一种土壤漆酶活力的测定方法转让专利
申请号 : CN201510614584.6
文献号 : CN105200118B
文献日 : 2018-04-13
发明人 : 苏宝玲 , 王月阳 , 白震 , 范业展 , 唐强
申请人 : 沈阳大学
摘要 :
一种用于测定土壤漆酶活力的方法，涉及土壤漆酶活力测定方法，该方法包括如下步骤：1、利用灭菌的0.9%NaCl浸提新鲜土样；2、于96微孔板上，以2,2'‑联氮双二铵盐（ABTS）为底物，底物工作浓度为20‑30mM；3、吸光值测定时间，每5‑10分钟测定吸光值1次，1‑5小时时间段，20‑30分钟测定吸光值1次；4、利用一级动力学方程，拟合漆酶产物生成过程，并确定漆酶产物最大生成量时吸光值，以及生成相应的最大产物量的平均合成时间；5、计算漆酶活力。此法排除传统线性方程计算漆酶活力时，初始浓度时间段选取时的主观臆测，以及最大产物生成量难以确定的不足。本发明有利于土壤漆酶活力测定方法的统一和标准化。
权利要求 :
1.一种土壤漆酶活力的测定方法，其特征在于，所述方法利用一级动力学模型，确定漆酶底物利用最大潜势和最大产物合成的平均时间，并以此为基础计算漆酶活力；利用酶产物合成动力学特征参数，从而使得漆酶活力测定过程更为标准化；包括以下过程：（1）无菌生理盐水浸提新鲜土壤样品，水土比10:1，重量比；
（2）ABTS为底物，其工作浓度为20-30mM；
（3）以96孔板为底物－酶液检测载体，以酶标仪测定产物吸光值；
（4）于不同底物－酶反应时间测定漆酶产物的吸光值；
（5）利用非线性回归模型，计算漆酶产物的最大合成潜势，以及相应的平均合成时间；
所述最大合成潜势的计算：漆酶产物合成符合一级动力学方程，即ODt=ODMAX×[1-exp(-k×t)]，其中，ODt为时间t时的酶产物吸光值，ODMax为生成产物最大理论吸光值，t为酶—底物反应时间，k为产物生成速率常数，1/k即为得到的平均反应时间MPT；
（6）利用上述最大产物合成潜势和平均合成时间，计算土壤漆酶活力；
所述漆酶活力的计算：酶活力(U/L)=(106/ξ420)×(V总/V酶)×(ODMax/MPT)，其中酶V总和V酶代表反应体系的总体积和经过适当稀释后的反应酶液体积，ODMax代表在MPT时间内吸光值的变化。
2.根据权利要求1所述的一种土壤漆酶活力的测定方法，其特征在于，所述ABTS底物，
20-30mMABTS为最适底物浓度，通过设立一系列底物浓度，即1,2,3,5,8,12,20,30和
50mMABTS底物，明确20-30mMABTS浓度条件下，漆酶产物的吸光值随培养时间而持续增加，且不受土壤环境因子的抑制。
3.根据权利要求1所述的一种土壤漆酶活力的测定方法，其特征在于，所述测定产物吸光值，0-6小时持续测定吸光值，由于漆酶—底物反应过程符合一级动力学特征而非直线方程，即产物合成会经历初始快速合成、吸光值迅速升高，而中期缓慢、后期停滞的动力学特征；因此，选取如下时间点测定漆酶产物的光吸收值：底物—酶液混合前1小时内，5-10分钟间隔测定产物吸光值，中、后期20-30分钟间隔测定吸光值。
4.根据权利要求1所述的一种土壤漆酶活力的测定方法，其特征在于，所述方法通过一级动力学方程拟合漆酶产物动力学过程，并将酶活力与动力学参数计算相结合，进而确定特定森林土壤条件下漆酶对底物利用的最大活力，以及形成最大产物合成的时间尺度，从而避免传统方法中对漆酶酶活力测定的时间点与最大产物生成量的主观臆断。
说明书 :
一种土壤漆酶活力的测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及土壤漆酶活力测定方法，尤其涉及一种用于森林土壤漆酶活力的标准化测定方法。
背景技术
[0002] 漆酶（Laccase），属EC 1.10.3.2（对苯二酚氧化酶），其活性中心含多个铜原子，参与木质（纤维）素解聚并氧化腐殖质等分子，可被酚类物质诱导合成，漆酶广布于真菌（如白腐或褐腐担子菌、软腐子囊菌）、细菌和古菌。多酚类聚合物是凋落物分解的瓶颈，而漆酶是将木质素氧化为酚氧自由基的关键酶。因此，漆酶在森林生态系统碳氮循环过程中是极为关键的蛋白酶。
[0003] 然而，漆酶的测定方法目前仍无令人信服的标准化流程。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种土壤漆酶活力的测定方法，该方法旨在通过一级动力学方程，明确土壤漆酶对底物利用的最大的潜势和产物形成的最大平均时间，并藉此计算漆酶活力，有利于土壤漆酶活力测定方法的统一化和标准化。
[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0006] 一种土壤漆酶活力的测定方法，所述方法利用一级动力学模型，确定漆酶底物利用最大潜势和最大产物合成的平均时间，并以此为基础计算漆酶活力；利用酶产物合成动力学特征参数，从而使得漆酶活力测定过程更为标准化；包括以下过程：
[0007] （1）无菌生理盐水浸提新鲜土壤样品，水土比10:1，重量比；
[0008] （2）ABTS为底物，其工作浓度为20-30mM；
[0009] （3）以96孔板为底物－酶液检测载体，以酶标仪测定产物吸光值；
[0010] （4）于不同底物－酶反应时间测定漆酶产物的吸光值；
[0011] （5）利用非线性回归模型，计算漆酶产物的最大合成潜势，以及相应的平均合成时间；
[0012] （6）利用上述最大产物合成潜势和平均合成时间，计算土壤漆酶活力。
[0013] 所述的一种土壤漆酶活力的测定方法，所述M ABTS底物，20-30mM ABTS为最适底物浓度，通过设立一系列底物浓度，即1, 2, 3, 5, 8, 12, 20, 30和50 mM ABTS底物，明确20-30 mM ABTS浓度条件下，漆酶产物的吸光值随培养时间而持续增加，且不受土壤环境因子的抑制。
[0014] 所述的一种土壤漆酶活力的测定方法，所述测定产物吸光值，0-6小时持续测定吸光值，由于漆酶—底物反应过程符合一级动力学特征而非直线方程，即产物合成会经历初始快速合成、吸光值迅速升高，而中期缓慢、后期停滞的动力学特征；因此，选取如下时间点测定漆酶产物的光吸收值：底物—酶液混合前1小时内，5-10分钟间隔测定产物吸光值，中、后期20-30分钟间隔测定吸光值。
[0015] 所述的一种土壤漆酶活力的测定方法，所述方法通过一级动力学方程拟合漆酶产物动力学过程，并将酶活力与动力学参数计算相结合，进而确定特定森林土壤条件下漆酶对底物利用的最大活力，以及形成最大产物合成的时间尺度，从而避免传统方法中对漆酶酶活力测定的时间点与最大产物生成量的主观臆断。具体实施方案
[0016] 下面通过实例对本发明做进一步详细说明。
[0017] 一种修正森林土壤漆酶活力的测定方法，通过一定底物浓度梯度确定最适底物2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）浓度，利用一级动力学方程模拟土壤漆酶活力－底物反应过程，并拟合出特定森林土壤条件下的漆酶活力潜势以及相关过程的速率常数，从而确定特定森林生态系统漆酶酶活力相关的动力学参数。此测定方法避免在漆酶传统测定过程中，因土壤复杂环境因素引起的漆酶活力抑制、初始浓度变化时间难于把握以及最大产物生成量无法计算等原因造成的漆酶活力测定和计算的不准确和不可靠。
[0018] 实施例1
[0019] 1、称2 g（干重）鲜土（<2 mm），溶于20mL灭菌的0.9% NaCl（体积准确）。30 ºC，170 rpm，1小时。滤纸过滤，取一半滤液，于沸水中煮沸30分钟，阴性对照。所有滤液于4 ºC备用。
[0020] 2、200μl 反应体系，依次于96孔板上加入： 100μL pH5.0柠檬酸盐—磷酸盐缓冲液； 50 μL土壤浸提液； 50 μL 80mM ABTS（工作浓度20 mM ABTS）。
[0021] 3、96孔板样品排列与说明：
[0022] 96孔板样品排列
[0023] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
B 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
C 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
D 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
E 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
F 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
G 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
H 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
A 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
B 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
C 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
D 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
E 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
F 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
G 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
H 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
[0024] 96孔板各列样品说明
[0025] Laccase Plates
1 200 uL buffer
2 150 uL buffer + 50 uL substrate
3 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil A
4 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil A（灭菌）
5 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil B
6 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil B（灭菌）
7 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil C
8 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil C（灭菌）
9 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil D
10 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil D （灭菌）
11 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil E
12 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil E（灭菌）
1 200 uL buffer
2 150 uL buffer + 50 uL substrate
3 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil A
4 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil A（灭菌）
5 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil B
6 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil B（灭菌）
7 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil C
8 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil C（灭菌）
9 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil D
10 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil D （灭菌）
11 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil E
12 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil E（灭菌）
[0026] 4、检测条件：96孔板培养温度为30℃；波长为420 nm；吸光值读取时间为酶液培养前1小时内，隔5分钟读取吸光值1次，之后的5个小时内每隔半小时读取吸光值1次；检测总时长为8小时；利用多功能酶标仪进行光吸收值检测。
[0027] 5、最大产物生成潜势计算：漆酶产物合成符合一级动力学方程，即ODt = ODMax × [1-exp(-k×t)]，其中，ODt为时间t时的酶产物吸光值，ODMax为生成产物最大理论吸光值，t为酶—底物培养时间，k为产物生成速率常数，1/k即为得到的平均反应时间MPT。将不同培养时间（t）和相应吸光值（ODt）代入非线性方程，并拟合出ODMax。
[0028] 6、酶活力计算：酶活力(U/L) = (10^6/ξ420) × (V总/V酶) × ( ODMax/MPT)。这里的酶活定义为：25℃，每分钟内，氧化1 μmol的ABTS所需酶量。公式解释：V总和V酶代表反应体系的总体积和经过适当稀释后的反应酶液体积，ODMax代表在MPT时间内吸光值的变化。ABTS的摩尔消光系数（molar extinction coefficient）ξ420 数值取36,000 mol L-1 cm-1。
[0029] 7、最后，样品漆酶活力应扣除阴性（灭菌土）对照。
[0030] 实施例2
[0031] 1、称5 g（干重）鲜土（<2 mm），溶于50 mL灭菌的0.9% NaCl（体积准确）。30 ºC，170 rpm，1小时。滤纸过滤，取一半滤液，于沸水中煮沸45分钟，阴性对照。所有滤液于4 ºC备用。
[0032] 2、200μl 反应体系，依次于96孔板上加入： 100μL pH5.0柠檬酸盐—磷酸盐缓冲液； 50 μL土壤浸提液； 50 μL 120mM ABTS（工作浓度30 mM ABTS）。
[0033] 3、96孔板样品排列与说明：
[0034] 96孔板样品排列
[0035] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
B 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
C 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
D 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
E 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
F 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
G 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
H 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
A 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
B 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
C 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
D 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
E 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
F 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
G 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
H 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6
[0036] 96孔板各列样品说明
[0037] Laccase Plates
1 200 uL buffer
2 150 uL buffer + 50 uL substrate
3 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil A
4 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil A（灭菌）
5 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil B
6 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil B（灭菌）
7 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil C
8 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil C（灭菌）
9 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil D
10 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil D（灭菌）
11 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil E
12 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil E（灭菌）
1 200 uL buffer
2 150 uL buffer + 50 uL substrate
3 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil A
4 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil A（灭菌）
5 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil B
6 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil B（灭菌）
7 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil C
8 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil C（灭菌）
9 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil D
10 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil D（灭菌）
11 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil E
12 100 uL buffer + 50 uL substrate + 50 uL soil E（灭菌）
[0038] 4、检测条件：96孔板培养温度为30℃；波长为420 nm；吸光值读取时间为酶液培养前1小时内，隔5分钟读取吸光值1次，之后的5个小时内每隔半小时读取吸光值1次；检测总时长为8小时；利用多功能酶标仪进行光吸收值检测。
[0039] 5、最大产物生成潜势计算：漆酶产物合成符合一级动力学方程，即ODt = ODMAX × [1-exp(-k×t)]，其中，ODt为时间t时的酶产物吸光值，ODMax为生成产物最大理论吸光值，t为酶—底物培养时间，k为产物生成速率常数，1/k即为得到的平均反应时间MPT。将不同培养时间（t）和相应吸光值（ODt）代入非线性方程，并拟合出ODMax。
[0040] 6、酶活力计算：酶活力(U/L)=(10^6/ξ420) ×(V总/V酶) ×( ODMax/MPT)。这里的酶活定义为：25℃，每分钟内，氧化1 μmol的ABTS所需酶量。公式解释：V总和V酶代表反应体系的总体积和经过适当稀释后的反应酶液体积，ODMax代表在MPT时间内吸光值的变化。ABTS的摩尔消光系数（molar extinction coefficient）ξ420 数值取36,000 mol L-1 cm-1。
[0041] 7、最后，样品漆酶活力应扣除阴性（灭菌土）对照。