一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensD2WM及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM及制备方法和应用，步骤是：A、芽孢杆菌的分离纯化：接种斜面后，保藏；B、芽孢杆菌的初筛：采用点接法和平板对峙法，先后选出对欧文氏菌和油茶病害有拮抗作用的菌株。C、芽孢杆菌的复筛：采用管碟法。将初筛有拮抗作用的菌株在LB液体培养基中培养，通过拮抗菌发酵液及无菌滤液筛选出同时对欧文氏菌和油茶主要病害有拮抗作用的菌株。该解淀粉芽孢杆菌在制备治疗或预防蔬菜软腐病、油茶病害中药物中的应用，具有广谱拮抗作用，生长速度快，对于一般细菌、真菌大大缩短了培养时间，降低了生产成本，能高效拮抗油茶炭疽病、油茶叶斑病、油茶黑斑病、油茶溃疡病等多种病害，且抑菌效果显著。

权利要求

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM，CCTCC No：M2015623。

2.权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防蔬菜软腐病药物中的应用；

所述的蔬菜为青椒、红椒、莴苣、土豆、瓠瓜、白菜。

3.权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防油茶病害药物中的应用；

所述的油茶病为油茶炭疽病、油茶叶斑病、油茶软腐病、油茶黑斑病、油茶溃疡病。

说明书

一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM及

制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物保护领域，更具体涉及一种能同时拮抗蔬菜软腐病和油茶主要病害的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM，同时还涉及一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM的制备方法，还涉及一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防蔬菜软腐病及油茶病药物中的用途。

背景技术

[0002] 蔬菜软腐病又称水烂、烂疙瘩，除危害十字花科蔬菜(如萝卜、大白菜等)外，还可危害马铃薯、番茄、莴苣、黄瓜、芹菜和葱类等蔬菜，引起不同程度的损失。蔬菜软腐病发病初期，病部为水浸状半透明，后扩大为淡灰褐色湿腐，病部组织黏滑，失水后表面下陷，常溢出白色菌浓，并有恶臭，后期蔬菜整个软化，全部烂掉，请见(易图永.蔬菜软腐病[J].湖南农业，2015(2)：28-29.)欧文氏菌(Erwinia)是引起植物软腐病发生的主要病原菌，它属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，主要包括胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种(Erwinia carotovora ssp.carotovora，Ecc)、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种(Erwinia carotovora ssp.atroseptica，Eca)和菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi，Ech)三个亚种，请见(Pérombelon M.Potato diseases caused by soft rot Erwinias:an overview of pathogenesis[J].Plant pathology.2002,51(1):1-12.)其中，Eca的专一性较强，主要侵染温带土豆；Ecc在自然条件下寄主范围和地理分布最为广泛，可以侵染土豆、胡萝卜、芹菜、黄瓜、辣椒和菊苣等植物，遍布亚热带和温带等地；Ech则可侵染土豆、大丽花和玉米等，请见(Toth I K,Bell K S,Holeva M C,et al.Soft rot erwiniae:from genes to genomes[J].Molecular plant pathology.2002,4(1):17-30.)近年来，蔬菜种植规模不断扩大，蔬菜病害逐步引起重视，其中尤以蔬菜软腐病发生严重，造成的损失巨大。

[0003] 油茶(Camellia oleifera)属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)，是我国特有的一种高级油料作物，主要生长于中国南方亚热带地区高山及丘陵地带，是重要的木本油料树种之一，请见(庄瑞林.中国油茶[M].北京：中国林业出版社，2008.)油茶种子含大量优质的不饱和脂肪酸和维生素E，是一种在优质、耐储藏的高级食用油，在食用油中占重要地位；另外，茶油在医药、工业上也应用广泛，可作为肥皂、凡士林、防锈油、润滑油等的原料；茶枯可做农药，也是优质的有机肥料，还是提取栲胶、皂素、糠醛、活性炭等产品的原料，提取后的固体残渣可作为猪的精饲料。可以说，油茶全身都是宝，具有很好的应用开发前景，对促进农民增收、加快山区综合发展、维护国家粮油安全等方面有非常重要的作用。

[0004] 油茶病害种类繁多，其危害也愈发严重。油茶炭疽病、叶枯病、软腐病是由病原物引起的3种毁灭性病害，在我国各油茶产区普遍发生，油茶的地上各部位均可受害，主要引起落 果、落蕾、枝梢枯死、枝干溃疡、甚至整株死亡，请见(束庆龙，张良富.中国油茶栽培与病虫害防治[M]..北京：中国林业出版社，2009.)同样，油茶根腐病、茶饼病、黑斑病、溃疡病等也时常发生，每年油茶产业因病害造成了巨大的经济损失。近年来，湖北油茶种植规模不断扩大，相应的病害逐步引起重视。

[0005] 然而，目前对蔬菜软腐病和油茶主要病害的防治普遍通过种植抗性品种和化学防治来控制，过多使用化学杀菌剂有危害人类身体健康、药物残留破坏生态环境、引发病原物产生抗药性、影响蔬菜和茶油质量和食用安全等诸多缺点，不利于蔬菜和油茶产业的绿色可持续发展。寻求安全、高效和经济的生物源农药已成为当前防治蔬菜和油茶病害的热点和当务之急，其中拮抗微生物在植物病害生物防治中起到十分重要的作用。

[0006] 在植物病害的生物防治中研究和应用较多的微生物主要有细菌类、真菌类和放线菌。芽孢杆菌(Bacilus)是一类理想的生防菌筛选对象，在目前生防细菌中研究较多。它能够抑制植物根部、枝干、叶、花和果实等各个部位的病害，应用范围很广。因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的孢子，因此十分利于生防芽孢杆菌在环境中的定殖与繁殖及其发酵菌液的生产加工，请见(班慧芳.转aiiA基因魔芋的软腐病抗性及魔芋内生菌产生抑菌蛋白的组成分析[D].华中农业大学，2009.)和(柴鑫莉，周盈，林拥军，等.苏云金芽胞杆菌抗软腐病aiiA基因转花魔芋研究[J].分子植物育种，2007，5(5)：613-618.)。目前的生防芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterlum)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)以及蜡状芽孢杆菌(B.cereus)等。孙明等发明了一种对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌BSn5及抑菌蛋白APn5(申请号：200710053427.8)，该枯草芽孢杆菌的抑菌活性物质是蛋白APn5，只能拮抗胡萝卜软腐欧文氏菌亚种，其生防范围较窄；黄静等公开了一种解淀粉芽孢杆菌Lh-1在防治棉花黄萎病、大白菜软腐病、青枯病、桃树腐烂病、苹果腐烂病等方面的应用(申请号：201410735508.6)，需利用解淀粉芽孢杆菌与壳寡糖组合成微生态菌剂，比较而言只对棉花黄萎病的防治效果较好；刘君昂等公开了一种拮抗油茶病害的短短芽孢杆菌Z26，能够有效抑制油茶炭疽病菌、根腐病、半边疯等病原菌的生长(申请号：201110027957.1)，该生防菌剂对油茶炭疽病的最大抑制率达到83.4％，还有进一步提高的空间；周国英等发明了一种有效防治油茶病害的复合微生物源农药及应用方法(申请号：201310203845.6)，公开发明了一种由放线菌球孢链霉菌球孢亚种和细菌短短芽孢杆菌及其他助剂复配的微生物农药，可防治油茶一种或几种主要病害，该复配的微生物农药制备过程相对繁琐，耗时较长；也有利用枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌ML1分别在花生果腐病和魔芋软腐病防治上的相关报道(申请号：201310708367.4，申请号：201510015310.5)。然而，关于解淀粉芽孢杆菌能同时在蔬菜软腐病及油茶主要病害上的防治研究及应用报道很少。另外，文献报道多为针对油茶某一种病害的单一防治，目前市面基本没有可以同时防治两种以上油茶病害效果很好的单一菌剂产品，且还未见对防治油茶黑斑病及油茶溃疡病两种病害的报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的是在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM，该解淀粉芽孢杆菌从健康油茶根际土壤分离筛选获得，能同时高效的防治蔬菜软腐病和油茶主要病害，是一株具有广谱拮抗作用的生防芽孢杆菌，填补了单一微生物菌剂同时防治欧文氏菌三个亚种和多种油茶病原真菌的技术空白，对软腐病及油茶无公害防治具有一定的实际意义。

[0008] 本发明的另一个目的是在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM生防菌剂的制备方法，方法易行，操作简便。菌剂经如下步骤得到：将LB平板或者斜面上的D2WM菌落挑取一环移植到试管活化，35℃摇床培养16h，转速
150rpm，试管中LB液体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0；活化后的菌液按照1％-3％的接种量移植到装有100mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，转速
150rpm，35℃摇床培养10h-24h，当菌含量大于2×108cfu/mL以上即可获得发酵菌液，储存作为生防菌剂。该生防菌剂制作容易，生长速度快，液体培养代谢产物只需要在液体培养基中培养10-24h即可获得很好的拮抗效果，相对于一般细菌、真菌大大缩短了培养时间，降低了生产成本。

[0009] 本发明还有一个目的是在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防蔬菜软腐病药物中的应用，该生防菌株可同时治疗或预防凡是能由欧文氏菌引发的蔬菜软腐病，包括青椒、红椒、莴苣、土豆、瓠瓜、白菜软腐病等。对胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种和菊欧文氏菌三个亚种均有很好的拮抗作用。

[0010] 本发明的第4个目的是在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防油茶主要病害药物中的应用，该菌株的生防菌剂可高效防治油茶炭疽病、叶斑病、黑斑病、溃疡病等，液体发酵滤液抑菌率实验表明，该解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM对油茶主要病害的抑菌率达到95％以上。

[0011] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

[0012] 其技术构思是：采用常规法进行分离、纯化和保存对软腐病和油茶主要病害同时有拮抗作用的生防菌株。请见(姚丽瑾，王琦，付学池，等.小麦纹枯病生防芽孢杆菌的筛选及鉴定[J].中国生物防治，2008，24(1)：53-57.)。以实验室分离到的软腐病菌为指示菌，分离得到的菌株为待检菌，将分离纯化到细菌利用点接法依次筛选，初步确定对欧文氏菌有拮抗作用的菌株，同时采用平板对峙法进一步筛选其中能同时拮抗油茶病原菌的拮抗细菌。点接法和平板对峙法请见( T,Banhegyi I,Herpai Z,et al.Isolation of Bacillus strains from the rhizosphere of cereals and in vitro screening for antagonism against phytopathogenic,food-borne pathogenic and spoilage micro-organisms[J].Journal of Applied Microbiology,2000,89(5):840-846.)然后分别采用管碟法和发酵法进行复筛，将进一步筛选到的菌株分别在LB液体培养基中培养24h后，培养液用0.22μm细菌过滤器过滤得到培养滤液。将涂布有100μL软腐病病原菌(约1×107cfu/mL)的LB琼脂平板上等距离用打孔器打直径为7mm的孔。每个孔中接入50μL拮抗菌发酵液，以无菌水为对照，每个处理三次重复。在30℃恒温箱中培养24h后测量抑菌圈直径，根据数值大小确定拮抗程度。筛选出对软腐病病原菌有拮抗作用的菌株。同时，分别将初筛拮抗菌滤液与约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。5天后测量病原菌菌落直径。筛选出对油茶主要病害有拮抗作用的菌株。最终确定D2WM对软腐病原菌和油茶主要病害的拮抗作用最强，筛选得到效果明显且稳定的1株拮抗菌D2WM。管碟法和发酵法请见(姚丽瑾,王琦,付学池,等.小麦纹枯病生防芽孢杆菌的筛选及鉴定[J].中国生物防治,2008,24(1):53-57.)。

[0013] 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM的制备方法，其步骤是：

[0014] A、芽孢杆菌的分离纯化：取健康油茶根际土样10g加入到盛有90mL无菌水和30-50颗玻璃珠的三角瓶中，制成1：10浓度的悬浮液，在28℃，180rpm摇床中振荡20-30min后，将菌悬液放置在75-85℃水浴中保持12-18min。将l mL土壤悬浮液移入盛有9mL无菌水的试管中，制成10-2菌悬液，依次类推，获得10-3，10-4，10-5以及10-6菌悬液。梯度稀释后，吸取100μL稀释倍数为10-3-10-6的菌悬液均匀涂布在分离培养基--牛肉膏蛋白胨培养基上，培养基配方如下(1L)：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。将涂布有菌悬液的平板置于30℃培养箱中1周，24h后随即观察分离培养基上菌落状态，用三步划线发进行分离纯化，统一编号登记。菌种保藏：接种斜面后，可在4℃短暂保藏。
用50％(V/V)甘油作为保护剂，可在-80℃长久保藏。

[0015] B、芽孢杆菌的初筛：先采用点接法，取100μL病原菌菌液(约1×107cfu/ml)均匀涂布LB平板上，然后用无菌牙签在每个平板上点接四个参试菌株(依次选择D1WM、D2WM、D3WM…D30WM中的4个菌株)，每个处理设置三个重复。在30℃以及37℃恒温箱中培养20-28h。同时采用平板对峙法进一步筛选其中能同时拮抗油茶病原菌的拮抗细菌，将打好直径为7mm的病原菌饼放置PDA平板中心，然后用无菌牙签蘸取待测菌等距离(距平板中央
1.5cm)点接拮抗菌，置于28℃恒温培养箱培养，5天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复三次，进一步筛选抑菌直径大于5mm的菌株。

[0016] C、芽孢杆菌的复筛：采用管碟法复筛。将初筛有拮抗作用的菌株在LB液体培养基中以150rpm适温培养20-28h，发酵液以8000rpm离心10min，上清用0.22μm微孔滤膜过滤至灭菌EP管中。将涂布有100μL病原菌(约1×107cfu/mL)的LB琼脂平板上等距离用打孔器打直径为7mm的孔。每个孔中接入50μL发酵液，以无菌水为对照，每个处理设置三次重复。 在30℃恒温箱中培养20-28h后测量抑菌圈直径，根据数值大小确定拮抗程度。筛选出对软腐病菌菌株有拮抗作用的菌株。同时，分别将初筛拮抗菌滤液与约50℃的PDA固体培养基按照
1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。5天后测量病原菌菌落直径。筛选出对油茶主要病害有拮抗作用的菌株。最终筛选得到拮抗效果明显且稳定的一株拮抗菌D2WM，一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM。

[0017] 所述的一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

[0018] 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM有如下特征：该菌株在形态和培养特征方面：菌体杆状，周生鞭毛，并具有运动性；菌落为乳白色，呈近圆形，表面粗糙有褶皱，边缘不规则，不产生可溶性色素。

[0019] 申请人从健康油茶根际土壤筛选得到一株细菌，结合生理生化特征和分子特征鉴定为解淀粉芽孢杆菌，并命名为Bacillus amyloliquefaciens D2WM。该菌株Bacillus amyloliquefaciens D2WM已于2015年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO: M 2015623。

[0020] 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防蔬菜软腐病中药物中的应用，其应用基本过程是：

[0021] A、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM对蔬菜软腐病抑菌圈实验：采用管碟法考察解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM发酵液对欧文氏菌的拮抗作用。分别取一环菌落置于灭菌的液体LB培养基中，35℃摇床培养12h，转速150rpm，即得到胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种和菊欧文氏菌
3种病原菌及拮抗菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM菌体发酵液，各取100μL病原菌发酵液涂布于LB固体培养基中，用无菌打孔器均匀打三个7mm的孔，将拮抗菌解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM发酵液或发酵液用无菌水稀释10倍，分别向孔内加入
50μL发酵液或稀释后发酵液，加入无菌水的处理作为空白对照，35℃培养24h后观察拮抗菌对3种病原菌抑菌圈的大小。

[0022] B、采用平板对峙培养法研究解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM对油茶主要病害的拮抗作用。将打好直径为7mm的病原菌饼放置平板中心，然后用无菌牙签蘸取待测菌等距离(距平板中央1.5cm)点接拮抗菌，置于28℃恒温培养箱培养，5天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复3次。

[0023] C、采用发酵液培养法研究解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM对油茶主要病害的拮抗作用。Bacillus amyloliquefaciens D2WM菌落经LB液体培养基培养12h后，10000r/min室温离心20min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，取拮抗菌滤液与灭菌后约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为
7mm 的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。5天后测量病原菌菌落直径。无菌滤液抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－0.7)×100％。

[0024] 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防蔬菜软腐病中药物中的应用，它包括：

[0025] 所述的一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防由欧文氏菌引发的蔬菜软腐病的药物中的应用，包括青椒、红椒、莴苣、土豆、瓠瓜、白菜软腐病等。

[0026] 所述的一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防油茶主要病害药物中的应用，所述的油茶病为油茶炭疽病、油茶叶斑病、油茶软腐病、油茶黑斑病、油茶溃疡病。

[0027] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

[0028] 1.本发明的菌株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM，分离自油茶健康植株根际土壤，具有稳定的生态环境和生防作用。

[0029] 2.本发明的生防菌剂制作容易，生长速度快，液体培养代谢产物只需要在液体培养基中培养10-24h即可获得很好的拮抗效果，相对于一般细菌、真菌大大缩短了培养时间，降低了生产成本。

[0030] 3.该菌定植力强，同时对多种蔬菜软腐病和多种油茶主要病害均有很强的拮抗作用，具有良好的开发应用前景。

[0031] 4.本发明的生防菌株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM，可通过单一菌株同时防治欧文氏菌3类亚种和多种油茶病害，包括鲜未报到的油茶叶斑病、油茶黑斑病和油茶溃疡病，抗菌谱广泛，可有效降低防治成本。

[0032] 5.平板拮抗实验表明：该解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM对油茶主要病害具有明显的抑制作用。

[0033] 6.液体培养代谢产物抑菌率实验表明，该解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM对油茶主要病害的抑菌率达到95％以上。

附图说明

[0034] 图1为一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM菌落和显微形态示意图。

[0035] 图2为一种D2WM与其他菌株的16S rDNA基因序列系统发育树示意图。

[0036] 图3为一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM菌株对欧文氏菌的 抑菌圈效果图；

[0037] 图4为一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM菌株对油茶主要病原菌的平板对峙拮抗作用示意图。

[0038] 图5为一种pH对拮抗菌发酵无菌滤液拮抗效果的影响示意图。

[0039] 图6为一种温度对拮抗菌发酵无菌滤液拮抗效果的影响示意图。

[0040] 附图说明：一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM菌株在形态和培养特征方面：菌体杆状，周生鞭毛，并具有运动性；菌落为乳白色，呈近圆形，表面粗糙有褶皱，边缘不规则，不产生可溶性色素。如图1所示。对该菌株进行分子鉴定，将测得的16S rDNA序列(片段长度为1439bp)与GenBank数据库中序列进行BLAST分析，选取9株菌株用ClustalX 2.1进行多序列比对分析，利用MEGA6.0软件采用邻接法进行系统发育树构建和聚类分析，MEGA6的Neighbor-Joining法构建系统进化树，如图2所示。结合上述形态和部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌株D2WM属于解淀粉芽孢杆菌。采用管碟法考察解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM 20倍稀释后发酵液对欧文氏菌的拮抗作用，其抑菌效果见图3。结果表明，该生防菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种和菊欧文氏菌3个亚种均具有很好的抑菌效果，稀释10倍后的拮抗菌发酵液抑菌圈达到22mm以上。采用平板对峙培养法研究该解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM对多种油茶病原菌的拮抗作用，结果见图4，该拮抗菌对油茶炭疽病、叶斑病、黑斑病和溃疡病均有很好的拮抗作用，尤其是对油茶炭疽病、叶斑病、黑斑病效果显著。图5和6分别为pH和温度对拮抗菌发酵无菌滤液拮抗效果的影响示意图。结果表明该无菌滤液酸碱耐受范围很广，在pH在1-11范围内对软腐病原菌均有一定的抑制效果，并且在pH＝9时，其抑制效果最佳，证明偏碱性的环境更有利于无菌滤液中的有效成分发挥拮抗作用。另外，该无菌滤液在20℃到60℃范围内保留抑菌活性且在40℃时其拮抗效果最佳，当温度高于80℃时，抑菌活性丧失，说明该无菌滤液中的有效成分不能耐高温，有可能是蛋白类的物质。

具体实施方式

[0041] 本发明所用的试剂或原料，均购自商业渠道。

[0042] 菌株来源：欧文氏菌Erwinia carotovora  ssp.carotovora、Erwinia chrysanthemi、Erwinia carotovora ssp.Atroseptica，同文献中报道菌株(葛玮珍.魔芋软腐病发病过程动态研究及基于QS系统的防治研究[M].2013)；油茶胶胞炭疽病Colletotrichum.gloeosporioides，同文献中报道菌株(孟庆敏，周国英，刘君昂，等.油茶炭疽病拮抗细菌Y13主要抑菌物质分离纯化及作用方式[J].植物保护，2014，40(2)：36-42.)；油茶炭疽病Colletotrichum nicotianae同文献中报道菌株(李东升，张一扬.烟草炭疽病的形态特征和致病性研究[J].湖南农业科学，2009(5)：97-98.)；油茶叶斑病Phyllosticta capitalensis，同文献中报道菌株(马成,彭 丽娟,吴石平.银杏叶点霉叶斑病病原菌鉴定[J].贵州农业科学,2014,42(12):126-128.)；油茶软腐病Agaricodochium camellia，同文献中报道菌株(赵丹阳,秦长生,廖仿炎.5种杀菌剂对油茶软腐病的防治研究[J].广东林业科技,2013,29(2):28-31.)；油茶黑斑病Altermaria alternate同文献中报道菌株(Kobiler I,Akerman M,Huberman L,et al.采前与采后处理结合控制柿子贮藏过程中链格孢菌(Alternaria alternata)引起的黑斑病的研究[J].保鲜与加工,2011,5:
025.)，油茶溃疡病Bothyosphaeria dothidea，同文献中报道菌株(Slippers B,Crous P W,Denman S,et al.Combined multiple gene genealogies and phenotypic characters differentiate several species previously identified as Botryosphaeria dothidea[J].Mycologia,2004,96(1):83-101.)

[0043] 实施例1：

[0044] 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM的制备方法，其步骤是：

[0045] A、芽孢杆菌的分离纯化：取健康油茶根际土样10g加入到盛有90mL无菌水和30-50颗玻璃珠的三角瓶中，制成1：10浓度的悬浮液，在28℃，180rpm摇床中振荡30min后，将菌悬液放置在80℃水浴中保持15min。将l mL土壤悬浮液移入盛有9mL无菌水的试管中，制成10-2菌悬液，依次类推，获得10-3，10-4，10-5以及10-6菌悬液。梯度稀释后，吸取100μL稀释倍数为10-3-10-6的菌悬液均匀涂布在分离培养基--牛肉膏蛋白胨培养基上，培养基配方如下(1L)：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4。将涂布有菌悬液的平板置于30℃培养箱中1周，24h后随即观察分离培养基上菌落状态，用三步划线发进行分离纯化，分离到30株菌株统一编号登记如下：D1WM、D2WM、D3WM…D30WM。菌种保藏：接种斜面后，可在4℃短暂保藏。用50％(V/V)甘油(上海振兴化工一厂)作为保护剂，可在-80℃长久保藏。

[0046] B、芽孢杆菌的初筛：分别取100μL软腐病病原菌菌液(约1×107cfu/ml)均匀涂布LB平板上，然后用无菌牙签在每个平板上点接四个参试菌株(依次选择D1WM、D2WM、D3WM…D30WM中的4个菌株)，每个处理设置三个重复。在30℃以及37℃恒温箱中培养24h。获得其中对欧文氏菌有拮抗作用的5株菌株D2WM、D9WM、D14WM、D21WM、D29WM。同时采用平板对峙法进一步筛选其中能同时拮抗油茶病原菌的拮抗细菌，将打好直径为7mm的病原菌饼放置PDA平板中心，然后用无菌牙签蘸取待测菌等距离(距平板中央1.5cm)点接拮抗菌，置于28℃恒温培养箱培养，3天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复3次，进一步筛选抑菌直径大于5mm的菌株。通过上述两步初筛共获得3株同时对软腐病和油茶主要病害有拮抗效果的菌株D2WM、D9WM、D21WM。

[0047] C、芽孢杆菌的复筛：将初筛有拮抗作用的菌株在LB液体培养基中以150rpm，30-37℃条件下培养24h，发酵液以8000rpm离心10min，上清用0.22μm微孔滤膜过滤至灭菌EP管7
中。将涂布有100μL病原菌(约1×10cfu/mL)的LB琼脂平板上等距离用打孔器打直径为7mm的孔。每个孔中接入50μL发酵液，以无菌水为对照，每个处理设置三次重复。在30℃ 恒温箱中培养24h后测量抑菌圈直径，根据数值大小确定拮抗程度。筛选出对软腐病菌菌株有拮抗作用的菌株。同时，分别将初筛拮抗菌滤液与约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却至20-25℃后在平板中央放入直径为7mm的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。5天后测量病原菌菌落直径。筛选出对油茶主要病害有拮抗作用的菌株。最终筛选得到拮抗效果明显且稳定的1株拮抗菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens D2WM)。

[0048] 通过上述的制备获得了一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM，在解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

[0049] 该菌株Bacillus amyloliquefaciens D2WM已于2015年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为M2015623。

[0050] 一种同时对蔬菜软腐病和油茶主要病害具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM，CCTCC NO：M2015623的鉴定：

[0051] A、一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM的形态学和生理生化特征：

[0052] 该菌株在形态和培养特征方面：菌体杆状，周生鞭毛，并具有运动性；菌落为乳白色，呈近圆形，表面粗糙有褶皱，边缘不规则，不产生可溶性色素。如图1所示。在生理生化鉴定方面：属于革兰氏染色阳性菌，具有接触酶活性，能水解淀粉，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖产酸，能利用柠檬酸盐，能够水解酪素并使明胶液化，能够还原石蕊牛奶和硝酸盐，V-P反应阳性，不具有卵磷脂酶活性，不能水解马尿酸盐和酪氨酸，不能利用葡萄糖产气。

[0053] B、一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM的分子学鉴定：

[0054] 对菌株D2WM进行分子鉴定，将测得的16S rDNA序列(片段长度为1439bp)与GenBank数据库中序列进行BLAST分析，选取9株菌株用ClustalX 2.1进行多序列比对分析，利用MEGA6.0软件采用邻接法进行系统发育树构建和聚类分析，MEGA6的Neighbor-Joining法构建系统进化树，如图2所示。菌株D2WM与GenBank中登录号为HM107808.1(Bacillus amyloliquefaciens strain 15)菌株的同源性达到99％。依据16S rDNA分类标准，一般认为16S rDNA序列同源性大于97％，可认为属于同一个种，结合上述形态和部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌株D2WM属于解淀粉芽孢杆菌。

[0055] 实施例2：

[0056] 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防蔬菜软腐病药物中的应用，其步骤是：

[0057] A、一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在治疗或预防蔬菜软腐病中药物中生防菌剂的制备，其步骤是：将LB平板或者斜面上的D2WM菌落挑取一环移植到试管活化，35℃摇床培养16h，转速150rpm，试管中LB液体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0；活化后的菌液按照1％-3％的接种量移植到装有100mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，转速150rpm，35℃摇床培养10h-24h，当菌含量大于2×8
10cfu/mL以上即可获得发酵菌液，储存作为生防菌剂。

[0058] B、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM生防菌剂对蔬菜软腐病抑菌圈实验：采用管碟法考察解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM发酵液对欧文氏菌的拮抗作用。分别取一环菌落置于灭菌的液体LB培养基中，35℃摇床培养12h，转速150rpm，即得到胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种和菊欧文氏菌3种病原菌发酵液，各取100μL病原菌发酵液涂布于LB固体培养基中，用无菌打孔器均匀打三个7mm的孔，分别向孔内加入50μL解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM生防菌剂的10倍稀释液，加入无菌水的处理作为空白对照，35℃培养24h后观察拮抗菌对3种病原菌抑菌圈的大小，其抑菌效果见图3。结果表明，该生防菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种和菊欧文氏菌3个亚种均具有很好的抑菌效果，抑菌圈达到22mm以上。

[0059] 所述的蔬菜为青椒、红椒、莴苣、土豆、瓠瓜、白菜等。

[0060] 实施例3：

[0061] 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制备治疗或预防六种油茶病原菌药物中的应用，其步骤是：

[0062] A、一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在治疗或预防六种油茶病原菌药物中生防菌剂的制备，其步骤是：将LB平板或者斜面上的D2WM菌落挑取一环移植到试管活化，35℃摇床培养16h，转速150rpm，试管中LB液体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0；活化后的菌液按照1％-3％的接种量移植到装有100mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，转速150rpm，35℃摇床培养10-24h，当菌含量大于2×108cfu/mL以上即可获得发酵菌液，储存作为生防菌剂。

[0063] B、一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM与多种油茶病原菌体外互作研究：采用平板对峙培养法。将打好直径为7mm的病原菌饼放置平板中心，然后用无菌牙签蘸取待测菌等距离(距平板中央1.5cm)点接拮抗菌，置于28℃恒温培养箱培养，5天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复3次。结果见表1和图4。结果表明Bacillus amyloliquefaciens D2WM对油茶炭疽病、叶斑病、软腐病、黑斑病和溃疡病均有很好的拮抗作用，尤其是对油茶炭疽病、叶斑病、黑斑病和溃疡病效果显著。

[0064] 表1 Bacillus amyloliquefaciens D2WM对油茶主要病害的抑制直径

[0065]

[0066]

[0067] 表中数据为平均值±标准差(下同)，抑制直径＝未处理病原菌直径-处理后病原菌直径

[0068] 采用发酵液培养法。A步骤得到的生防菌剂经过10000r/min室温离心20min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，取拮抗菌滤液与灭菌后约50℃的PDA固体培养基按照1:
19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。5天后测量病原菌菌落直径。无菌滤液抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－0.7)×100％。

[0069] 表2显示Bacillus amyloliquefaciens D2WM拮抗菌对油茶主要病害的抑菌率均达到95％以上，尤其是对叶点霉的抑菌率达到100％。系列结果表明Bacillus amyloliquefaciens D2WM抗菌谱广，是一株针对油茶主要病害的高效生防菌株。

[0070] 表2 Bacillus amyloliquefaciens D2WM无菌滤液对油茶主要病害的抑菌率[0071]

[0072] 所述的油茶病原菌具体为油茶炭疽病菌、油茶炭胶胞疽病菌、油茶叶斑病菌、油茶软腐 病菌、油茶黑斑病菌、油茶溃疡病菌。

[0073] 实施例4：

[0074] 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM发酵液抗菌物质特性研究。

[0075] 酸碱稳定性测定：将拮抗菌发酵液经无菌滤器过滤得到无菌滤液，吸取5mL转入无菌试管中，用1M氢氧化钠或者盐酸调pH值分别至1、3、5、7、9、11、13，静置1h后，测试其对软腐病原菌的抑制作用。以原始的发酵无菌滤液作为对照，每个处理重复3次。对软腐病原菌的拮抗效果如图5所示。该无菌滤液酸碱耐受范围很广，在pH1-11范围内对软腐病原菌均有一定的抑制效果，并且在pH＝9时，其抑制效果最佳，证明偏碱性的环境更有利于无菌滤液中的有效成分发挥拮抗作用。

[0076] 热稳定性测试：将拮抗菌发酵液经无菌滤器过滤得到无菌滤液，取无菌滤液5mL转入无菌试管中，分别在温度为20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下处理2h，测试其对软腐病原菌的抑制作用。每个处理重复3次。对软腐病原菌的拮抗效果如图6所示。结果表明该无菌滤液在20℃到60℃范围内保留抑菌活性且在40℃时其拮抗效果最佳，当温度高于80℃时，抑菌活性丧失，说明该无菌滤液中的有效成分不能耐高温，有可能是蛋白类的物质。