一种克拉维酸高产菌株的高通量可视化筛选方法

摘要

本发明公开了一种克拉维酸高产菌株的高通量可视化筛选方法。首先将两种不同荧光蛋白分别与克拉维酸合成基因簇的早期基因和晚期基因融合，获得出发重组菌株；然后诱变该重组菌株，利用突变菌产生荧光强度的变化来判断克拉维酸合成基因簇是否发生突变。初筛采用肉眼观察菌落荧光强度，选择荧光强度较大的菌落；复筛选取初筛获得的菌落，经培养后提取全细胞蛋白，用酶标仪测定荧光强度，获得克拉维酸合成基因簇高水平表达的突变菌株，最后通过发酵验证突变株的克拉维酸发酵水平。本发明的筛选方法降低了筛选的随机性和盲目性，大幅度降低劳动量，提高了筛选通量和有效性。

权利要求

1.一种克拉维酸高产菌株的高通量可视化筛选方法，其特征在于，步骤如下：(1)将两种不同荧光蛋白分别与克拉维酸合成基因簇的早期基因和晚期基因融合，构建基于工业菌株的重组菌株作为诱变筛选的出发菌株；

(2)将出发菌株在固体培养基上进行扩大培养，收集孢子，并用物理或化学的方法对孢子进行诱变；

(3)将诱变后的孢子经稀释后涂布在固体培养基上，进行分离培养，暗室中直接观察单菌落的荧光强度，选择荧光强度大于出发菌株的单菌落进行复筛；

(4)将进行复筛的突变株接种于装有液体培养基的深孔板中，摇床培养，离心，弃去上清液保留菌丝，加入裂解液处理，得到全细胞蛋白裂解液，测定全细胞蛋白裂解液的荧光强度，选择两种不同荧光蛋白荧光强度较出发菌株均有提高的菌株进行摇瓶发酵筛选，获得克拉维酸高产菌株；

所述克拉维酸合成基因簇的早期基因是cas；晚期基因是gcas。

步骤(4)中，液体培养基装液量为深孔板体积的5～20％；接种量为106～107个孢子/ml；

摇床培养条件为：20～30℃、200～250rpm摇床培养3～6天。

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述两种不同荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

3.如权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，将绿色荧光蛋白与克拉维酸合成基因簇的早期基因融合表达，将红色荧光蛋白与克拉维酸合成基因簇的晚期基因融合表达。

4.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中，所述固体培养基为：麦芽提取物6～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖3～6g/L、琼脂粉20g/L、pH 7.5～8.5、

0.15MPa灭菌30min。

5.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，对孢子进行诱变的物理方法包括紫外线、同位素照射或等离子注入法；化学方法为NTG处理。

6.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中，培养的条件为：20～30℃、RH50～70％培养3～10天。

7.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中，所述液体培养基为：大豆蛋白提取物10～20g/L、酵母提取物5～10g/L、麦芽糊精10～20g/L、磷酸氢二钾0.5～1.0g/L、pH 7.0～8.0、0.15MPa灭菌30min。

8.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中，选择两种不同荧光蛋白荧光强度均较出发菌株提高1.5倍以上的菌株进行摇瓶发酵筛选。

9.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，用于测定荧光强度的激发光波长为300～600nm；发射光波长为400～600nm。

说明书

一种克拉维酸高产菌株的高通量可视化筛选方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物育种和生物技术领域，具体涉及一种克拉维酸高产菌株的高通量可视化筛选方法。

背景技术

[0002] 克拉维酸(clavulanic acid)是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种次级代谢产物，克拉维酸的抗菌活性很弱，但具有不可逆的β-内酰胺酶抑制活性，能够抑制耐药微生物菌株对β-内酰胺抗生素的分解。在临床上，克拉维酸常与阿莫西林或替卡西林联合用药，从而提高该抗生素对耐药菌株的抗菌活性，提高临床疗效。目前克拉维酸的工业生产方式为微生物发酵，因此，筛选并获得具备较高发酵水平的克拉维酸高产菌株具有非常重要的工业价值。

[0003] 野生型棒状链霉菌合成克拉维酸的能力很低，无法满足现代工业化生产需要，目前生产克拉维酸的工业菌株都是通过多轮诱变筛选得到的诱变株。但是常规诱变筛选方法的工作量非常庞大，效率较低，周期很长，是制约发酵工业生产技术提高的一个瓶颈。因此，开发一种克拉维酸高产菌株的高通量筛选方法具有非常重要的实际应用价值。

发明内容

[0004] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于用荧光蛋白表征克拉维酸基因簇表达水平的高通量可视化筛选方法。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 一种克拉维酸高产菌株的高通量可视化筛选方法，步骤如下：

[0007] (1)将两种不同荧光蛋白分别与克拉维酸合成基因簇的早期基因和晚期基因融合，构建基于工业菌株的重组菌株作为诱变筛选的出发菌株；

[0008] (2)将出发菌株在固体培养基上进行扩大培养，收集孢子，并用物理或化学的方法对孢子进行诱变；

[0009] (3)将诱变后的孢子经稀释后涂布在固体培养基上，进行分离培养，暗室中直接观察单菌落的荧光强度，选择荧光强度大于出发菌株的单菌落进行复筛；

[0010] (4)将进行复筛的突变株接种于装有液体培养基的深孔板中，摇床培养，离心，弃去上清液保留菌丝，加入裂解液处理，得到全细胞蛋白裂解液，测定全细胞蛋白裂解液的荧光强度，选择两种不同荧光蛋白荧光强度较出发菌株均有提高的菌株进行摇瓶发酵筛选，获得克拉维酸高产菌株。

[0011] 步骤(1)中，所述两种不同荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

[0012] 优选的，步骤(1)中，将绿色荧光蛋白与克拉维酸合成基因簇的早期基因融合表达，将红色荧光蛋白与克拉维酸合成基因簇的晚期基因融合表达。

[0013] 步骤(1)中，所述克拉维酸合成基因簇的早期基因和晚期基因的基因序列和基因位置为现有技术中已知的，记载在Song JY,Jensen SE,Lee KJ.Clavulanic acid biosynthesis and genetic manipulation for its overproduction.Applied Microbiology Biotechnology.201088(3):659-669.

[0014] 步骤(2)和步骤(3)中，所述固体培养基为：麦芽提取物6～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖3～6g/L、琼脂粉20g/L、pH 7.5～8.5、0.15MPa灭菌30min。其中，麦芽提取物和酵母提取物均为常规的市售产品。

[0015] 步骤(2)和步骤(3)中，培养的条件为：20～30℃、RH50～70％生化培养箱中培养3～10天。

[0016] 步骤(2)中，对孢子进行诱变的物理方法包括紫外线、同位素照射或等离子注入法；化学方法为NTG处理。

[0017] 步骤(4)中，所述液体培养基为：大豆蛋白提取物10～20g/L、酵母提取物5～10g/L、麦芽糊精10～20g/L、磷酸氢二钾0.5～1.0g/L、pH 7.0～8.0、0.15MPa灭菌30min。

[0018] 步骤(4)中，液体培养基装液量为深孔板体积的5～20％；接种量为106～107个孢子/ml；摇床培养条件为：20～30℃、200～250rpm摇床培养3～6天。

[0019] 步骤(4)中，离心的条件为：3000～5000rpm离心5～10min。

[0020] 步骤(4)中，所述深孔板为12孔或24孔板；深孔板的板盖由带孔的不锈钢盖子、除菌滤膜片和硅胶孔垫组成，可以保证各深孔独立地与外界交换空气。

[0021] 步骤(4)中，测定全细胞蛋白裂解液的荧光强度的方法为：将全细胞蛋白裂解液用裂解缓冲液稀释，采用酶标仪测定，用于测定荧光强度的激发光波长为300～600nm，最适激发光波长为395nm和558nm；发射光波长为400～600nm，最适发射光波长为509nm和583nm。

[0022] 所述裂解缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液和HEPES缓冲液中的一种。裂解缓冲液的pH为6.5～8.5，裂解缓冲液浓度为0.05～0.2mol/L。

[0023] 步骤(4)中，选择两种不同荧光蛋白荧光强度均较出发菌株提高1.5倍以上的菌株进行摇瓶发酵筛选。

[0024] 本发明的有益效果：

[0025] 本发明使用融合两种不同荧光蛋白的重组菌株作为诱变筛选的出发菌株，结合平板菌落、深孔板液体培养和荧光强度检测，大通量、快速化筛选出克拉维酸基因簇发生正突变的菌株。本发明筛选工作的效率高，通过观察荧光强度变化可以排除克拉维酸合成基因簇未发生正突变的无效突变菌株，降低了筛选的随机性和盲目性，大幅度降低劳动量，提高了筛选通量和有效性。

具体实施方式

[0026] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

[0027] 实施例1：UV诱变棒状链霉菌出发菌株和初筛

[0028] 1.出发菌株的构建：

[0029] 分别将绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白与克拉维酸合成基因簇的早期基因(cas)和晚期基因(gcas)融合，构建基于棒状链霉菌工业菌株的重组菌株作为诱变筛选的出发菌株。上述早期基因(cas)和晚期基因(gcas)的基因序列和基因位置为现有技术中已知的，记载在Song JY,Jensen SE,Lee KJ.Clavulanic acid biosynthesis and genetic manipulation for its overproduction.Applied Microbiology Biotechnology.201088(3):659-669。荧光蛋白与克拉维酸合成基因簇的早期基因和晚期基因融合，以及重组棒状链霉菌菌株的构建采用的均为通用的基因工程技术(如参考“基因工程原理和技术”，邹克琴，浙江大学出版社)，为现有技术的常规技术手段。

[0030] 2.UV诱变棒状链霉菌出发菌株：

[0031] 将出发菌株在固体培养基上进行扩大培养，收集出发菌株的孢子，用无菌生理盐6 8
水制成孢子悬液，振荡分散，棉花过滤后收集单孢子悬液，稀释至10～10个/ml，吸取2ml于无菌平皿中。用30W紫外灯，30～40cm灯距照射1～5min。

[0032] 固体培养基的组成为：麦芽提取物6g/L、酵母提取物2g/L、葡萄糖4g/L、琼脂粉20g/L、pH 8.5、0.15MPa灭菌30min。

[0033] 3.初筛：

[0034] 适当稀释诱变孢子，涂布在固体培养基平板上，25℃、RH 60％培养3～5天，计算致死率。选择经过合适致死时间照射的诱变孢子，稀释至每100ul孢子悬液含5～20个存活孢子，涂布在固体培养基平板上，25℃、RH 60％培养4天。

[0035] 选取单菌落数为5～20个的平板，在菌落未产孢前在暗室中直接观察菌落的荧光强度。本实施例一共观察460块菌落数合适的培养平板，分析菌落数约5700个，根据统计数据，菌落荧光强较出发菌株菌落变大的数量为830个，说明正突变率大约为14.5％。

[0036] 实施例2：突变菌株的菌体蛋白荧光强度测定和复筛

[0037] 挑取实施例1中830株荧光强度较大的菌落，编号M1～M830，固体培养并收集孢子，稀释至108个/ml。

[0038] 按照下列配方配制液体培养基：大豆蛋白提取物20g/L、酵母提取物8g/L、麦芽糊精15g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、pH 7.5、0.15MPa灭菌30min。

[0039] 按照下列配方配制裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、0.5％SDS、1mg/ml溶菌酶、150mM NaCl。

[0040] 在35块24孔深孔板的每个微孔中加入液体培养基500ul，接种50ul稀释孢子，25℃、200rpm摇床培养4天。然后置于孔板离心机，3000rpm离心10min，弃去上清液保留菌丝，每孔加入500ul裂解液处理30min获得全细胞蛋白，3000rpm离心10min，吸取上清液适当稀释后转移到黑色微孔板，用多功能酶标仪进行检测。用于测定细胞蛋白溶液荧光强度的激发光波长为395nm和558nm；发射光波长为509nm和583nm。比较各样品荧光值与出发菌株的差异，并横向比较各样品间的差异，挑选荧光值较高的菌株，结果见表1。

[0041] 克拉维酸基因簇发生正突变的判断方法为：395nm波长激发下在509nm处具有较大荧光强度，说明样品中绿色荧光蛋白含量较高，表征早期基因的表达水平升高；558nm波长激发下在583nm处具有较大荧光强度，说明样品中红色荧光蛋白含量较高，表征晚期基因的表达水平升高。若绿色荧光蛋白和红色荧光强度都升高，表明克拉维酸基因簇在整体水平发生了正突变，可能是克拉维酸的高产突变株。

[0042] 表1 部分突变棒状链霉菌的荧光强度平均值检测结果

[0043]菌株 相对值 菌株 相对值 菌株 相对值