鸡翻毛性状相关的分子标记及其应用

摘要

本发明公开了一个鸡翻毛性状相关的分子标记及其应用，属于生物技术领域，在E22C19W28_E50C23区域鸡的KRT基因连锁群（genbank序列号AADN03009152.1）第56648位碱基处有一个A56648‑G56648的碱基替换，该替换引起SNP多态性，通过采用检测引物在该位点碱基替换情况来作鸡标记辅助选择关联分析，判断鸡翻毛性状。

权利要求

1.鸡翻毛性状相关的分子标记，其特征在于：核苷酸序列如序列表序列1 和2 所示，在序列3 所示序列的第117 位碱基处有一个A117-G117 的碱基替换，其中用于检测序列3 所示序列的第117 位碱基处有一个A117-G117 的碱基替换的引物对的DNA 序列如下所示：正向引物：5′ -TGATGACCTACGGAACAACC-3′，反向引物：5′ -ATGGCAATGGATGGCTGA -3′。

2.权利要求1 所述的鸡翻毛性状相关的分子标记的应用，其特征在于：应用于与鸡翻毛相关性状标记辅助选择的关联分析上。

3.一种辅助鉴定翻毛鸡中的基因型为AA的翻毛基因纯合子、基因型为AG的翻毛基因杂合子或基因型为GG的平毛基因纯合子的方法：a 提取待测鸡的基因组DNA ；

b对鸡E22C19W28_E50C23KRT 基因连锁群区域设计引物；

c 以基因组DNA为模板，用设计引物对进行PCR 扩增，得到PCR 扩增产物，PCR 产物直接测序，对测序结果进行比对，对突变位点和翻毛性状进行相关分析验证，从而获得权利要求1中所述引物对；

d．用权利要求1中所述的引物对，以待测鸡的基因组DNA为模板，进行PCR 扩增，测定产物核苷酸序列，从而判断待测鸡是翻毛基因纯合子，还是翻毛基因杂合子或平毛基因纯合子。

说明书

鸡翻毛性状相关的分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于家禽基因工程中的分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为鸡标记辅助选择关联分析的与鸡翻毛性状相关的分子标记及其在关联分析中应用。

背景技术

[0002] 近年来，随着分子遗传学和生物技术的发展，鸡分子生物学水平上的研究也越来越多。我国是一个讲究美食的国家，对鸡的青睐，源于千百年来养成的饮食习惯，禽产品的消费市场以鲜活为主，注重产品外部性状，要求产品具有很好的买相，如羽毛颜色、形状等。这些性状虽无直接经济价值，但由于我国不同地区长期形成的消费习惯，就导致了对某种性状的偏爱，情愿出较高的价钱购买，从而就形成了间接的经济性状。

[0003] 鸡主要有平毛、丝毛和翻毛三个羽毛类型，翻毛鸡类似于人的卷发，不仅外观美，还具有一定的抗热性。目前，翻毛鸡品种选育和商品化生产面临着一些技术难题，主要问题是翻毛性状的保持。由于翻毛性状由共显性基因控制，纯合翻毛基因型和杂合半翻型很难通过表型选育，使得翻毛鸡群体难以纯化。所以，利用常规育种手段，选择的周期长，进展缓慢。此外，要想纯化翻毛群体，需要通过测交的方法检出杂合个体。当对某一待测个体进行测交时，需观测到5 个以上的后代均为翻毛时，才有95％的把握认定待测个体基因型为显性纯合。这样需要进行大量的测交，不仅延长选育的周期，还造成很高的财力、人力负担。因此，分离克隆影响鸡的翻毛性状的新基因并寻找重要的分子标记用于鸡标记辅助选择，对加速鸡新品种的选育，加快我国养鸡业的发展具有极其重要的意义。分子标记(DNA Molecular marker)技术的发展完善，为家禽改良提供了新的手段，利用分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)对基因型进行辅助选择，可以充分利用表型、系谱和遗传标记的信息，与只利用表型和系谱信息的常规选种方法相比，具有更大的信息量，优越性非常明显。因此，标记辅助选择越来越受到重视，并不断地被应用到家禽育种的实践中去。目前，在鸡的选育中已发现和应用了一些DNA分子标记，如鸡鱼腥味（FMO3）基因、绿壳（SLCO1B3)基因和矮小(dw)基因等。

[0004] 与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有很多优点：在鸡的基因组中变异丰富、标记的数量几乎是无限的；不影响鸡目标性状的表达，与不良性状没有连锁关系、能够快而简便的检测标记与鸡相关性状的相关性。广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

发明内容

[0005] KRT75相关基因在毛发和指甲发育中发挥重要作用，但是其功能研究还不是很透彻，本发明通过寻找该基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础，基于此，本发明提供了作为鸡标记辅助选择的与鸡翻毛性状相关的分子标记，并将该分子标记作为鸡的标记辅助选择的应用。

[0006] 本发明通过以下技术方案实现：

[0007] 鸡翻毛性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

[0008] 更具体地，在SEQ ID NO：1所示序列的第117位碱基处有一个A117-G117的碱基替换，该替换引起SNP多态性。

[0009] 其中用于检测SEQ ID NO：1所示序列的第117位碱基处有一个A117-G117的碱基替换的引物对的DNA序列如下所示：

[0010] 正向引物：5′-TGATGACCTACGGAACAACC-3′，

[0011] 反向引物：5′-ATGGCAATGGATGGCTGA -3′。

[0012] 前述鸡翻毛性状相关的分子标记按如下方法构建：

[0013] a 提取待测鸡的基因组DNA；

[0014] b 鸡E22C19W28_E50C23KRT基因连锁群区域设计引物。

[0015] c以基因组DNA 为模板，用设计引物对进行PCR 扩增，得到PCR 扩增产物， PCR 产物直接测序，对测序结果进行比对，对突变位点和翻毛性状进行相关分析验证，从而找到上述引物对；

[0016] d 利用上述引物进行扩增，测定产物核苷酸序列。

[0017] 本发明的鸡翻毛性状相关的分子标记可用于应用于与鸡翻毛相关性状标记辅助选择的关联分析上。

[0018] 本发明还提供了了一种辅助鉴定翻毛鸡中的翻毛基因纯合子(AA)、翻毛基因杂合子(AG) 和平毛基因纯合子(GG) 的方法，包括如下步骤：

[0019] a 提取待测鸡的基因组DNA；

[0020] b以基因组DNA 为模板，用所述引物对进行PCR 扩增，得到PCR 扩增产物；

[0021] c 根据PCR 产物测序鉴定PCR 扩增直接测序，测定产物核苷酸序列，从而判断是待测鸡为候选是翻毛基因纯合子，还是翻毛基因杂合子和平毛基因的纯合子。

[0022] 本发明保护所述引物对在辅助鉴定翻毛鸡中的翻毛基因纯合子(AA)、翻毛基因杂合子(AG) 和平毛基因纯合子(GG)中的应用。

[0023] 所述的引物对可用于制备辅助鉴定翻毛鸡中的翻毛基因纯合子、翻毛基因杂合子和平毛基因纯合子的试剂盒。

[0024] 所述引物对，所述方法或所述试剂盒均可用于翻毛鸡育种。如需对翻毛鸡进[0025] 行选育以提高纯度，该标记可用以对翻毛位点的变化进行跟踪，从而在选育后代中保持翻毛性状。

[0026] 本发明还保护一种翻毛鸡育种方法，是采用翻毛鸡中的翻毛基因纯合子进行[0027] 育种。

[0028] 本发明可以弥补常规育种方法的不足，缩短育种周期，提高育种的准确性。本发明的优点：(1) 建立在翻毛基因精细定位的基础之上，在定位区域内找到1个SNP位点，该标记与翻毛性状显著关联，根据标记基因型推断个体为翻毛的准确性大于94％； (2) 不受性别限制；(3)本发明在个体雏鸡阶段即可推断出个体表型及基因型，可以早选择早淘汰，可缩短育种时间，加快育种进程，节省饲养成本。

附图说明

[0029] 图1：是本发明中鸡E22C19W28_E50C23区域KRT基因连锁群用于定位的DNA片段。所用的引物序列用方框标注(括号内为突变的碱基)。

[0030] 图2是本发明中鸡E22C19W28_E50C23区域KRT基因连锁群用于定位的DNA片段测序图，基因型AA。

[0031] 图3是本发明中鸡E22C19W28_E50C23区域KRT基因连锁群用于定位的DNA片段测序图，基因型AG。

[0032] 图 4 是本发明中鸡 E22C19W28_E50C23 区域KRT基因连锁群用于定位的DNA片段测序图，基因型GG。

具体实施方式

[0033]  下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。

[0034] 实施例1、鸡E22C19W28_E50C23区域鸡的KRT基因连锁群A117G 突变位点的特异性引物设计

[0035] 修水黄羽乌鸡是我国著名的翻毛鸡品种，因翻毛基因为显性基因，所以群体中仍存在部分携带隐性基因的杂合子。翻毛基因纯合子之间产生的后代，翻模性状不发生分离，都是翻毛。翻毛基因纯合子和翻毛基因杂合子之间会产生约1:1的翻毛基因纯合子和翻毛基因杂合子，从而使非翻毛基因传代下去。翻毛基因杂合子之间产生的后代，会出现平毛的个体。

[0036] 一、SNP多态的发现

[0037] 在测序时发现一个与翻毛性状显著关联的SNP 标记。在E22C19W28_E50C23区域鸡的KRT基因连锁群（genbank序列号AADN03009152.1）第56648位碱基处有一个A56648-G56648的碱基替换，该替换引起SNP多态性。

[0038] 二、引物对的设计

[0039] 在鸡E22C19W28_E50C23 KRT基因连锁群区域设计引物，以基因组DNA 为模板，用上述引物对进行PCR 扩增，得到PCR 扩增产物，PCR 产物直接测序，对测序结果进行比对，对突变位点和翻毛性状进行关联分析并验证，从而得到一对用于检测鸡翻毛A117G 突变位点的PCR 引物。

[0040] 上游引物F：5′-TGATGACCTACGGAACAACC-3′（SEQ IDNO.1）

[0041] 下游引物R：5′-ATGGCAATGGATGGCTGA -3′（SEQ ID NO.2）。

[0042] 上游引物由20个碱基组成，对应E22C19W28_E50C23区域鸡的KRT基因连锁群（genbank序列号AADN03009152.1）第56745-56764；下游引物由18个碱基组成，对应AADN03009152.1的56349-56366位碱基序列。引物扩增片段长短416bp。

[0043] 实施例2、修水黄羽乌鸡的翻毛基因PCR扩增和测序

[0044] 260只修水黄羽乌鸡：购自江西省修水县。

[0045] 1、提取基因组DNA

[0046] 各个样本翅静脉采血，提取高盐法提取基因组DNA。

[0047] 具体过程如下：

[0048] (1) 配置溶液，用于待测鸡的基因组DNA提取

[0049] 溶液A ：50mM Tris·Cl (pH 8.0)，5mM EDTA (pH 8.0)，20％ SDS，室温保存。溶液B ：氯仿:异戊醇(24:1)，遮光保存。

[0050] 1) 取100μl 鸡血到1.5 mL离心管

[0051] 2) 加600μL溶液A到1.5 mL离心管。

[0052] 3）向各个1.5 mL离心管中加10 μL的ProK(20 mg/mL)，充分混匀。

[0053] 4）55℃水浴消化过夜。

[0054] 5）向各个离心管中加入等体积的Tris饱和酚，摇动混匀15min， 12000r/min离心10min。

[0055] 6）将上层清液取出，装入新的离心管中，重复上述步骤。

[0056] 7）取上层清液，加入等体积的酚: 溶液B (1:1)混匀10min，12000r/min离心10min。

[0057] 8）取上层清液加入等体积的溶液B，混匀10min离心12000 r/min，10min。

[0058] 9）取上层清液加入2倍体积的冰乙醇(约 1 mL)再加1/10 体积的约60μL的NaAc水平摇动，可见絮状的DNA样品出现。

[0059] 10）将样品置于-20℃冷冻30 min，取出或挑出DNA或离心，12000r/min，10min，DNA沉于管底。

[0060] 11）用75%乙醇洗涤DNA，摇动洗涤后，离心12000 r/min，5-10min。

[0061] 12）弃去75%乙醇，自然干燥后，加入适量(约100μL)TE溶解。

[0062] 13) -20℃保存( 基因组DNA)。

[0063]  2、以基因组DNA 为模板，用实施例1 设计的引物对进行PCR 扩增，得到PCR 扩增产物。PCR 反应体系(25μl)  ：2.5μl 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，)，1μl dNTPs(ATP、TTP、GTP、CTP 的浓度均为
2.5mmol/L)，1μl引物（0.5μM），0.25μl 2.5U/μL Taq DNA 聚合酶，60ng模板。PCR反应条件： 
95℃5min， 94℃30 s，56℃30s，72℃30s， 33个循环，72℃10min，4℃保存。

[0064] 3、将PCR 扩增产物测序

[0065] PCR产物采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。测序结果表明：AA 基因型个体的PCR 扩增产物的核苷酸序列图2 所示；AG基因型个体的PCR 扩增产物的核苷酸序列图3 所示；GG 基因型个体的PCR 扩增产物核苷酸序列图4。