一种MAGE‑A9的用途

摘要

本发明公开了MAGE‑A9在制备用于治疗肺癌药物中的应用；所述MAGE‑A9是非小细胞肺癌基因治疗的一个靶点，所述的药物针对该靶点设计而成。本发明在体外环境的试验中研究下调MAGE‑A9基因表达对NSCLC细胞侵袭迁移等生物学行为的影响，发现特异性的siRNA序列可以有效抑制人非小细胞肺癌细胞株SPC‑A‑1和NCI‑H1975中MAGE‑A9蛋白的表达。RNA干扰抑制MAGE‑A9表达后，SPC‑A‑1和NCI‑H1975细胞的增殖减慢，凋亡增多，细胞迁移和侵袭能力降低，MAGE‑A9是非小细胞肺癌基因治疗的一个靶点，在制备用于治疗肺癌药物中将具有广泛的应用。

权利要求

1. MAGE-A9在制备用于治疗肺癌药物中的应用；所述MAGE-A9是非小细胞肺癌基因治疗的一个靶点，所述的药物针对该靶点设计而成。

说明书

一种MAGE-A9的用途

技术领域

[0001] 本发明属于癌症药物技术领域，具体涉及一种MAGE-A9的用途。

背景技术

[0002] 肺癌是最常见的癌症类型，同时也是全球首位癌症致死原因。肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC患者的预后主要取决于诊断时所处的阶段。尽管开展早期筛查，但大多数肺癌都在进展期被检查出，这些肺癌中约85％为NSCLC。虽然使用多种治疗手段，包括外科手术、放疗、化疗和生物治疗等，这些患者的预后仍然较差，5年生存率大约为10％，中位生存时间16到18个月。随着基因转移技术的发展，基因靶向治疗成为NSCLC治疗的新方法。因此，探寻新的生物分子标志物来预测NSCLC的进展，指导精准性的治疗，以改善患者生活质量，延长患者生命，是临床非常期待的。

[0003] 黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)基因是一组肿瘤相关抗原，首先从黑色素瘤中发现。该家族成员均含一段由约200个氨基酸组成的保守序列，称为MAGE同源结构域。在人类该基因包含37个蛋白编码基因，基于其不同的组织特异性和基因结构的差异，MAGE基因被分为MAGE-I(MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C)和MAGE-II(MAGE-D，MAGE-E，MAGE-F，MAGE-H，MAGE-L和NDN)两大亚组。MAGE-II几乎普遍表达在正常组织及肿瘤细胞中，MAGE-I被限制表达在少数正常组织中，如精母细胞、胎盘、以及在胚胎发育的某些阶段，在正常成人组织中则沉默或低表达，但在某些肿瘤中重新表达，因为这种特殊的表达模式，它们被归类为肿瘤睾丸抗原(cancer/testis antigen，CTAg)基因家族的成员，其潜在的免疫原性为其成为肿瘤治疗疫苗提供潜在的研究方向。MAGE蛋白的功能是未知的，但由于MAGE-I基因在除睾丸和胎盘以外的正常成人组织中不表达，并且在大量肿瘤性病变中表达，MAGE-I基因被认为是肿瘤特异性抗原和癌症免疫治疗的理想靶标。同时由于它们出现在MHC-II类分子表面，可被细胞毒性T淋巴细胞(cytotox T lymphocyte，CTL)识别，因此是CTL介导的特异性免疫治疗的理想靶分子。

[0004] MAGE-A是一个多基因家族，由位于染色体Xq28位点上的12个同源基因MAGE-A1到MAGE-A12组成，一些表达在肺癌上的MAGE-A基因已成为NSCLC免疫治疗的研究目标。MAGE-A9常表达于泌尿系肿瘤，可为肾癌和膀胱癌的预后提供参考，此外它也同样过表达于表皮T细胞淋巴瘤、食管腺癌、喉鳞状细胞癌和肝癌中。据现有文献所知，在非小细胞肺癌腺癌中MAGE-A9表达和它与临床病理参数之间的关系，以及MAGE-A9对肺癌侵袭迁移的影响尚未有研究。

发明内容

[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种MAGE-A9在制备用于治疗肺癌药物中的应用。

[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0007] MAGE-A9在制备用于治疗肺癌药物中的应用

[0008] 所述的用途中，所述MAGE-A9是非小细胞肺癌基因治疗的一个靶点，所述的药物针对该靶点设计而成。

[0009] 有益效果：与现有的技术相比，本发明采用组织芯片和免疫组化技术检测肺腺癌中MAGE-A9的表达情况，发现MAGE-A9蛋白的表达在肺腺癌组织中明显升高，肺腺癌组织中的MAGE-A9表达水平与肿瘤分化和直径大小有关，MAGE-A9在肺腺癌组织中高表达是肺腺癌预后差的独立预后因素。此外通过Western blot、CCK8法、Transwell小室等技术，在体外环境的试验中研究下调MAGE-A9基因表达对NSCLC细胞侵袭迁移等生物学行为的影响，发现特异性的siRNA序列可以有效抑制人非小细胞肺癌细胞株SPC-A-1和NCI-H1975中MAGE-A9蛋白的表达。RNA干扰抑制MAGE-A9表达后，SPC-A-1和NCI-H1975细胞的增殖减慢，凋亡增多，细胞迁移和侵袭能力降低，MAGE-A9是非小细胞肺癌基因治疗的一个靶点，在制备用于治疗肺癌药物中将具有广泛的应用。

附图说明

[0010] 图1是肺腺癌免疫组化照片图；A1 IHC染色阳性(EnVision法×40)，A2 IHC染色阳性(EnVision法×400)，癌旁组织B1 IHC染色阴性(EnVision法×40)，B2 IHC染色阴性(EnVision法×400)；

[0011] 图2是肺腺癌患者的五年生存曲线分析图，A：MAGE-A9高表达组比MAGE-A9低表达或不表达组生存率低；B：女性比男性总生存率高；C：无淋巴结转移的病例比有淋巴结转移的总生存率高；D：分化程度＝1代表高分化组，分化程度＝2代表中分化组，分化程度＝3代表低分化组，分化程度越高，患者的总生存率越高；

[0012] 图3是四种NSCLC细胞株MAGE-A9的表达结果图；

[0013] 图4是RNAi干扰后各组SPC-A-1细胞内MAGE-A9的表达结果图，(*P<0.05)；

[0014] 图5是各组细胞生长曲线图；A为MAGE-A9-siRNA-3干扰对SPC-A-1细胞增殖能力的影响，B为MAGE-A9-siRNA-3干扰对NCI-H1975细胞增殖能力的影响；

[0015] 图6是各组细胞迁移侵袭的能力结果图，(*P<0.05)；A为MAGE-A9-siRNA-3干扰对SPC-A-1、NCI-H1975细胞迁移能力的影响，B为MAGE-A9-siRNA-3干扰对SPC-A-1、NCI-H1975细胞侵袭能力的影响；

[0016] 图7是各组细胞侵袭能力的结果图(×400)。

具体实施方式

[0017] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

[0018] 以下实施例中使用的主要试剂为：二步法抗小鼠免疫组化检测试剂盒(MAGE-A9)：基因科技上海有限公司；鼠抗人MAGE-A9单克隆抗体：英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)(免疫组化试验用)：美国Dako公司；抗体稀释液：北京中山生物技术有限公司；0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)：北京中山生物技术有限公司；DAB：美国Sigma公司；二甲苯、中性树胶等由病理科提供。DAB工作液：DAB粉剂20mg溶解于50mL 0.01mol/L PBS中，再用定性滤纸过滤，保存在棕色瓶中(使用前配制)；根据需要加入由0.01mol/L PBS液配制的3％H2O2数滴帮助显色。人非小细胞肺癌腺癌细胞株A549、SPC-A-1、NCI-H1975、NCI-H1650购自中国科学院细胞库。RPMI-1640：美国Gibco公司；胎牛血清：美国HyClone公司；胰蛋白酶：美国Gibco公司；BCA蛋白测定试剂盒：美国Thermo公司；MAGE-A9抗体：美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(westernblot试验用)：美国Proteintech公司；ECL发光试剂盒：Beyotime公司；LipofectamineTM 2000：美国Invitrogen公司；CCK8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒：Beyotime公司。RPMI-1640完全培养液：分别加入RPMI-1640与胎牛血清混匀，使其终浓度分别为90％，10％，1×，4℃保存。细胞冻存液：将RPMI-1640完全培养液、胎牛血清和DMSO按5∶4∶1比例配制，4℃保存。1×TBST 1L：取Tris 
2.42g、NaCl 8.0g、Tween-20 0.5mL，混合溶解，定容至1L，常温保存。1×转膜Buffer 1L：甘氨酸14.4g、Tris 3.03g，加适量双蒸水搅拌溶解，再加200mL无水甲醇，定容至1L，混合均匀(用时配制)。封闭液100mL：取脱脂奶粉5g，加入100mL 1×TBST，混合溶解即可(需用时配制)。

[0019] 以下实施例中使用的主要仪器如下：组织芯片制作仪：美国Beecher Instruments公司；自动免疫组化染色仪(2D)：美国LAB VISION公司。倒置相差显微镜：日本Olympus公司；凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司；多功能酶标仪：美国Thermo公司；正置、倒置荧光显微镜：日本Olympus公司。

[0020] 实施例1

[0021] 取180例肺腺癌组织切片标本及相应94例癌旁组织切片标本，所有切片组织均取自南通大学附属医院心胸外科2004年1月～2009年12月住院手术治疗患者。所有患者术前均未经过放、化疗，临床数据(包括年龄、性别、分期、肿瘤大小、分化、淋巴结转移和远处转移)均有书面记录。上述180例病例具有完整病史及随访记录，随访截止日期为2014年5月，随访率100％。

[0022] 免疫组织化学法标本：上述肺腺癌组织180例，所有标本均经病理证实，肿瘤标本取自术中肿瘤切除的中心部位，相应癌旁组织94例，所有标本均来自南通大学附属医院病理科档案库。所有组织标本均常规10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，蜡块经筛选无明显缺陷，委托病理科制作成厚度为4mm厚的组织芯片五张，置于冰箱4℃冷藏室储存备用。

[0023] 1)组织芯片的制作

[0024] 180例肺腺癌组织标本和94例相应癌旁组织标本均用10％甲醛固定，石蜡包埋，蜡块经过筛选无明显缺陷。制作成组织芯片。主要流程为：1)根据HE染色切片的镜检结果，在蜡块上有代表性的癌巢区域作标记。2)1:1混合石蜡与蜂蜡，制作空白受体蜡块。在蜡块上设计10×7孔，共350点组织阵列，然后用组织芯片仪制成TMA空白蜡块。3)将供体蜡块在标记的点上选取最有代表性的癌巢区域，取直径2mm的组织块，每例各取1个芯。4)将取好的组织芯转移到受体蜡块的孔中，并取相应癌旁组织做对照。5)组织阵列块在55℃的恒温烤箱中加热融合10分钟，在快融化之前放至室温冷却，使受体蜡块与供体组织融为一体。6)将组织芯片置于4℃条件下冷冻4小时左右，随后用全自动组织切片机对组织阵列块进行修正，速度为20mm/转，等修到所有组织芯完全曝露。7)用切片机对组织阵列块进行切片，将连续切片分别漂在凉水中，使其自然展开，再将切片转移至45℃温水中展片2分钟左右，待展开后将其贴在经过防脱片处理的载玻片上晾干。8)将切片置于60℃的环境下烤片3分钟，58℃继续烤片16h。9)将做好的组织芯片保存于切片盒，置于冰箱4℃冷藏室备用。

[0025] 2)免疫组化染色(EnVision两步法)

[0026] (1)常规脱蜡水化：脱蜡前，将组织芯片放在60℃的恒温箱中，烘烤约20分钟。将已干燥的组织芯片浸于二甲苯中10分钟2次。取出后进行梯度酒精脱水，100％乙醇10分钟，95％乙醇10分钟，80％乙醇10分钟，70％乙醇10分钟，流水冲洗组织芯片。(2)将组织芯片置于耐高温切片架上，置于pH为6.0的柠檬酸盐缓冲液，高温抗原修复5分钟，自然冷却至室温后用PBS冲洗3次，每次5分钟。(3)取出蒸馏水中的芯片，滴加30％H2O2避光孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，再将芯片置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，总共3次，然后取出甩干。(4)滴加200μL的鼠抗人MAGE-A9单克隆抗体工作液(稀释比例为1:50)于组织芯片上，在4℃条件下过夜。(5)第二天，取出组织芯片，复温1小时，后置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，之后取出甩干。(6)在组织芯片上滴加200μl的二抗工作液，于室温孵育
30分钟，将组织芯片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，之后取出甩干。(7)滴加准备好的显色剂DAB工作液，光镜下控制显色程度，显色完全后，立即用蒸馏水冲洗，终止显色。(8)室温下用苏木素复染2分钟，用蒸馏水流水震洗后甩干。(9)芯片脱水，透明，封片。(10)光镜下观察免疫组化染色结果，细胞相应部位出现棕黄色作为阳性表现。

[0027] 结果判断：免疫组化结果判断采用双盲法，由两位经验丰富的病理科医师对组织芯片上的染色结果进行独立评价。根据染色阳性的肿瘤细胞数目所占百分比计为0-100％，染色强度按肿瘤细胞着色的深浅计分：无着色为0分，黄色计1分，浅棕色计2分，棕褐色计3分。MAGE-A9的最终染色得分为染色强度与阳性细胞染色面积的乘积。MAGE-A9表达分数的分界点由X-tile软件得出。评分如下：0-100为低表达或无表达，101-300为高表达。

[0028] 所有数据均用统计软件SPSS V.20.0和STATA V.9.0处理，计量资料以均数±标准差( )表示，组间比较采用单因素方差分析，有统计学意义的各临床病理参数间用Cox比例风险回归模型进行多因素分析，MAGE-A9表达与NSCLC患者的预后关系分析用Kaplan-Meier生存分析，所有检验结果P<0.05为差异有统计学意义。

[0029] 180例肺腺癌组织切片标本行免疫组化染色，MAGE-A9蛋白阳性表达于腺癌组织的细胞质和细胞核中，呈棕黄色，而大部分癌旁组织无表达，见免疫组化照片(图1)。免疫组化染色结果显示180例肺腺癌组织MAGE-A9蛋白表达阳性率为42.78％(77/180)，癌旁组织表达阳性率22.34％(21/94)，两者比较差异显著，有统计学意义(P＝0.001)(表1)。

[0030] 表1肺腺癌组织及癌旁组织中MAGE-A9蛋白的表达

[0031]

[0032] *P<0.05。

[0033] MAGE-A9在肺腺癌中的阳性表达与肿瘤分化(χ2＝4.759，P＝0.029)、直径大小(χ2＝6.205，P＝0.013)有关，而与年龄、性别、淋巴结转移和TNM分期无关(表2)。

[0034] 表2MAGE-A9的表达与肺腺癌患者临床病理参数的关系

[0035]

[0036]

[0037] *P<0.05。

[0038] 用Log-rank检验行单因素分析，显示肿瘤细胞中MAGE-A9表达率(P<0.001)，性别(P＝0.002)，肿瘤直径(P＝0.001)，分化程度(P＝0.001)，淋巴结转移(P＝0.002)，TNM分期(P＝0.001)与肺腺癌预后相关。将上述因子纳入COX比例风险模型多因素分析，显示MAGE-A9在肺腺癌组织中高表达(P<0.001)、男性(P＝0.007)、分化差(P＝0.001)和淋巴结转移(P＝0.037)是肺腺癌预后差的独立预后因素(表3)。Kaplan-Meier生存曲线显示MAGE-A9表达阳性组比阴性组五年生存率低(图2)。

[0039] 表3肺腺癌预后的单因素和多因素分析

[0040]

[0041]

[0042] *P<0.05。

[0043] 可见，MAGE-A9蛋白的表达在肺腺癌组织中明显升高。肺腺癌组织中的MAGE-A9表达水平与肿瘤分化和直径大小有关。MAGE-A9在肺腺癌组织中高表达是肺腺癌预后差的独立预后因素。

[0044] 实施例2

[0045] 1)siRNA设计

[0046] 针对人MAGE-A9的三段不同的SiRNA序列及阴性对照siRNA(negative control，NC)由上海Invitrogen公司设计并完成，序列如下：

[0047] MAGE-A9#1：正义链：5’-GGUGGCUGAGUUGGUUCAUTT-3’；

[0048] 反义链：5’-AUGAACCAACUCAGCCACCTT-3’；

[0049] MAGE-A9#2：正义链：5’-GCAAAGCCUCCGAGUUCAUTT-3’；

[0050] 反义链：5’-AUGAACUCGGAGGCUUUGCTT-3’；

[0051] MAGE-A9#3：正义链：5’-CCAGCUAUGAGAAGGUCAUTT-3’；

[0052] 反义链：5’-AUGACCUUCUCAUAGCUGGTT-3’。

[0053] 2)细胞复苏：

[0054] (1)从-80℃超低温冰箱中取出A549、SPC-A-1、NCI-H1975、NCI-H1650细胞的冻存管，放到37℃水浴箱中快速摇动，使细胞在1min内完全解冻。(2)取出冻存管，用酒精消毒后，放入超净台。(3)吸取细胞悬液至15mL的离心管中，添加10mL RPMI-1640培养液，混合均匀，1000rpm离心5min。(4)吸去上清液，取2mL含10％胎牛血清的培养液混匀细胞，加到细胞培养瓶中，再添加适量培养液，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，次日更换一次培养液，继续培养。

[0055] 3)细胞传代培养：

[0056] (1)紫外灯消毒超净台30分钟，将所需液体提前拿出，待温度升至室温后酒精消毒瓶口放入超净台，打开酒精灯。(2)将长满细胞的培养瓶中的旧培养液弃去，PBS冲洗一遍，加入1mL含0.02％EDTA+0.25％胰酶消化液，消化3～5分钟，显微镜下观察细胞状态，当细胞变圆，间隙变大时，加入5mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化，用吸管反复吹打瓶底。(3)将吹散的细胞悬液分装至新的培养瓶，再加入适量培养液，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中继续培养。

[0057] 4)细胞计数法：

[0058] (1)将细胞消化后，制备成细胞悬液，用酒精棉球将盖玻片擦干净，放到细胞计数板上。(2)吹打细胞悬液使其混匀，取10μl轻轻注入盖玻片和计数板的交界处。(3)在显微镜下读取计数板四角大方格的细胞数，细胞压到线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方。(4)计算：细胞密度(个/mL)＝(4大格细胞数之和/4)×104

[0059] 5)细胞冻存：

[0060] (1)选择对数生长期的细胞，冻存前24h换液。(2)常规消化细胞，制备成细胞悬液，离心1000r/min，5min。(3)吸去上清，加入冻存液，冻存液中细胞的终密度为5×106/mL，轻轻吹打混匀。(4)将细胞悬液分装到无菌的冻存管中，每管1mL。(5)将冻存管封好，标明细胞名称、冻存时间等信息。(6)冻存：4℃放置30min，-20℃放置30min，置于-80℃冰箱中，可保存3个月左右，如长期保存需放入液氮罐。

[0061] 6)A549、SPC-A-1、NCI-H1975、NCI-H1650四种NSCLC细胞的培养：

[0062] (1)按上述复苏方法从-80℃冰箱取出四种NSCLC细胞，37℃快速解冻，吸出细胞悬液，用RPMI-1640培养液漂洗后，低速离心，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液混匀细胞，移入25cm2培养瓶中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。(2)次日更换细胞培养液，继续培养待细胞生长达90％融合后，细胞传代培养。(3)经过几次传代后部分细胞可冻存，部分细胞继续培养，准备试验用。

[0063] 7)Western blot筛选MAGE-A9高表达NSCLC细胞株

[0064] 蛋白质提取：(1)取出六孔板，吸去培养液，用预冷的PBS洗细胞两遍。(2)加预冷的细胞裂解液150μl/孔，冰上静置20min，震荡5min。(3)4℃离心，12000rpm，15min，取上清移至新的EP管。(4)测蛋白质浓度。(5)将提取的蛋白质保存于-70℃，或按4∶1的比例将提取的蛋白质与5×SDS page loading buffer混合，迅速混匀，100℃煮沸5min，保存于-20℃。

[0065] SDS-PAGE电泳：(1)将两片干净的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，准备灌胶。(2)先将12％的分离胶用1mL枪沿两玻璃间隙灌胶，先快后慢，避免产生气泡，注胶至距上缘约1.5cm处，在胶上缓慢加一层水。放置30分钟左右至聚合完全，水和胶之间可见明显折线，倒掉上层的水，剩余空间灌满5％浓缩胶，并插上梳子。约半小时聚合，拔掉梳子，准备上样。(3)每孔上样约为15～20μl，其中一孔加入预染蛋白质Marker。(4)电泳：起始电压80V，约40min，待溴酚蓝进入分离胶，电压改为100V，约90min，当溴酚蓝接近分离胶底部时停止电泳。

[0066] 转膜：(1)电转移垫和滤纸用转移缓冲液浸湿，PVDF膜在甲醇中浸10s。(2)从玻璃板上小心取下凝胶，去除所有浓缩胶，将凝胶放在转移缓冲液中浸泡。(3)组装电转移装置，由负极到正极，依次放入3层电转移垫、1层滤纸、凝胶、PVDF膜、1层滤纸、3层电转移垫，PVDF膜接正极、凝胶接负极，用玻璃棒赶出气泡，放入电转仪，加盖电极和绝缘盖板，300mA，2h。

[0067] 膜的封闭、标记抗体及显影、曝光：(1)取出PVDF膜，放入含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中，在摇床上室温孵育2h。(2)取出PVDF膜，TBST液洗4遍，每次5min，边洗边摇。(3)加一抗，按1∶100的比例将一抗(MAGE-A9抗体)和封闭液混匀，将膜置入此液体中，4℃过夜(20小时左右)。(4)取出PVDF膜，TBST液洗4遍，每次5min，边洗边摇。(5)加二抗，按1∶2000的比例将二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L))和封闭液混匀，将膜置入此液体中，室温孵育2h。(6)取出PVDF膜，TBST液洗4遍，每次5min，边洗边摇。(7)按照化学发光试剂盒说明书，将A、B液等体积混合，滤纸吸干PVDF膜，将膜正面朝上放在塑料薄膜上，在膜上滴加配好的A、B混合液，凝胶成像系统拍照、保存。

[0068] A549、SPC-A-1、NCI-H1975、NCI-H1650四种NSCLC细胞的筛选：(1)按上述方法分别提取四种NSCLC细胞的蛋白。(2)用Western blot检测四种NSCLC细胞中MAGE-A9的表达情况。(3)筛选出高表达的两株细胞。

[0069] Western blot检测A549、SPC-A-1、NCI-H1975、NCI-H1650四种非小细胞肺癌细胞中MAGE-A9的表达情况，结果显示SPC-A-1和NCI-H1975比A549和NCI-H1650表达高(图3)。

[0070] 8)LipofectamineTM 2000转染siRNA

[0071] 转染效率的判定：(1)转染前一天，取对数生长期的SPC-A-1细胞，按4-5×104/孔的密度接种在六孔培养板上，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。(2)37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，24h内SPC-A-1细胞融合率达到约70％。(3)以250μl RPMI-1640稀释5μl LipofectamineTM 2000，轻轻混匀。(4)以250μL RPMI-1640分别稀释0μL、2.5μL、6.25μL、10μL、12.5μL的N.C.FAM，轻轻混匀。(5)室温孵育5min后，混合稀释的siRNA和稀释的LipofectamineTM 2000，轻轻混合均匀，在室温下孵育20min，以便允许复合物siRNA-LipofectamineTM 2000的形成。(6)6孔板内培养液弃去，PBS洗涤细胞两遍，将混匀的复合物加入到每个包含细胞的孔中，轻轻前后摇动培养板混合，使其充分混匀，每孔加2mL RPMI-1640，放入培养箱。(7)6小时后换液，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。(8)24小时后加DAPI，每孔加0.1mL。染色2分钟，然后用PBS洗涤细胞三次，去除残余荧光，弃上清，然后置于倒置荧光显微镜下观察、拍照，得出siRNA转染最佳效率所需要的浓度。整个过程用锡箔纸包裹，注意避光。

[0072] 转染后24小时将FAM标记的siRNA组细胞置于光学显微镜和倒置荧光显微镜下观察，转染成功的细胞内可看见绿色的荧光，根据绿色荧光的细胞数量来判定FAM标记的siRNA转染的效率。不同浓度的FAM标记的siRNA对转染率有一定影响，根据RNA干扰实验的设计原则，要求尽可能使转染率相对较高，而siRNA浓度相对较低。实验结果显示，12.5μlN.C.FAM组的转染率最高，大约为80％，可以用于进行后续的实验检测。

[0073] siRNA转染SPC-A-1细胞：(1)实验分组：MAGE-A9-siRNA-1组，MAGE-A9-siRNA-2组，MAGE-A9-siRNA-3组，阴性对照组和空白对照组。(2)转染前一天，取对数生长期的SPC-A-1细胞按4-5×104/孔的密度接种在六孔培养板上，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。(3)37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，24h内SPC-A-1细胞融合率达到约70％。(4)DEPC水稀释siRNA，1OD加DEPC水125μL。(5)以250μL RPMI-1640稀释5μl LipofectamineTM 2000，轻轻混匀。(6)以250μL RPMI-1640稀释12.5μL siRNA，轻轻混匀。(7)室温孵育5min后，混合稀释的siRNA和稀释的LipofectamineTM 2000，轻轻混合，在室温下孵育20min，以便允许复合物siRNA-LipofectamineTM 2000的形成。(8)6孔板内培养液弃去，PBS洗涤细胞两遍，将混匀的复合物加入到每个包含细胞的孔中，轻轻前后摇动培养板混合，使其充分混匀，每孔加2mL RPMI-1640，放入培养箱。(9)6小时后换液，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-
1640培养基，37℃、5％CO2培养48小时，至细胞生长到孔板面积约80-90％时收取细胞，进行下一步Western blot检测。

[0074] Western blot筛选转染效率最高的一组siRNA：(1)按上述方法分别提取MAGE-A9-siRNA-1组，MAGE-A9-siRNA-2组，MAGE-A9-siRNA-3组，阴性对照组和空白对照组五组细胞的蛋白。(2)用Western blot检测五组细胞中MAGE-A9的表达情况。(3)筛选出转染效率最高的一组siRNA序列用于后续的细胞生物学检测。

[0075] Western blot法检测三段不同的siRNA序列对SPC-A-1细胞MAGE-A9表达情况的干扰效率，结果显示，MAGE-A9-siRNA-3在转染后48小时对SPC-A-1细胞的干扰效率最佳，以此作为后续研究的干扰序列(图4)。

[0076] 9)CCK8法观察细胞增殖

[0077] (1)实验分三组：未转染组、转染NC-siRNA组、转染MAGE-A9-siRNA组，每组设3个复孔。(2)取培养至对数生长期细胞，常规消化，重悬细胞，调整细胞浓度为3×104/mL，按100μL/孔接种于96孔板中，铺2块板，每块板每组细胞设3个复孔，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。(3)待细胞贴壁后，使用脂质体LipofectamineTM 2000介导转染(转染步骤同上)，取转染后3h时换液时间为CCK8实验0h，分别检测24h、48h、72h、96h四个时间段细胞增殖情况。(4)先吸尽孔内液体，每孔加入90μl RPMI-1640和10μl CCK8液，37℃、5％CO2培养3小时，多功能酶标仪测定各孔A450值。(5)以三组细胞在不同检测时间点(24h、48h、72h、96h)的A450值绘制细胞生长曲线。

[0078] 瞬时转染48小时后，转染MAGE-A9-siRNA-3组的细胞与未转染组、转染NC-siRNA组相比出现明显生长抑制(P<0.05)，结果显示MAGE-A9-siRNA-3可降低SPC-A-1和NCI-H1975细胞的增殖能力(图5)。

[0079] 10)Transwell观察细胞迁移能力

[0080] (1)实验分三组：未转染组、转染NC-siRNA组、转染MAGE-A9-siRNA组，每组设3个复5
孔。(2)取培养至对数生长期细胞，常规消化，重悬细胞，以2.5×10 /孔接种于六孔板上，待细胞融合达70％～90％时使用脂质体LipofectamineTM 2000介导转染(转染步骤同上)。(3)转染48h后，常规消化，用RPMI-1640培养液重悬各组细胞，以200μl接种于Transwell小室的上室，下室为含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液600μl，37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。
(4)孵育结束后，取出小室，PBS洗两遍，用棉签轻轻拭去上室滤膜内侧面贴壁细胞，PBS洗两遍。(5)将滤膜用4％多聚甲醛固定10分钟，吸去固定液，将膜风干，每孔加入500μl考马斯亮蓝染液，室温置放30min，除去染色液，PBS洗两遍，将上室取出，自然干燥。(6)正置荧光显微镜下计数膜背面迁移的细胞数，计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野，实验重复三次，计算平均值。

[0081] 11)Transwell观察细胞侵袭能力

[0082] (1)实验分三组：未转染组、转染NC-siRNA组、转染MAGE-A9-siRNA组，每组设3个复孔。(2)取培养至对数生长期细胞，常规消化，重悬细胞，以2.5×105/孔接种于六孔板上，待细胞融合达70％～90％时使用脂质体LipofectamineTM 2000介导转染(转染步骤同上)。(3)取Transwell小室，上室面覆以Matrigel胶(Matrigel胶：RPMI-1640培养基＝1：4)50μl/孔，将小室放入24孔板，使用前37℃孵育1h。(4)转染48h后，常规消化，重悬各组细胞，以200μl/孔接种于覆盖Matrigel胶的小室内，下室为含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液600μl，37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。(5)孵育结束后，取出小室，PBS洗两遍，用棉签轻轻拭去上室滤膜内侧面贴壁细胞，PBS洗两遍。(6)将滤膜用4％多聚甲醛固定10分钟，吸去固定液，将膜风干，每孔加入500μl考马斯亮蓝染液，室温置放30min，除去染色液，PBS洗两遍，将上室取出，自然干燥。(7)正置荧光显微镜下计数膜背面迁移的细胞数，计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野，实验重复三次，计算平均值。

[0083] 瞬时转染48h后的各组细胞，通过计数穿过Transwell小孔细胞数目比较迁移和侵袭能力，转染MAGE-A9-siRNA-3组的细胞与未转染组、转染NC-siRNA组相比迁移和侵袭能力受到抑制(P<0.05)(图6，图7)。

[0084] 以上所有数据均用统计软件SPSS V.20.0和STATA V.9.0处理，计量资料以均数±标准差( )表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

[0085] 可见，特异性的siRNA序列可以有效抑制人非小细胞肺癌细胞株SPC-A-1和NCI-H1975中MAGE-A9蛋白的表达。RNA干扰抑制MAGE-A9表达后，SPC-A-1和NCI-H1975细胞的增殖减慢，凋亡增多，细胞迁移和侵袭能力降低，MAGE-A9是非小细胞肺癌基因治疗的一个靶点。