一种植物源抑藻剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种植物源抑藻剂及其制备方法，所述的抑藻剂为发酵后的银杏叶乳酸浸提液。其制备方法：将刚从银杏树上摘下的银杏叶用厚的黑色的塑料袋密封，并于25‑35度自然发酵10‑15天，然后在40‑50度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用浓度为大于99％的乳酸浸提3‑5天，干粉与乳酸的质量、体积比为1g:10‑15ml，即可。本发明与现有技术相比，对环境无害，不会造成二次污染。本发明中的抑藻剂原料来自植物银杏以及可作为食品添加剂的乳酸，生态安全性好。

权利要求

1.一种植物源抑藻剂，其特征在于：所述的抑藻剂为银杏叶乳酸浸提液；

所述的银杏叶乳酸浸提液，通过以下方法制备：将刚从银杏树上摘下的银杏叶用黑色的塑料袋包住，并于25-35度自然发酵10-15天，然后在40-50度烘干至恒重，再研磨成大于

80目的干粉，取研磨好的干粉用浓度为大于99％的乳酸浸提3-5天，干粉与乳酸的质量、体积比为1g:10-15ml，即可。

2.根据权利要求1所述的一种植物源抑藻剂，其特征在于：所述的藻为铜绿微囊藻。

3.根据权利要求2所述的一种植物源抑藻剂，其特征在于：所述的藻密度为1-9*106个/毫升。

说明书

一种植物源抑藻剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于抑藻剂及其制备方法，特别属于植物源抑藻剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 随着社会、经济的快速发展，各种污染物的排放也日益加重，这使得水体富营养化日趋严重，水华频繁爆发严重影响了生态平衡，使我国的水质性缺水现象日渐加剧。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是形成水华的蓝藻优势种群之一，具有极强的生态学竞争优势，至今其迅速繁殖依然是全球性的问题，而且其产生的微囊藻毒素危害极大，所以探索发现一种高效的，经济的，生态风险小的抑藻方法是当前治理的突破点。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题第1个是提供一种生态安全性好，不会造成二次污染的用于铜绿微囊藻的植物源抑藻剂。

[0004] 本发明所要解决的技术问题第2个是上述植物源抑藻剂的制备方法。

[0005] 本发明解决技术问题的技术方案为：一种植物源抑藻剂，所述的抑藻剂为发酵后的银杏叶乳酸浸提液。

[0006] 所述的发酵后的银杏叶乳酸浸提液，通过以下方法制备：将刚从银杏树上摘下的银杏叶用厚的黑色的塑料袋密封，并于25-35度自然发酵10-15天，然后在40-50度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用浓度为大于99％的乳酸浸提3-5天，干粉与乳酸的质量、体积比为1g:10-15ml，即可。

[0007] 所述的藻为铜绿微囊藻。

[0008] 所述的藻密度为1-9*106个/毫升。

[0009] 乳酸(2-羟基丙酸)是一种天然的有机酸，由于在食品(防腐剂，风味剂等)、化妆品、医药及化工产业有重要的应用而得到广泛的关注。银杏(Ginkgo biloba L.)，又名白果树；落叶乔木，叶片成扇。其一身是宝，叶、皮、根、果皆能入药，具有很高的食用价值、药用价值、经济价值、生态价值和观赏价值。

[0010] 银杏现已广泛种植原材料易得，乳酸则可通过价格低廉且资源丰富的生物质原料如玉米秸秆、小麦秸秆以及稻秆等进行生物发酵获得，不需要化工合成，能耗小，经济效益高。而且其中的乳酸具有防腐的功能，可利于在较长时间保存。

[0011] 本发明与现有技术相比，现在一般的抑藻剂都是化学杀藻剂，对环境有害，会造成二次污染。本发明中的抑藻剂原料来自植物银杏以及可作为食品添加剂的乳酸，生态安全性好。

具体实施方式

[0012] 下面结合实施例对本发明作详细的说明。

[0013] 本发明中所用藻种铜绿微囊藻(FACHB-942)购于中国科学院武汉水生生物研究所，使用BG-11培养基培养。培养条件：温度25℃，光照强度4000lx，光暗周期为12h：12h，扩大培养一周，使铜绿微囊藻达到对数生长期，用BG-11培养基稀释成初始藻密度为3.6×106个/mL，通常的试验用基数为105个/mL的初始藻密度，由于该抑藻剂效果较好，所以初始密度相应的设置成106个/mL。

[0014] 乳酸，食品级发酵乳酸，浓度为99％，由上海国药集团公司生产。

[0015] 银杏叶，采于安徽师范大学校园内。

[0016] 实施例1：

[0017] 将新鲜的银杏叶用厚的黑色的塑料袋密封，于25-35度自然发酵15天，然后在40度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用浓度为99％的乳酸浸提5天，干粉与乳酸的质量、体积比为1g:10ml，即可。

[0018] 实施例2：

[0019] 将新鲜的银杏叶用厚的黑色的塑料袋密封，于25-35度自然发酵15天，然后在45度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用浓度为99％的乳酸浸提4天，干粉与乳酸的质量、体积比为1g:12ml，即可。

[0020] 实施例3：

[0021] 将新鲜的银杏叶用厚的黑色的塑料袋密封，于25-35度自然发酵15天，然后在50度烘干至恒重，再研磨成大于80目的干粉，取研磨好的干粉用浓度为99％的乳酸浸提3天，干粉与乳酸的质量、体积比为1g:15ml，即可。

[0022] 实施例4

[0023] 4.1细胞密度

[0024] 在初始藻密度为3.6×106cells/mL铜绿微囊藻藻液中，分别加入实施例1所制的浸提液及乳酸，设置3个浓度梯度，浓度分别是30ul/L，60ul/L，120ul/L，分别于24h，48h，72h，96h用血球计数板对藻细胞进行计数。用SPSS 21.0软件对相关数据进行处理，分析各实验组的差异显著性，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著性差异。

[0025] 表1：

[0026]

[0027] 表2

[0028]

[0029] 注：*与同期对照组相比，P<0.05；**与同期对照组相比，P<0.01。

[0030] 如表1所示，在24小时内3个浓度都有很好的抑藻效果，且从随后的几天可以看出不同浓度之间差异不是非常明显，且与同期对照相比，均有极显著差异(p<0.01)，说明发酵后的银杏叶乳酸浸提液在较低浓度时抑藻效果已经很明显。

[0031] 如表2中所示：乳酸的30ul/L以及60ul/L在24小时内,与同期对照相比，对铜绿微囊藻的影响不大且30ul/L在随后的几天效果都不是很明显；而60ul/L在48小时后效果明显，与同期对照相比有显著性差异(p<0.05)且在96小时后有极显著差异(p<0.01)；120ul/L则在24小时内，与同期对照相比，效果就明显，有显著性差异(p<0.05)且在72小时后有极其显著性差异(p<0.01)说明乳酸在较高浓度时抑藻效果才比较明显。

[0032] 4.2抑制率

[0033] 铜绿微囊藻抑制率的计算公式为：

[0034]

[0035] 其中：IR—抑制率，N—实验组藻细胞数，N0—对照组藻细胞数。

[0036] 表3：

[0037]

[0038] 表4

[0039]

[0040] 如表3所示：在24小时内3个浓度抑制率都达到40％以上，且从随后的几天可以看出不同浓度之间差异不是非常明显，说明发酵后的银杏叶乳酸浸提液在较低浓度时以及较短时间内抑藻效果已经很明显。

[0041] 如表4所示：在30ul/L以及60ul/L在24小时内对铜绿微囊藻的抑制率都在20％以下，且3ul/100ml在随后的几天抑制率都在20％左右总体效果不明显而60ul/L在48小时后都达到50％以上，120ul/L则在24小时就已经达到40％以上，96h已经接近100％，说明乳酸在较高浓度时抑藻效果才比较明显。

[0042] 实施例5：

[0043] 在初始铜绿微囊藻藻密度为4.3×106cells/mL，加入实施例1所制的浸提液，根据抑藻效果，设置5个浓度梯度，浸提液的浓度分别是：0，10ul/L，20ul/L，40ul/L，80ul/L，分别于加样后的24h、72h、120h取10～12ml藻液离心(4000r/min,10min),分离上清液与沉淀，称量离心管与沉淀的总质量(实验前将离心管称重并记录数据)，上清液用于测定电导率、OD280，沉淀用1ml 0.15mol/L的PBS(pH7.0)溶解后在-80℃冰箱中反复冻融三次，然后用冷冻离心机离心(4℃，12000r/mim,15min)，留上清，用于测定膜脂过氧化物丙二醛MDA的含量。用SPSS 21.0软件对相关数据进行处理，分析各实验组的差异显著性，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著性差异。

[0044] 5.1浸提液对铜绿微囊藻藻液电导率的影响。

[0045] 表5：

[0046]

[0047] 由于离子的导电性，故以电导率表示藻液中离子浓度大小。如表5所示：处理后的实验组的铜绿微囊藻藻液中电导率相比对照组都有不同程度的增加，20ul/L在72小时与同期对照相比有显著性差异(p<0.05)，在40ul/L和80ul/L两个高浓度的实验组在24小时内已经有显著性差异(p<0.05),这表明浸提液使藻细胞膜的通透性增加，致使藻细胞内的离子外渗。

[0048] 5.2浸提液对铜绿微囊藻藻液蛋白质含量的影响。

[0049] 表6：

[0050]

[0051] *与同期对照组相比，P<0.05；**与同期对照组相比，P<0.01。

[0052] 由于蛋白质在OD280具有最大光吸收，故以OD280表示藻液中可溶性蛋白质含量。如表6所示：处理后的实验组的铜绿微囊藻藻液中蛋白质的含量相比对照组都有不同程度的增加，20ul/L在120h时有显著性差异(p<0.05)，40ul/L在24h时就有显著性差异(p<0.05)，80ul/L则有极显著差异(p<0.01)。这同样说明，由于受到浸提液的胁迫作用，藻细胞膜通透性改变，导致细胞内的蛋白外渗，且胁迫作用时间延长，蛋白的外渗量增加。

[0053] 5.3浸提液对铜绿微囊藻膜脂过氧化物MDA含量的影响。

[0054] 表7：

[0055]

[0056] *与同期对照组相比，P<0.05；**与同期对照组相比，P<0.01。

[0057] MDA(丙二醛)是藻细胞膜脂过氧化的产物，通过测定MDA含量的积累量可以反映藻细胞在受到外界不利条件作用下细胞受损伤的程度。如表7所示：实验组藻细胞中的MDA含量相比对照组而呈现不同程度的上升，且浸提液作用时间越长，细胞内的MDA积累量也随着增加，40ul/L在24h时就有极显著性差异(p<0.01)，80ul/L则有显著性差异(p<0.05),这表明浸提液使铜绿微囊藻的膜脂过氧化程度提高，加剧了对细胞膜的损伤。

[0058] 终上所述，这些指标均可反映细胞膜受到损伤，从而导致细胞最终的破裂死亡，达到抑藻的效果。