 由前述方法制备的葡萄串样纳米粒子，其粒径为20nm～50nm。

[0017] 一种免疫探针，其包含所述的葡萄串样纳米粒子，所述葡萄串样纳米粒子上修饰有辣根过氧化物酶标记的抗体(IgG-HRP)。

[0018] 其中，IgG-HRP是吸附在GCNPs表面。

[0019] 一种免疫探针的制备方法，其包括：将所述的葡萄串样纳米粒子分散于含有0.1mM～10mM碳酸钾或碳酸钠的0.01～0.2mg/mL辣根过氧化物酶标记的抗体溶液中，0℃～8℃震荡1h～5h，之后于8000rpm～10000rpm离心10min～20min，进而于沉淀中获得所述免疫探针。

[0020] 进一步的，所述的免疫探针的制备方法还可包括：将离心获得的沉淀以含有0.01mg/mL～0.1mg/mL辣根过氧化物酶的溶液重悬，备用。

[0021] 所述IgG-HRP是针对不同检测物的一个结构域、或者有效基团的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，或多克隆抗体。

[0022] 在一典型实施案例中，所述免疫探针的制备方法可以包括：将0.5-2mLGCNPs复合材料8000rpm离心10min，用含有0.001M碳酸钾的0.01-0.2mg/mLIgG-HRP(辣根过氧化物酶标记的抗体)溶液重悬，4℃震荡3h，9000rpm离心15min，用0.5-1mL含有0.01-0.1mg/mL辣根过氧化物酶的酶标稀释液重悬。

[0023] 在一更为具体的实施案例之中，所述免疫探针的制备方法包括以下具体步骤：

[0024] I.利用基于蛋白修饰的纳米银三角片为模板，氯金酸为氧化剂，通过伽凡尼取代反应制备GCNPs：

[0025] a.将200μL牛血清蛋白溶液(10mg/mL)加入到40mL纳米银三角片(0.1μM)溶液中，混合均匀，静置过夜。

[0026] b.取5-10mL上述混合溶液，加入825μL，0.01-0.6M抗坏血酸(AA)，再将5-20mL，0.08mM的HAuCl4以1mL/min的速度注射入，得到GCNPs；

[0027] II.GCNPs-酶-免疫探针的制备

[0028] a.将0.5-2mL步骤Ib所获的GCNPs8000rpm离心10min，用含有0.001M碳酸钾的0.01-0.2mg/mLIgG-HRP溶液重悬，4℃震荡3h，9000rpm离心15min，用0.5-1mL含有0.01-
0.1mg/mL辣根过氧化物酶的酶标稀释液重悬，即得到信号放大GCNPs-酶-免疫探针。

[0029] 本发明中由于GCNPs具有极高的比表面积，单个纳米材料可以同时负载多个酶标记抗体分子，进而极大提高免疫探针中酶与抗体的比例，因此，使用该免疫探针进行免疫分析，特别是对微量的待分析物进行免疫检测时，可放大免疫检测的信号，提高检测灵敏度。

[0030] 所述的免疫探针在酶联免疫检测中的应用。

[0031] 一种酶联免疫检测方法，其包括：

[0032] 将所述的免疫探针与一系列不同浓度的目标抗原标准样品在适于使免疫探针中所含抗体与所述抗原特异性结合的液相环境中进行酶联免疫反应，并记录检测型号，由此建立免疫探针检测信号与抗原浓度之间的标准对应关系；

[0033] 以及，将所述免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品在适于使免疫探针中所含抗体与所述抗原特异性结合的液相环境中进行酶联免疫反应，并依据检测型号及所述标准对应关系而确定待测样品中的目标抗原浓度。

[0034] 一种基于所述免疫探针的间接竞争酶联免疫分析方法，包括以下步骤：

[0035] a.将作为包被抗原的小分子半抗原与卵清蛋白或牛血清蛋白的偶联物溶于碳酸盐缓冲液而形成包被液，25℃～37℃孵育1～4h，再以磷酸盐缓冲液洗涤后，加入以作为封闭液的、浓度为0.001wt％的分子量为2000～10000的聚乙二醇溶液于0℃～8℃封闭过夜；

[0036] b.将步骤a所获的包被抗体溶液与一系列不同浓度的小分子标准品的磷酸盐缓冲液溶液混合，再加入含小分子抗体的酶标稀释液，25℃～37℃孵育后，以磷酸盐缓冲液洗涤，所述酶标稀释液采用包含0.1wt％明胶和0.05v/v％吐温-20的pH值为7.0～8.0、浓度为0.01M～0.05M的磷酸盐缓冲液；

[0037] c.向步骤b所获的各竞争反应混合体系中加入含有所述免疫探针的抗体稀释液,所述抗体稀释液采用包含0.1wt％明胶和0.05v/v％吐温-20的pH值为7.0～8.0、浓度为0.01M～0.05M的磷酸盐缓冲液，25℃～37℃孵育0.5h～2h后，以磷酸盐缓冲液洗涤；

[0038] d.向步骤c所获的各混合反应体系中分别加入显色液，25℃～37℃显色10min～30min，再加入作为终止液的、浓度为2M～4M的硫酸溶液，之后测量各混合反应体系于波长为450nm～650nm时的吸光值A，建立A与抗原量的标准对应关系。

[0039] 在一更为具体的实施方案之中，所述间接竞争酶联免疫分析方法包括以下步骤：

[0040] a.以小分子半抗原与卵清蛋白或牛血清蛋白的偶联物作为包被抗原，并以浓度为0.01-0.1M、pH值为9-10的碳酸盐缓冲液按1:2000～1:16000的体积比进行稀释后作为包被液加入酶标板的不同孔中，25-37℃孵育1-4h，PBST洗涤液洗涤3-5次，然后加入作为封闭液的、浓度为0.001wt-％的分子量为2000-10000的聚乙二醇溶液，0-8℃封闭过夜；

[0041] b.在前述酶标板的不同孔中再分别加入含有一系列不同浓度的小分子标准品的磷酸盐缓冲液溶液，再加入含小分子抗体的酶标稀释液，25-37℃孵育0.5-2h后以PBST洗涤液洗涤3～5次，所述酶标稀释液采用包含0.1wt％明胶和0.05％(v/v)吐温-20的pH值为7.0-8.0、浓度为0.01-0.05M的磷酸盐缓冲液；

[0042] c.在前述酶标板的不同孔中再分别加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，所述抗体稀释液采用包含0.1wt-％明胶和0.05％(v/v)吐温-20的pH值为7.0-8.0、浓度为0.01-0.05M的磷酸盐缓冲液，25-37℃孵育0.5-2h后，以PBST洗涤液洗涤3～5次；

[0043] d.在前述酶标板的不同孔中再分别加入显色液，25-37℃显色10-30min，最后每孔加入作为终止液的、浓度为2-4M的硫酸溶液，再测量各孔混合反应体系于波长为450-650nm时的吸光值A，建立A与抗原量的标准对应关系。

[0044] 在一些实施案例之中，所述间接竞争酶联免疫分析方法可以包括以下步骤：

[0045] a.抗原的包被：以小分子半抗原与卵清蛋白或牛血清蛋白的偶联物作为包被抗原，以0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原以1:2000～1:16000进行稀释，作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，37℃孵育2h，PBST洗涤液洗涤3次，然后用0.001％分子量为6000的聚乙二醇PEG作为封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；

[0046] b.竞争反应：每孔分别加入以标准品稀释液磷酸盐缓冲液PBS稀释的系列浓度之一的小分子标准品50μL到各自的酶标孔中，将小分子抗体以酶标稀释液：含0.1％明胶，0.05％吐温-20、pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液PBST，按1:8000～1:64000比例稀释后，加入酶标板中，每孔50μL，37℃孵育30min后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

[0047] c.加GCNPs-酶-免疫探针：以抗体稀释液将GCNPs-酶-免疫探针以1:1～1:8稀释，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

[0048] d.显色：每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；最后每孔加入终止液2M硫酸溶液50μL；用酶标仪测量波长为450nm时的吸光值A450，建立A450与抗原量的关系。

[0049] 之后，再用实际样品检测时得到的紫外吸收强度与此标准对应关系相对照即可确定实际样品中的抗原浓度。

[0050] 一种基于所述免疫探针的夹心酶联免疫分析方法，包括：

[0051] a.将抗体溶于浓度为0.01M～0.1M、pH值为9～10的碳酸盐包被缓冲液，形成蛋白质含量为1μg/ml～20μg/ml的溶液，再于25℃～37℃孵育1h～4h，之后以磷酸盐缓冲液洗涤，之后加入作为封闭液的、浓度为0.1wt％～5wt％的牛血清蛋白溶液，并于0℃～8℃封闭过夜；

[0052] b.将步骤a所获的包被抗原溶液与一系列不同浓度的大分子标准品的磷酸盐缓冲液溶液混合，25℃～37℃孵育0.5h～2h，之后以磷酸盐缓冲液洗涤；

[0053] c.向步骤b所获的各结合反应混合体系中加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，所述抗体稀释液采用包含0.1wt明胶和0.05v/v％吐温-20的pH值为7.0～8.0、浓度为0.01M～0.05M的磷酸盐缓冲液，25℃～37℃孵育0.5h～3h，以磷酸盐缓冲液洗涤；

[0054] d.向步骤c所获的各混合反应体系中分别加入显色液，25℃～37℃显色10min～30min，再加入作为终止液的、浓度为2M～4M的硫酸溶液，之后测量各混合反应体系于波长为450nm～650nm时的吸光值A，建立A与抗原量的标准对应关系。

[0055] 在一更为具体的实施方案之中，所述夹心酶联免疫分析方法包括以下步骤：

[0056] a.以浓度为0.01-0.1M、pH值为9-10的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释形成蛋白质含量为1～20μg/ml的溶液，再分别加入酶标板的不同孔中，25-37℃孵育1-4h，之后以PBST洗涤液洗涤3-5次，再加入作为封闭液的、浓度为0.1-5wt-％的牛血清蛋白溶液，0-8℃封闭过夜；

[0057] b.在前述酶标板的不同孔中再分别加入一系列不同浓度的大分子标准品的磷酸盐缓冲液，25-37℃孵育0.5-2h，之后以PBST洗涤液洗涤3-5次。；

[0058] c.在前述酶标板的不同孔中再分别加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，所述抗体稀释液采用包含0.1wt％明胶和0.05％(v/v)吐温-20的pH值为7.0-8.0、浓度为0.01-0.05M的磷酸盐缓冲液。25-37℃孵育0.5-2h后，以PBST洗涤液洗涤3～5次；

[0059] d.在前述酶标板的不同孔中再分别加入显色液，25-37℃显色10-30min，再加入作为终止液的、浓度为2-4M的硫酸溶液，之后测量各混合反应体系于波长为450-650nm时的吸光值A，建立A与抗原量的标准对应关系。

[0060] 在一些实施案例之中，所述夹心酶联免疫分析检测方法可以包括以下步骤：

[0061] a.包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～20μg/ml,在酶标板的每孔中加入100μL，37℃孵育2h，PBST洗涤液洗涤3次。用0.1-5％的牛血清蛋白作为封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；

[0062] b.结合反应：每孔分别加入以标准品稀释液磷酸盐缓冲液PBS稀释的系列浓度之一的大分子标准品或者处理好的样品100μL到各自的酶标孔中，置37℃孵育30min。PBST洗涤液洗涤3次。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)；

[0063] c.加GCNPs-酶-免疫探针：以抗体稀释液将GCNPs-酶-免疫探针以1:1～1:8稀释，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

[0064] d.显色：每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；最后每孔加入终止液2M硫酸溶液50μL；用酶标仪测量波长为450nm时的吸光值A450，建立A450与抗原量的关系。

[0065] 之后，再用实际样品检测时得到的紫外吸收强度与此标准对应关系相对照即可确定实际样品中的抗原浓度。

[0066] 前述显色液可以选用业界已知的合适类型。

[0067] 优选的，所述显色液可以包括：

[0068] A液：0.933g柠檬酸，3.68g十二水合磷酸氢二钠，18μL质量分数30％过氧化氢用超纯水定容至100mL；

[0069] B液：60mg 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；

[0070] 使用前将A液与B液以5:1体积比混合。

[0071] 与现有的技术相比较，本发明具有以下优点：

[0072] 1、本发明采用基于蛋白修饰的纳米银三角片为模板、氯金酸为氧化剂，通过伽凡尼取代反应制备GCNPs，设备和工艺简单，分散性好，比表面积大；

[0073] 2、本发明采用酶联免疫反应验证了GCNPs-酶-免疫探针的活性，该方法简便快速，重复性高；

[0074] 3、本发明的GCNPs-酶-免疫探针较之传统的酶标记抗体免疫探针信号和检测灵敏度显著提升；

[0075] 4、基于本发明GCNPs-酶-免疫探针的酶联免疫检测分析方法在较少改变传统检测方法的成本的前提下，检测性能显著地提高。

附图说明

[0076] 图1是本发明实施例1中纳米银三角片的TEM图；

[0077] 图2是本发明实施例1中GCNPs的TEM图；

[0078] 图3a-图3b分别是赭曲霉毒素A(OTA)的传统酶联免疫反应标准曲线和本发明实施例2中赭曲霉毒素A(OTA)的酶联免疫反应标准曲线；

[0079] 图4a-图4b分别是前列腺特异抗原(PSA)的传统酶联免疫反应标准曲线和本发明实施例3中前列腺特异抗原(PSA)的酶联免疫反应标准曲线。

具体实施方式

[0080] 现结合若干实施例及附图对本发明的技术方案作进一步地描述，但本发明的实施方式并不仅限于此。

[0081] 下述实施例中，如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂例如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、显色液等也均可以是业界习知的适用类型，以及，如下出现的％若非特别说明则均指wt％。

[0082] 实施例1：葡萄串样纳米粒子(GCNPs)-酶-免疫探针的制备

[0083] a.纳米银三角片的制备：40mL水溶液体系，包括400μL，0.01M硝酸银溶液，600μL，0.1M柠檬酸三钠溶液，96μL，30wt％H2O2室温下强力搅拌10min。然后，快速注入400μL，0.1M硼氢化钠溶液。

[0084] b.将200μL牛血清蛋白溶液(10mg/mL)加入到纳米银三角片胶体溶液中，混合均匀，静置过夜。

[0085] c.取8.2mL上述混合溶液，加入825μL，0.015M AA，再将10mL，0.08mM的HAuCl4以1mL/min的速度注射入，得到GCNPs粒子。

[0086] d.将1mL GCNPs粒子8000rpm离心10min，用含有0.001M碳酸钾的0.1mg/mL辣根过氧化物酶标记的抗体溶液重悬，4℃震荡3h，9000rpm离心15min，用0.5mL含有0.05mg/mL辣根过氧化物酶的酶标稀释液重悬，即得到GCNPs-酶-免疫探针。

[0087] 实施例2：赭曲霉毒素A(OTA)的检测

[0088] a.OTA包被抗原合成采用碳化二亚胺(CDI)法。OTA分子上的羧基，可以通过CDI活化后，偶联到蛋白分子上的赖氨酸氨基上。合成的主要步骤，1mg的OTA溶解于0.2mL无水二甲基亚砜中，加入2mg CDI，在室温下，磁力搅拌溶解后，避光继续反应10min；5mg的卵清蛋白(OVA)，溶解到1mL pH9.6的碳酸盐缓冲液中，磁力搅拌溶解。将活化好的OTA溶液，逐滴加入到OVA溶液中。加完后，继续磁力搅拌，避光室温反应4h。反应结束后，反应溶液在CBS溶液中透析3次，以除去未反应的OTA及其他小分子；最后一次透析液换成PB(磷酸盐缓冲液)。合成的包被抗原分装后，置于-20℃保存。

[0089] b.抗原的包被：以OTA与OVA的偶联物作为包被抗原，以0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原以1:2000～1:16000进行稀释，作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，37℃孵育2h，然后用0.001％分子量为6000的聚乙二醇PEG作为封闭液，4℃封闭过夜；

[0090] c.竞争反应：每孔分别加入以OTA标准品稀释液磷酸盐缓冲液PBS稀释的0.01ng/mL，0.02ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL系列浓度之一的小分子标准品或者处理好的样品50μL到各自的酶标孔中，将小分子抗体以酶标稀释液：含0.1％明胶，0.05％(v/v)吐温-20、pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液PBST，按1:8000～1:64000比例稀释后，加入酶标板中，每孔50μL，37℃孵育30min后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

[0091] d.加吸附了金银纳米复合材料的酶标二抗：以抗体稀释液将加吸附了金银纳米复合材料的酶标二抗以1:1～1:8稀释，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

[0092] e.显色：每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；最后每孔加入终止液2M硫酸溶液50μL；用酶标仪测量波长为450nm时的吸光值A450，与所作标准曲线对比算出待测样品中OTA的浓度。参阅图3a-图3b，本实施例中得到OTA检测的IC50为0.05ng/mL，比传统的ELISA方法检测的IC50 0.27ng/mL提高了5倍。

[0093] 实施例3：前列腺特异抗原(PSA)的检测

[0094] a.包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将PSA抗体稀释至蛋白质含量为1～20μg/ml,在酶标板的每孔中加入100μL，37℃孵育2h，PBST洗涤液洗涤3次。用0.1-5％的牛血清蛋白作为封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；

[0095] b.结合反应：每孔分别加入以标准品稀释液磷酸盐缓冲液PBS稀释的系列浓度之一的PSA标准品或处理好的样品100μL到各自的酶标孔中，置37℃孵育30min。PBST洗涤液洗涤3次。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)；

[0096] c.GCNPs-酶-免疫探针的结合：以抗体稀释液将GCNPs-酶-免疫探针以1:1～1:8稀释，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

[0097] d.显色：每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；最后每孔加入终止液2M硫酸溶液50μL；用酶标仪测量波长为450nm时的吸光值A450，建立A450与抗原量的关系。与所作标准曲线对比算出待测样品中PSA的浓度。参阅图4a-图4b，本实施例中得到PSA检测的IC50为2ng/mL，比传统的ELISA方法检测的IC50 0.1ng/mL提高了20倍。

[0098] 需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

[0099] 以上所述仅是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。