一种微萃取耦合技术及其在杞黄胶囊质量控制中的应用

摘要

本发明属于分离技术领域，具体涉及一种微萃取耦合技术尤其是中空纤维膜微萃取耦合技术及其在杞黄胶囊质量控制中的应用。针对现有中空纤维膜微萃取技术之不足，将其与纳米粒子技术进行耦合，产生了非常显著的有益效果。首次将中空纤维膜微萃取耦合技术应用于复杂中药样品杞黄胶囊的质量控制方法研究，结合HPLC法测定了杞黄胶囊中小檗碱、巴马汀、表小檗碱和黄连碱等黄连生物碱的含量，克服了杞黄胶囊复杂样品基质的干扰，解决了杞黄胶囊中没有黄连生物碱含量测定项的问题，且具有操作简便易行、绿色环保等常规方法不可比拟的优点。

权利要求

1.一种微萃取耦合方法在杞黄胶囊黄连生物碱测定中的应用，其特征在于，主要包括以下步骤：①纳米粒子分散液的制备：

将一定量的纳米粒子放到盛有一定量分散溶剂的小烧杯中，在磁力搅拌器的作用下，使其均匀的分散到分散溶剂中，得到纳米粒子分散液；所述纳米粒子为二氧化硅、二氧化钛、氧化铜或四氧三化铁纳米粒子；

②中空纤维膜的预处理：

取中空纤维膜洗净吹干，剪成长约1.5cm的小段，得到中空纤维膜棒；

③含纳米粒子/有机溶剂的中空纤维膜棒的制备：

将中空纤维膜棒放到盛有纳米粒子分散液的小烧杯中，在磁力搅拌器的作用下搅拌3小时，使纳米粒子充分填充到中空纤维的壁孔内，然后从烧杯中取出中空纤维，用纯净水清洗3次，以除去其表面多余的纳米粒子，取出其内腔中的液体，然后放到盛有有机溶剂的小烧杯中，在磁力搅拌器的作用下使其内腔中充满有机溶剂，然后取出，用纯净水清洗2次以除去其表面多余的有机溶剂，得到纳米粒子/有机溶剂的中空纤维棒；纳米粒子/有机溶剂的中空纤维棒制备中所采用有机溶剂为正丁醇；

④杞黄胶囊黄连生物碱的HPLC检测：

(1)对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇超声使其完全溶解，制成每1ml含90μg的溶液，即得盐酸小檗碱对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备及检测：取杞黄胶囊粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比为10:0.1的甲醇-盐酸混合溶液50ml，密塞，称定重量，功率250W频率40kHz的超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液

2.5ml，水浴挥干，以水稀释至5ml，加1M盐酸或1M氢氧化钠调节pH值，并加入适量NaCl，制得待净化的样品溶液；

将制备好的纳米粒子/有机溶剂的中空纤维棒放入上述待净化的样品溶液中，以一定速度进行搅拌，萃取一段时间后，取出中空纤维棒，用清洗剂清洗两次，弃除清洗液，加入一定量洗脱剂在超声波清洗器的作用下超声洗脱一定时间，弃去中空纤维棒，洗脱液经过

0.22μm微孔滤膜滤过后，即得；

色谱条件：以体积比为50:50乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相，检测波长为

346nm，流速为1ml/min；其中每100ml磷酸二氢钾溶液中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调pH值为4.0；

本品每粒以盐酸小檗碱(C20H18ClNO4)计，含小檗碱(C20H17NO4)不得少于1.67mg，表小檗碱(C20H17NO4)不得少于0.23mg，黄连碱(C19H13NO4)不得少于0.39mg，巴马汀(C21H21NO4)不得少于0.4mg。

2.根据权利要求1所述的一种微萃取耦合方法在杞黄胶囊黄连生物碱测定中的应用，其特征在于：纳米粒子分散液的制备所采用分散溶剂为有机溶剂、有机溶剂的水溶液或水。

3.根据权利要求1所述的一种微萃取耦合方法在杞黄胶囊黄连生物碱测定中的应用，其特征在于：中空纤维膜的预处理所采用中空纤维膜的材质为聚醚砜或聚偏氟乙烯。

4.根据权利要求1所述的一种微萃取耦合方法在杞黄胶囊黄连生物碱测定中的应用，其特征在于：中空纤维膜的预处理所采用中空纤维膜截留分子量为40000。

5.根据权利要求1所述的一种微萃取耦合方法在杞黄胶囊黄连生物碱测定中的应用，其特征在于：供试品溶液的制备及检测所采用含纳米粒子/有机溶剂的中空纤维膜棒为4～

10根。

6.根据权利要求1所述的一种微萃取耦合方法在杞黄胶囊黄连生物碱测定中的应用，其特征在于：供试品溶液的制备所采用洗脱剂为40～100％的甲醇溶液。

说明书

一种微萃取耦合技术及其在杞黄胶囊质量控制中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于分离技术领域，具体涉及一种微萃取耦合技术尤其是中空纤维膜微萃取耦合技术及其在杞黄胶囊质量控制中的应用。

背景技术

[0002] 中空纤维膜微萃取技术具有有机溶剂用量少、样品除杂能力突出、易与多种分析仪器联用、操作模式多样化、成本低等优点，近年来已有应用于环境、生物、食品等复杂样品的研究报道。然而由于中药样品化学成分的复杂性，单一的中空纤维膜微萃取技术应用于中药质量控制领域还不多见。纳米粒子具有高的机械强度、大的比表面积、低毒、理化性质稳定、抗腐蚀等优点，是一种理想的固体吸附剂。目前尚无中空纤维膜微萃取耦合纳米粒子并成功应用于中药质量控制的报道。

[0003] 杞黄胶囊具有益气养阴、清热生津之功效，用于II型糖尿病属气阴两虚兼燥热伤津证。黄连是杞黄胶囊中的一味重要药材，具清热燥湿、泻火解毒之功效，为中医临床治疗消渴（糖尿病）的常用药物，主要含原小檗碱型生物碱如小檗碱、巴马汀、药根碱、表小檗碱、黄连碱等生物碱类成分。由于杞黄胶囊由20余味中药组成，化学成分复杂，其药效成分分析测定难度极大，杞黄胶囊现有标准中没有黄连生物碱的含量测定项。本发明首次将中空纤维膜微萃取和纳米粒子技术进行耦合，并成功应用于杞黄胶囊的样品前处理，结合HPLC法测定了杞黄胶囊中黄连生物碱的含量，克服了杞黄胶囊复杂样品基质的干扰，解决了杞黄胶囊中没有黄连生物碱的含量测定项的问题。该耦合技术操作简便易行、绿色环保等常规方法不可比拟的等优点，在中药质量控制领域具有广阔的应用前景。

发明内容

[0004] 本发明针对现有中空纤维膜微萃取技术之不足，将其与纳米粒子技术进行耦合，产生了非常显著的有益效果。应用于杞黄胶囊的质量控制，提供了一种杞黄胶囊中黄连生物碱的含量方法，HPLC测定小檗碱、巴马汀、表小檗碱和黄连碱能够达到基线分离，方法专属性好、简便准确，进一步完善了杞黄胶囊的质量标准。

[0005] 本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

[0006] 一种微萃取耦合技术及其在杞黄胶囊质量控制中的应用，其特征在于，主要包括以下步骤：

[0007] ①纳米粒子分散液的制备：

[0008] 将一定量的纳米粒子（可以是二氧化硅、二氧化钛、氧化铜、四氧三化铁纳米粒子）放到盛有一定量分散溶剂的小烧杯中，在磁力搅拌器的作用下，使其均匀的分散到分散溶剂中，得到纳米粒子分散液；

[0009] 纳米粒子可以是二氧化硅、二氧化钛、氧化铜、四氧三化铁纳米粒子以及由上述纳米粒子按不同比例组成的组合物。优选的分散溶剂为二氧化钛；

[0010] 分散溶剂可以是有机溶剂、有机溶剂的水溶液和水，优选的分散溶剂为水；

[0011] ②中空纤维膜的预处理

[0012] 取中空纤维膜洗净吹干，剪成长约1.5cm的小段，得到中空纤维膜棒；

[0013] 优选的中空纤维膜的材质为聚醚砜、聚偏氟乙烯，更为优选的中空纤维膜的材质为聚醚砜；优选的中空纤维膜的截留分子量为40000；

[0014] ③含纳米粒子/有机溶剂的中空纤维膜棒的制备

[0015] 将中空纤维膜棒放到盛有纳米粒子分散液的小烧杯中，在磁力搅拌器的作用下搅拌3小时，使纳米粒子充分填充到中空纤维的壁孔内，然后从烧杯中取出中空纤维，用纯净水清洗3次，以除去其表面多余的纳米粒子，取出其内腔中的液体，然后放到盛有有机溶剂的小烧杯中，在磁力搅拌器的作用下使其内腔中充满有机溶剂，然后取出，用纯净水清洗2次以除去其表面多余的有机溶剂，得到纳米粒子/有机溶剂的中空纤维棒；

[0016] 优选的有机溶剂为有机溶剂可以是氯仿、乙酸乙酯、正丁醇；

[0017] ④杞黄胶囊中黄连生物碱的含量测定：

[0018] 对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇超声使其完全溶解，制成每1ml含90μg的溶液，即得盐酸小檗碱对照品溶液。

[0019] 供试品溶液的制备：取杞黄胶囊粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（10:0.1）混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2.5ml，水浴挥干，以水稀释至5ml，加1M 盐酸或1M氢氧化钠调节pH值，并加入适量NaCl。将制备好的纳米粒子/有机溶剂正丁醇的中空纤维棒放入上述溶液中，以一定速度进行搅拌，萃取一段时间后，取出中空纤维棒，用清洗剂清洗两次，弃除清洗液，加入一定量洗脱剂在超声波清洗器的作用下超声洗脱一定时间，弃去中空纤维棒，洗脱液经过0.22µm微孔滤膜滤过后，进行HPLC分析。

[0020] 色谱条件：以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（50:50）（每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调pH值为4.0）为流动相，检测波长为346nm，流速为1ml/min。

[0021] 优选的，所采用中空纤维棒为4～10根。

[0022] 优选的，所采用洗脱剂可以是40～100%的甲醇、乙醇溶液。

[0023] 本发明的优点在于：本发明针对现有中空纤维膜微萃取技术之不足，将其与纳米粒子技术进行耦合，产生了非常显著的有益效果。本发明首次将中空纤维膜微萃取耦合技术应用于复杂中药样品杞黄胶囊的质量控制方法研究，结合HPLC法测定了杞黄胶囊中黄连生物碱的含量，克服了杞黄胶囊复杂样品基质的干扰，解决了杞黄胶囊中没有黄连生物碱含量测定项的问题，且具有操作简便易行、绿色环保等常规方法不可比拟的优点。

具体实施方式

[0024] 实施例1

[0025] 杞黄胶囊中黄连生物碱的HPLC检测

[0026] 1.仪器、试剂和药品：

[0027] SHIMADZU高效液相色谱仪（LC-10AT泵，LC-10紫外检测器）（日本），N2000色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）。盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸表小檗碱、硫酸黄连碱均购自中国药品生物制品鉴定所；

[0028] 2.色谱条件

[0029] Kromasil C18(250mmÎ4.6mm，5μm)；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（50:50）（每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调pH值为4.0）为流动相，检测波长为346nm，流速为1.0mLmin-1，进样量20μl；

[0030] 3.样品测定

[0031] 精密量取0.45mg·mL-1的盐酸小檗碱溶液1.0mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，即得盐酸小檗碱对照品溶液。分别精密对照品溶液和供试品溶液20μl。注入液相色谱仪，测定，以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照，分别计算小檗碱、表小檗碱、黄连碱和巴马汀的含量，用待测成分色谱峰与盐酸小檗碱色谱峰的相对保留时间确定。表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的峰位，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内，即得。小试三批杞黄胶囊中黄连生物碱的HPLC测定结果见表1；

[0032] 表1 杞黄胶囊中黄连生物碱含量测定结果(mg/粒)。

[0033]

[0034] 实施例2

[0035] 含纳米粒子/有机溶剂的中空纤维膜制备

[0036] 将一定量的二氧化钛纳米粒子放到盛有一定量水的小烧杯中，在磁力搅拌器的作用下，使其均匀的分散到水中，得到纳米粒子分散液；

[0037] 将洗净吹干的聚醚砜、聚偏氟乙烯中空纤维剪成长约1.5cm的小段，放到盛有纳米粒子分散液的小烧杯中，在磁力搅拌器的作用下搅拌3小时，使纳米粒子充分填充到中空纤维的壁孔内，然后从烧杯中取出中空纤维，用纯净水清洗3次，以除去其表面多余的纳米粒子，然后用微量进样器将其内腔中的液体取出，然后放到盛有有机溶剂的小烧杯中，在磁力搅拌器的作用下使其内腔中充满有机溶剂，然后取出，用纯净水清洗2次以除去其表面多余的有机溶剂，得到纳米粒子/有机溶剂的中空纤维棒；

[0038] 同法制备含二氧化硅、氧化铜、四氧三化铁纳米粒子以及其组合物的纳米粒子/有机溶剂的中空纤维棒。

[0039] 实施例3

[0040] 取杞黄胶囊粉（No140315）0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（10:0.1）混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2.5ml，水浴挥干，以水稀释至5ml，以1M 盐酸调节pH值至5.0，并加入适量NaCl 0.25 g。将制备好的四氧三化铁纳米粒子/正丁醇的中空纤维棒上述溶液中，以一定速度进行磁力搅拌，萃取10分钟后，取出中空纤维棒，用水清洗两次，然后放入盛有10ml甲醇的离心试管中，在超声波清洗器的作用下解吸10分钟左右，弃去中空纤维棒，解吸液经过0.22µm微孔滤膜滤过后，进行HPLC分析，含量测定结果见表1。

[0041] 实施例4

[0042] 取杞黄胶囊粉（No140316）0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（10:0.1）混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2.5ml，水浴挥干，以水稀释至5ml，以1M 氢氧化钠调节pH值至8.0。将制备好的二氧化硅纳米粒子/乙酸乙酯的中空纤维棒上述溶液中，以一定速度进行磁力搅拌，萃取100分钟后，取出中空纤维棒，用30%的乙醇溶液清洗两次，然后放入盛有1.0ml 40%甲醇的离心试管中，在超声波清洗器的作用下解吸5分钟左右，弃去中空纤维棒，解吸液经过0.22µm微孔滤膜滤过后，进行HPLC分析，含量测定结果见表1。

[0043] 实施例5

[0044] 取杞黄胶囊粉（No140317）0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（10:0.1）混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2.5ml，水浴挥干，以水稀释至5ml，以1M 氢氧化钠调节pH值至8.0，加入NaCl 0.2g。将制备好的二氧化钛纳米粒子/氯仿的中空纤维棒上述溶液中，以一定速度进行磁力搅拌，萃取80分钟后，取出中空纤维棒，用10%的乙醇溶液清洗两次，然后放入盛有5.0ml 80%甲醇的离心试管中，在超声波清洗器的作用下解吸10分钟左右，弃去中空纤维棒，解吸液经过0.22um微孔滤膜滤过后，进行HPLC分析，含量测定结果见表1。

[0045] 实施例6

[0046] 中空纤维棒的用量是影响萃取效率的重要因素，其用量影响目标分析物在样品溶液中和中空纤维棒中的分配。随着中空纤维棒用量的增加，目标分析物的峰面积不断增大，当中空纤维棒的数目为7时，达到最大；当超过7时，目标分析物的峰面积不再明显增加，因此在萃取过程中中空纤维棒的数目为7。

[0047] 实施例7

[0048] 目标分析物的分配平衡需要一定的微萃取时间，研究结果表明，微萃取时间分别是10、20、30、40、50分钟，目标化合物的峰面积随时间的增大而增大，超过40分钟不再明显增加,优选的萃取时间为50分钟。

[0049] 实施例8

[0050] 对于目标化合物，供试品溶液的酸性或碱性影响其存在形式,因此考察了样品溶液的酸性或碱性对萃取效率的影响；

[0051] 取0.12mol/L的HCl溶液，分别考察加入0、10、20、30、40µl对目标化合物萃取效率的影响，结果显示随着HCl溶液的用量增大，目标化合物的峰面积略有减少，可能的原因是目标分析物在酸性条件下以离子的形式存在。另取1mol/L的NaOH溶液，分别考察加入0、10、20、30、40µl对目标化合物萃取效率的影响，结果显示随着NaOH溶液的用量增大，目标化合的峰面积无明显变化。因此在实验过程中不加酸碱调节样品溶液的pH值。

[0052] 实施例9

[0053] 微萃取过程中，样品溶液中盐的存在或其浓度改变可能影响目标分析物的相间分配，因此考察NaCl的量对萃取效率的影响。NaCl的用量分别为0、0.10、0.15、0.20、0.25g时，随着用量的增加，目标化合物的峰面积不断增大，当加入的氯化钠的量为0.20g时，目标化合物的峰面积达到最大；超过0.20g时，其峰面积略有减少。因此，本实验中加入NaCl的量为0.20g。

[0054] 实施例10

[0055] 对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇超声使其完全溶解，制成每1ml含90μg的溶液，即得盐酸小檗碱对照品溶液；

[0056] 供试品溶液的制备：

[0057] 取杞黄胶囊粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（10:0.1）混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2.5ml，水浴挥干，以水稀释至5ml，加1M 盐酸或1M氢氧化钠调节pH值，并加入适量NaCl。将制备好的纳米粒子/有机溶剂正丁醇的中空纤维棒放入上述溶液中，以一定速度进行搅拌，萃取一段时间后，取出中空纤维棒，用清洗剂清洗两次，弃除清洗液，加入一定量洗脱剂在超声波清洗器的作用下超声洗脱一定时间，弃去中空纤维棒，洗脱液经过0.22µm微孔滤膜滤过后，即得；

[0058] 色谱条件：以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（50:50）（每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调pH值为4.0）为流动相，检测波长为346nm，流速为1ml/min。

[0059] 本品每粒以盐酸小檗碱（C20H18ClNO4）计，含小檗碱（C20H17NO4）不得少于1.67mg，表小檗碱（C20H17NO4）不得少于0.23 mg，黄连碱（C19H13NO4）不得少于0.39 mg，巴马汀（C21H21NO4）不得少于0.4mg。