一种用于通关藤的检测方法

摘要

本发明属于中药检测的技术领域，具体的涉及一种用于通关藤的检测方法。该种用于通关藤的检测方法，包括以下步骤：（1）供试品溶液、对照品溶液与对照药材溶液的制备；（2）绿原酸、通关藤苷H的鉴别；（3）绿原酸、通关藤苷H的含量检测；（4）建立以绿原酸、通关藤苷H为参照物的特征指纹图谱。该检测方法对通关藤中绿原酸、通关藤苷H同时进行鉴别，同时检测出两种成分的含量，并建立以绿原酸、通关藤苷H为参照物的特征指纹图谱，可以同时应用于药材、水提取物、消癌平制剂，稳定性好，易操作，一次性检测两种成分，专属性强，节约检测时间，大大提高检测精准度和灵敏度。

权利要求

1.一种用于通关藤的检测方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液、对照品溶液与对照药材溶液的制备：分别制备供试品溶液、2～6mg/ml绿原酸对照品溶液、0.1～0.5mg/ml通关藤苷H对照品溶液和通关藤对照药材溶液；

（2）绿原酸、通关藤苷H的鉴别：分别取供试品溶液、绿原酸对照品溶液、通关藤苷H对照品溶液、通关藤对照药材溶液10μ l，点于同一硅胶G薄层板，然后配制展开剂，取展开剂的上层溶液置于薄层板上；静置待上层溶液展开，将薄层板取出并晾干；待薄层板晾干后将薄层板置于紫外光灯下，在波长365nm的条件下进行检视，首先供试品溶液的色谱分别与绿原酸对照品溶液、通关藤对照药材溶液的色谱在相应位置上显相同颜色的荧光斑点或主斑点；然后利用质量浓度为5%的硫酸香草醛试液显色，加热至斑点清晰，供试品溶液的色谱分别与通关藤苷H对照品溶液、通关藤对照药材溶液的色谱在相应位置上显相同颜色的斑点或主斑点；

（3）绿原酸、通关藤苷H的含量检测：取供试品溶液、绿原酸对照品溶液和通关藤苷H对照品溶液采用HPLC-UV进行检测；其中流动相为乙腈和0.5%磷酸水溶液，检测波长为190～

220nm；所述步骤（3）中采用流动相梯度洗脱，其中梯度改变流动相比例的时间点以及该时间点设定的乙腈与0.5%磷酸水溶液的体积比如下：0min时，乙腈与0.5%磷酸水溶液的体积比为15:85；5min时，乙腈与0.5%磷酸水溶液的体积比为8:92；50min时，乙腈与0.5%磷酸水溶液的体积比为80:20；55min时，乙腈与0.5%磷酸水溶液的体积比为15:85；60min时，乙腈与0.5%磷酸水溶液的体积比为15:85；

（4）建立以绿原酸、通关藤苷H为参照物的特征指纹图谱。

2.根据权利要求1所述用于通关藤的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的展开剂由乙酸丁酯、甲酸和水组成。

3.根据权利要求2所述用于通关藤的检测方法，其特征在于，所述乙酸丁酯：甲酸：水的体积比为14:5:5。

4.根据权利要求1所述用于通关藤的检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中的检测波长为201nm。

5.根据权利要求1所述用于通关藤的检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中采用的HPLC-UV填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。

6.根据权利要求1所述用于通关藤的检测方法，其特征在于，所述检测方法应用于通关藤药材、通关藤水提取物和消癌平制剂。

说明书

一种用于通关藤的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药检测的技术领域，具体的涉及一种用于通关藤的检测方法。

背景技术

[0002] 通关藤为萝藦科植物，又名乌骨藤等，始载于《滇南本草》，药材标准收载于1974年版《云南省药品标准》、1977年版《中国药典》及2010年版《中国药典》。目前检测通关藤的方法主要包括性状鉴定、显微鉴定、薄层鉴定、理化鉴定及含量测定等方法。含量测定主要通过分光光度法或者如《通关藤药材及制剂指纹图谱的建立方法及应用》(专利申请号CN201410119474.8)一文中采用HPLC-ELSD法测定通关藤中甾体皂苷含量，还有《通关藤药材及制剂指纹图谱的建立方法及应用》(专利申请号CN201310684459.3)提到的采用HPLC-ELSD法测定通关藤中酚酸类含量。

[0003] 专利《一种乌骨藤皂苷的检测方法》(专利申请号CN201110232427.0)认为：“乌骨藤皂苷在紫外光区没有显著的特征吸收，因此很难对其中化学成分含量进行精密准确的测定”，“选用紫外检测器，由于乌骨藤皂苷在紫外光区无特征吸收，因此选用该方法检测必定会有专属性差、误差大的缺点。”

[0004] 由上述可知现有技术中所存在的缺陷如下：

[0005] 1、现有技术中仅仅是通过单一的某成分，如绿原酸或通关藤苷H中的一个单一成分为指标来鉴别和控制通关藤含量，这样对于通关藤含量的测定准确性、稳定性以及灵敏度均不能达到最佳的效果，从而不能很好控制药材及制剂的质量；

[0006] 2、现有技术认为采用HPLC-UV检测通关藤苷H存在专属性差，误差大的缺陷，因而均不采用HPLC-UV的检测方法，而是选用灵敏度与检测限度远小于HPLC-UV的HPLC-ELSD方法进行检测；

[0007] 3、现有技术检测的对象为药材或者制剂，尚未有一种检测方法均适用于药材、水提取物和制剂中通关藤含量的检测。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于针对上述存在的缺陷而提供一种用于通关藤的检测方法，该检测方法对通关藤中绿原酸、通关藤苷H同时进行鉴别，同时检测出两种成分的含量，并建立以绿原酸、通关藤苷H为参照物的特征指纹图谱，可以同时应用于药材、水提取物、消癌平制剂，稳定性好，易操作，一次性检测两种成分，专属性强，节约检测时间，大大提高检测精准度和灵敏度。

[0009] 本发明的技术方案为：一种用于通关藤的检测方法，包括以下步骤：

[0010] (1)供试品溶液、对照品溶液与对照药材溶液的制备：分别制备供试品溶液、2～6mg/ml绿原酸对照品溶液、0.1～0.5mg/ml通关藤苷H对照品溶液和通关藤对照药材溶液；

[0011] (2)绿原酸、通关藤苷H的鉴别：分别取供试品溶液、绿原酸对照品溶液、通关藤苷H对照品溶液、通关藤对照药材溶液10ul，点于同一硅胶G薄层板，然后配制展开剂，取展开剂的上层溶液置于薄层板上；静置待上层溶液展开，将薄层板取出并晾干；待薄层板晾干后将薄层板置于紫外光灯下，在波长365nm的条件下进行检视，首先供试品溶液的色谱分别与绿原酸对照品溶液、通关藤对照药材溶液的色谱在相应位置上显相同颜色的荧光斑点或主斑点；然后利用质量浓度为5％的硫酸香草醛试液显色，加热至斑点清晰，供试品溶液的色谱分别与通关藤苷H对照品溶液、通关藤对照药材溶液的色谱在相应位置上显相同颜色的斑点或主斑点；

[0012] (3)绿原酸、通关藤苷H的含量检测：取供试品溶液、绿原酸对照品溶液和通关藤苷H对照品溶液采用HPLC-UV进行检测；其中流动相为乙腈和0.5％磷酸水溶液，检测波长为190～220nm；

[0013] (4)建立以绿原酸、通关藤苷H为参照物的特征指纹图谱。

[0014] 所述步骤(2)中的展开剂由乙酸丁酯、甲酸和水组成。

[0015] 所述乙酸丁酯：甲酸：水的体积比为14:5:5。

[0016] 所述步骤(3)中的检测波长为201nm。

[0017] 所述步骤(3)中采用的HPLC-UV填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。

[0018] 所述步骤(3)中采用流动相梯度洗脱，其中梯度改变流动相比例的时间点以及该时间点设定的乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比如下：0min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为15:85；5min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为8:92；50min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为80:20；55min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为15:85；60min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为15:85。

[0019] 所述检测方法应用于通关藤药材、通关藤水提取物和消癌平制剂。

[0020] 本发明的有益效果为：本发明所述用于通关藤的检测方法(1)一次性检测绿原酸、通关藤苷H两种成分，专属性强，检测方便，与现有技术相比简便省时，节约检测成本与人工，大幅度提高检测分析能力，同时检测两种指标成分，更能有效控制产品的质量，提高检测准确度；(2)采用HPLC-UV法检测，没有出现专属性差，误差大的缺陷，同时提高了检测的灵敏度与检测限度；(3)该检测方法可以同时检测通关藤药材、通关藤水提取物和通关藤制剂，能更好的控制整个生产环节的质量；(4)现有技术中绿原酸都在327nm左右检测，而本发明突破了固有观念，在190～220nm处进行检测，效果良好。

附图说明

[0021] 图1为本发明具体实施方式中绿原酸鉴别图谱，其中1为通关藤空白样品、2为绿原酸对照品、3为通关藤苷H对照品、4为通关藤对照药材、5为通关藤药材样品、6为通关藤提取物样品、7为消癌平片样品、8为消癌平胶囊样品、9为消癌平颗粒样品、10为消癌平散样品、11为消癌平丸样品、12为消癌平糖浆样品、13为消癌平口服液样品、14为消癌平注射液样品。

[0022] 图2为本发明具体实施方式中通关藤苷H、通关藤对照药材鉴别图谱，其中1为通关藤空白样品、2为绿原酸对照品、3为通关藤苷H对照品、4为通关藤对照药材、5为通关藤药材样品、6为通关藤提取物样品、7为消癌平片样品、8为消癌平胶囊样品、9为消癌平颗粒样品、10为消癌平散样品、11为消癌平丸样品、12为消癌平糖浆样品、13为消癌平口服液样品、14为消癌平注射液样品。

[0023] 图3为本发明具体实施方式中甲醇溶剂峰图谱。

[0024] 图4为本发明具体实施方式中对照品图谱，S1为绿原酸、S2为通关藤苷H。

[0025] 图5为本发明具体实施方式中原酸对照品图谱，S1为绿原酸。

[0026] 图6为本发明具体实施方式中通关藤提取物指纹图谱(S1、S2为对照峰)。

[0027] 图7为本发明具体实施方式中通关藤药材指纹图谱。

[0028] 图8为本发明具体实施方式中消癌平片剂指纹图谱。

[0029] 图9为本发明具体实施方式中消癌平胶囊剂指纹图谱。

[0030] 图10为本发明具体实施方式中消癌平颗粒剂指纹图谱。

[0031] 图11为本发明具体实施方式中消癌平散剂指纹图谱。

[0032] 图12为本发明具体实施方式中消癌平丸剂指纹图谱。

[0033] 图13为本发明具体实施方式中消癌平糖浆剂指纹图谱。

[0034] 图14为本发明具体实施方式中消癌平口服液指纹图谱。

[0035] 图15为本发明具体实施方式中消癌平注射液指纹图谱。

[0036] 图16为本发明具体实施方式中绿原酸标准曲线图。

[0037] 图17为本发明具体实施方式中通关藤苷H标准曲线图。

[0038] 图18为本发明具体实施方式中展开剂为氯仿-丙酮-甲醇的通关藤苷H鉴别图谱，其中1为通关藤苷H对照品，2为空白供试品，3为通关藤对照药材，4为通关藤药材，5为通关藤提取物，6为消癌平片。

[0039] 图19为本发明具体实施方式中展开剂为氯仿-甲醇的通关藤苷H鉴别图谱，其中1为通关藤苷H对照品，2为通关藤药材，3为通关藤提取物，4为消癌平片。

[0040] 图20为本发明具体实施方式中展开剂为氯仿-甲醇-水的通关藤苷H鉴别图谱，其中1为通关藤苷H对照品(5ul)，2为通关藤苷H对照品(10ul)，3为通关藤药材，4为通关藤提取物，5为消癌平片。

[0041] 图21为本发明具体实施方式中恒速洗脱条件下的通关藤图谱。

[0042] 图22为本发明具体实施方式中通关藤图谱。

[0043] 图23为本发明具体实施方式中流动相为乙腈-水30：70恒速洗脱条件下的供试品色谱图。

[0044] 图24为本发明具体实施方式中流动相为乙腈-水50:50恒速洗脱条件下的供试品色谱图。

[0045] 图25为本发明具体实施方式中流动相为乙腈－0.4％磷酸水溶液13:87恒速洗脱条件下色谱图。

[0046] 图26为本发明具体实施方式中流动相为氯仿的图谱。

[0047] 图27为本发明具体实施方式中流动相为乙醇的图谱。

具体实施方式

[0048] 下面通过具体实施方式对本发明进行详细的说明。

[0049] 所述检测方法应用于通关藤药材、通关藤水提取物和消癌平制剂。其中通关藤水提取物的制备方法：取通关藤，破碎，50g，加水300ml，煮提2小时，过滤，滤渣加300ml水，煮提1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩干燥。消癌平制剂为固体制剂与液体制剂。消癌平固体制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂；液体制剂包括糖浆剂、口服液、注射液。

[0050] 所述用于通关藤的检测方法，包括以下步骤：

[0051] (1)供试品溶液、对照品溶液与对照药材溶液的制备：分别制备供试品溶液2～6mg/ml绿原酸对照品溶液、0.1～0.5mg/ml通关藤苷H对照品溶液和通关藤对照药材溶液；

[0052] a.供试品溶液的制备：

[0053] 通关藤药材供试品溶液：通关藤药材样品，取2～4g，加50％甲醇10～30ml，超声处理15～45min，滤过，滤液蒸至近干，加甲醇1ml使溶解，取上清液作为通关藤药材供试品溶液。

[0054] 通关藤提取物及消癌平固体制剂供试品溶液：通关藤提取物及固体制剂样品取0.1～1g，其中提取物及片剂、胶囊、颗粒、散剂样品研碎，丸剂剪碎，加50％甲醇10～30ml，超声处理15～45min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，上清液作为提取物及制剂供试品溶液。

[0055] 消癌平液体制剂供试品溶液：液体制剂取0.5～2ml，蒸干，加醇1ml使溶解，上清液作为液体制剂供试品溶液。

[0056] b.绿原酸对照品溶液和通关藤苷H对照品溶液的制备：取绿原酸对照品2～6mg加甲醇1毫升，取通关藤苷H对照品0.5～2.5mg加甲醇5毫升，分别制备绿原酸对照品2～6mg/ml，通关藤苷H对照品0.1～0.5mg/ml。

[0057] c.通关藤对照药材溶液：取通关藤对照药材3克，加水50毫升，回流提取2小时，滤过，滤液蒸至近干，加甲醇1毫升使溶解，取上清液作为对照药材溶液。

[0058] (2)绿原酸、通关藤苷H的鉴别：分别取供试品溶液、绿原酸对照品溶液、通关藤苷H对照品溶液、通关藤对照药材溶液10ul，点于同一硅胶G薄层板，然后配制展开剂，其中展开剂由乙酸丁酯、甲酸和水组成；所述乙酸丁酯：甲酸：水的体积比为14:5:5。取展开剂的上层溶液置于薄层板上；静置待上层溶液展开，将薄层板取出并晾干；待薄层板晾干后将薄层板置于紫外光灯下，在波长365nm的条件下进行检视，首先供试品溶液的色谱分别与绿原酸对照品溶液、通关藤对照药材溶液的色谱在相应位置上显相同颜色的荧光斑点或主斑点；然后利用质量浓度为5％的硫酸香草醛试液显色，加热至斑点清晰，供试品溶液的色谱分别与通关藤苷H对照品溶液、通关藤对照药材溶液的色谱在相应位置上显相同颜色的斑点或主斑点；

[0059] (3)绿原酸、通关藤苷H的含量检测：取供试品溶液、绿原酸对照品溶液和通关藤苷H对照品溶液采用HPLC-UV进行检测；其中填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙腈和0.5％磷酸水溶液，采用流动相梯度洗脱，其中梯度改变流动相比例的时间点以及该时间点设定的乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比如下：0min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为15:85；5min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为8:92；50min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为80:20；55min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为15:85；60min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为15:85。检测波长为190～220nm；

[0060] (4)建立以绿原酸、通关藤苷H为参照物的特征指纹图谱。

[0061] 下面以通关藤水提取物的检测过程为例，进行含量测定方法学验证试验，具体如下。

[0062] 通关藤药材供试品溶液：通关藤药材样品粉碎，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

[0063] 通关藤对照药材溶液：取通关藤对照药材3克，加水50毫升，回流提取2小时，滤过，滤液蒸至近干，加甲醇1毫升使溶解，取上清液作为对照药材溶液。

[0064] 通关藤提取物及消癌平片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂供试品溶液：通关藤提取物及片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂样品取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为提取物及制剂供试品溶液。

[0065] 消癌平糖浆、口服液、注射液供试品溶液：消癌平糖浆、口服液、注射液取1ml，精密称定，加50％甲醇至10ml，作为液体制剂供试品溶液。

[0066] 对照品溶液的制备：取绿原酸对照品4mg加甲醇1毫升、通关藤苷H对照品1mg加甲醇5毫升，分别制备绿原酸对照品4mg/ml，通关藤苷H对照品0.2mg/ml；

[0067] 色谱条件与系统适用性试验：选用HPLC-UV检测器，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈与0.5％磷酸水溶液为流动相，检测波长为201nm；

[0068] 梯度改变流动相比例的时间点，以及该时间点设定的乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比如下：0min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为15:85；5min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为8:92；50min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为80:20；55min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为15:85；60min时，乙腈与0.5％磷酸水溶液的体积比为15:85。

[0069] 试验用供试品溶液、对照品溶液以及检测条件等均按照上述条件进行。

[0070] (1)稳定性试验

[0071] 取本发明提取物样品供试液，按2、4、6、8、12、24、48小时测定，测定结果见表1-4。结果表明，供试液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的相对峰面积基本没有明显变化(RSD<3％)，符合指纹图谱的技术要求，供试液在48小时内稳定。注：tR表示该峰的保留时间 tR/tS表示该峰的相对保留时间；S1为绿原酸，S2为通关藤苷H。

[0072] 表1：以S1为参照峰样品液稳定性考察结果(共有峰的相对保留时间)。

[0073]

[0074]

[0075] 表2：以S2为参照峰样品液稳定性考察结果(共有峰的相对保留时间)。

[0076]

[0077] 表3：以S1为参照峰样品液稳定性(占峰总面积5％以上主要峰的相对峰面积)考察结果。

[0078]

[0079]

[0080] 表4：以S2为参照峰样品液稳定性(占峰总面积5％以上主要峰的相对峰面积)考察结果。

[0081]

[0082] (2)精密度试验

[0083] 同一通关藤提取物样品供试液，连续进样6次进行测定，测定结果见表5-8。结果表明，供试液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的相对峰面积基本一致(RSD<3％)，符合指纹图谱的技术要求。

[0084] 表5：以S1为参照峰样品液精密度考察结果(共有峰的相对保留时间)。

[0085]

[0086]

[0087] 表6：以S2为参照峰样品液精密度考察结果(共有峰的相对保留时间)。

[0088]

[0089] 表7：以S1为参照峰样品精密度(占总峰面积5％以上主要峰的相对峰面积)考察结果。

[0090]

[0091] 表8：以S2为参照峰样品精密度(占总峰面积5％以上主要峰的相对峰面积)考察[0092] 结果。

[0093]

[0094] (3)重复性试验

[0095] 同一批号通关藤提取物，同法制备样品液6份，依法测定，结果见表9-12。结果表明，供试液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的相对峰面积基本一致(RSD<3％)，符合指纹图谱的技术要求。

[0096] 表9：以S1为参照峰样品液重复性考察结果(共有峰的相对保留时间)。

[0097]

[0098] 表10：以S2为参照峰样品液重复性考察结果(共有峰的相对保留时间)。

[0099]

[0100]

[0101] 表11：以S1为参照峰样品重复性(占总峰面积5％以上主要峰的相对峰面积)考察结果。

[0102]

[0103] 表12：以S2为参照峰样品重复性(占总峰面积5％以上主要峰的相对峰面积)考察结果。

[0104]

[0105]

[0106] (4)十批样品指纹图谱的测定：取10批通关藤提取物样品，同法制备，参照物用外标法，计算标准指纹图谱。结果见表13-16。

[0107] 表13：以S1为参照物十批样品指纹图谱测定结果(示所有峰相对保留时间)。

[0108]

[0109] 继上表

[0110]

[0111]

[0112] 表14：以S2为参照物十批样品指纹图谱测定结果(示所有峰相对保留时间)。

[0113]

[0114] 继上表

[0115]

[0116] 表15：以S1为参照物10批(占总峰面积5％以上主要峰的相对峰面积)考察结果。

[0117]

[0118] 继上表

[0119]

[0120] 表16：以S2为参照物10批(占总峰面积5％以上主要峰的相对峰面积)考察结果。

[0121]

[0122] 继上表

[0123]7 8 9 10

[0124]A A/AS A A/AS A A/AS A A/AS
208035 1.000 400418 1.000 572915 1.000 439886 1.000
1651945 7.941 2437946 6.089 2359226 4.118 2107267 4.790
21015548 101.019 27012361 67.460 26085066 45.530 29895492 67.962
1149035 5.523 1202306 3.003 1828870 3.192 1238487 2.815
462480 2.223 710295 1.774 1102437 1.924 1361252 3.095
548833 2.638 886800 2.215 1142423 1.994 1148683 2.611
121558 0.584 209780 0.524 375416 0.655 304414 0.692

[0125] (5)线性关系考察

[0126] 精密吸取绿原酸150ug/ml和通关藤苷H3.07mg/ml混合对照为初始溶液，逐步稀释成1.5、2、3、6、12倍不同浓度的混合对照品溶液。取不同浓度的混合对照品溶液，分别进样20ul。以对照品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。绿原酸：y＝
30762x+10669，r＝0.9996，线性范围0.25—3ug；通关藤苷H：y＝1.1╳106x+6162.4，r＝
0.9990，线性范围5.126—61.4ug，结果表明线性关系良好。线性测定结果如下表17和表18。

[0127] 表17：绿原酸线性测定结果。

[0128]绿原酸(μg/ml) 峰面积
150 4580230
100 3171254
75 2297361
50 1555288
25 765311
12.5 384098

[0129] 表18：通关藤苷H线性测定结果。

[0130]通关藤苷H(mg/ml) 峰面积
3.07 3404801
2.05 2272503
1.437 1710879
1.025 1151680
0.5125 529301
0.25625 282886

[0131] (6)加样回收率试验

[0132] 取供试品粉末6份，每份约0.1g，精密称定，每份分别精密加入93.89ug/ml绿原酸对照品溶液5.0ml，0.593mg/ml通关藤苷H对照品溶液5ml，挥干溶剂，按供试品溶液制备方法制备，照样品测定项下测定并计算加样回收率，结果见下表。

[0133] 表19：加样回收率。

[0134]

[0135] 在绿原酸、通关藤苷H的鉴别过程中展开剂的选择对照如下：

[0136] 1.采用展开剂为氯仿-丙酮-甲醇(20-1-1)

[0137] 结论：供试品色谱中，与通关藤苷H对照品、对照药材色谱相应位置未出现显相同颜色的斑点，见图18。

[0138] 2.采用展开剂为氯仿-甲醇(95-5)

[0139] 结论：供试品色谱中，与通关藤苷H对照品、对照药材色谱相应位置未出现显相同颜色的斑点，见图19。

[0140] 3.采用展开剂为氯仿-甲醇-水(65-35-10)

[0141] 结论：展开失败，见图20。

[0142] 本发明绿原酸、通关藤苷H的含量检测过程中对于条件的选择分析如下：

[0143] 1.本发明选择所述梯度洗脱的原因：通关藤中含有多种成分，采用乙腈与0.5％磷酸水溶液为流动相，恒速洗脱时，通关藤中成分分离度不好，有效成分无法分离，造成检测效果不理想，见图21。

[0144] 2.本发明选择所述梯度洗脱的时间点与比例：经过试验验证，本申请选择的时间点与比例是合适的，选择其他时间点与比例造成通关藤分离度过低，有效成分分离不彻底；以及有效成分的峰行不对称，造成拖尾或者前沿峰，见图22。

[0145] 3.本发明对于流动相的选择。

[0146] (1)选择乙腈-水(30：70)恒速洗脱，供试品色谱图中出现比较大的杂峰，见图23。

[0147] (2)选择乙腈-水(50:50)，恒速洗脱，绿原酸峰未出现，见图24。

[0148] (3)选择乙腈－0.4％磷酸水溶液(13:87)，恒速洗脱，色谱峰分离度不高，见图25。

[0149] (4)选择氯仿，提取供试品，无成型图谱，见图26。

[0150] (5)选择乙醇，提取供试品，无成型图谱，见图27。