固相萃取液质联用法测定葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的方法

摘要

本发明公开了一种固相萃取液质联用法测定葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的方法，包括先调节待测葡萄酒的pH值，用乙腈对酒样进行液液萃取，加入氯化钠待溶液盐析后用固相萃取柱萃取乙腈层，通过固相萃取柱洗脱，收集净化后的洗脱液，继而转入旋转蒸发仪浓缩，用氮气吹干浓缩液，通过乙腈水溶液回溶后，注入液质联用仪进行分析，即获得葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的含量的步骤。该方法具有有机溶剂用量少、萃取速度快、杂质干扰少、样品回收率高等突出优点，可为葡萄酒建立有效的农药安全限量的控制及风险管理提供技术支撑。

权利要求

1.一种固相萃取液质联用法测定葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的方法，包括如下步骤：(1)绘制甲霜灵、多菌灵的标准曲线

A.分别以甲霜灵、多菌灵溶液制成梯度标准系列溶液，

B.调节步骤A中各个溶液pH值，用乙腈进行液液萃取，

C.加入氯化钠，待溶液盐析分层后，用氨基固相萃取柱对乙腈层进行萃取，利用洗脱液对固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，转入旋转蒸发仪浓缩后用氮气吹干，D.通过乙腈水溶液回溶后，注入液质联用仪进行分析，获得葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的含量，超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪测定条件为：色谱柱：Inertsil C8，5μm，

150mm*2.1内径；流动相为0.3％乙酸水溶液(A)和0.3％乙酸的乙腈溶液(B)梯度洗脱：

0.00min，A:B＝95:5；2.00min，A:B＝50:50；5.00min，A:B＝10:90；13.00min，A:B＝10:90；

13.01min，A:B＝95:5；15.00min，A:B＝95:5；柱温：30℃；

E.将目标化合物的浓度对色谱峰面积对应，即得到校准后的标准曲线；

(2)以待测葡萄酒样品为试样，采用步骤(1)中A-E的方法，得到待测葡萄酒样品中的样品测定值，将该测定值对照标准曲线后，计算得到葡萄酒中多菌灵及甲霜灵含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)B中，采用0.5mol/L氢氧化钠调节待测样品酸碱度，调节pH＝8.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)C中，采用氨基固相萃取柱萃取，其洗脱条件为：甲苯：乙腈＝3:1，洗脱剂用量15mL，分三次淋洗。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)D中，采用80％的乙腈水溶液进行回溶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)D中，洗脱液用氮气吹干后，溶解在1mL 80％乙腈的水溶液中，取20μL溶液进液质联用仪进行分析。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)和(2)先后顺序可换。

说明书

固相萃取液质联用法测定葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及产品安全与检测技术领域，具体涉及一种固相萃取液质联用法检测葡萄酒中农残的方法。

背景技术

[0002] 葡萄酒是由新鲜葡萄或葡萄汁发酵后制得，葡萄酒中富含多种营养物，如氨基酸、维生素、β-谷甾醇、多酚和矿质元素等，适当饮用葡萄酒可以预防疾病，增强人体健康。然而在葡萄的病虫害防治过程中，经常喷施杀虫剂、杀菌剂和除草剂等农药。一般而言，农药的残效期比较长，且伴有一定的毒性，这样残留的农药会通过食物链最终进入人体，给人体健康带来潜在的危害。

[0003] 随着检测技术及食品质量安全要求的提高，近两年对葡萄酒中农残的报道日益增多。而葡萄在病虫防害中常用到多菌灵、甲霜灵等农药，其中，多菌灵(Carbendazim，MBC)，化学名称为N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸酯，是一种广谱、内吸附性杀菌剂，可以有效预防葡萄白腐病、黑痘病、炭疽病等。甲霜灵(metalaxyl)，属苯基酰胺类高效低毒内吸性杀菌剂，化学名称：D,L-N-(2,6二甲基苯基)-N-(2'-甲氧基乙基)氨基丙酸甲酯，主要应用于葡萄酒霜霉病菌、疫霉病菌和腐病菌的防治，但这两种农药对人体均有致癌或导致遗传性疾病风险，所以研究葡萄酒中甲霜灵、多菌灵可行性检测方法，对维护国内外葡萄酒行业规范及健康发展具有现实意义。

[0004] 目前对于葡萄酒中农残—甲霜灵、多菌灵等农残项目检测没有具体的国家检测标准或相关专利，文献中报道主要涉及气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法/气质联用法、液相色谱/质谱联用分析法等，前处理方法主要采用液/液萃取(Liquid/liquid extraction,LLE)、加速溶剂萃取(Accelerate solvent extraction,ASE)、固相微萃取(Solid phase microextration,SPME)及固相萃取柱萃取(Solidphase extration,SPE)等，但葡萄酒样品成分杂、基质干扰大，若前处理不当，极易影响检测结果。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的问题是提供固相萃取液质联用法测定葡萄酒中甲霜灵、多菌灵含量的定量方法，其分析流程包括样品的预处理方法和目标化合物的检测方法，适用于葡萄酒中相关农残的检测，其结果可为葡萄酒中多菌灵、甲霜灵的安全限量控制提供参考。

[0006] 为了解决前述的技术问题，本发明提供技术方案是：

[0007] 一种固相萃取液质联用法测定葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的方法，包括如下步骤：

[0008] (1)绘制多菌灵、甲霜灵的标准曲线

[0009] A.分别以多菌灵、甲霜灵标准溶液制成梯度标准系列溶液，

[0010] B.调节步骤A中各个溶液pH值，用乙腈进行液液萃取，

[0011] C.加入氯化钠，待溶液盐析分层后，用氨基固相萃取柱对乙腈层进行萃取，利用洗脱液对固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，转入旋转蒸发仪浓缩后用氮气吹干，[0012] D.通过乙腈水溶液回溶后，注入液质联用仪进行分析，获得葡萄酒中甲霜灵、多菌灵的含量，

[0013] E.将目标化合物的浓度对色谱峰面积对应，即得到校准后的标准曲线；

[0014] (2)以待测葡萄酒样品为试样，采用步骤(1)中A-E的方法，可以得到待测葡萄酒样品中的样品测定值，将该测定值对照标准曲线后，可计算得到葡萄酒中多菌灵及甲霜灵含量。

[0015] 优选的技术方案是：步骤(1)B中，采用0.5mol/L氢氧化钠调节待测样品酸碱度：调节pH＝8。

[0016] 优选的技术方案是：步骤(1)C中，采用氨基固相萃取柱萃取，其洗脱条件为：甲苯：乙腈＝3:1，洗脱剂用量15mL，分三次淋洗。

[0017] 优选的技术方案是：步骤(1)D中，采用80％乙腈水溶液进行回溶。

[0018] 优选的技术方案是：步骤(1)D中，测定条件为：色谱柱：Inertsil C8，5μm，150mm*2.1(内径)或相当者。流动相为0.3％乙酸水溶液(A)和0.3％乙酸的乙腈溶液(B)梯度洗脱，柱温：30℃。

[0019] 优选的技术方案是：步骤(1)D中，洗脱液经氮气吹干后，溶解在1mL、80％乙腈水溶液中，取20μL溶液进液质联用仪进行分析。

[0020] 本发明考虑到所选目标化合物多菌灵(carbendazim，CAS No.10605-21-7)、甲霜灵(Metalaxyl，CAS No.57837-19-1)的化学性质及水相、油相亲和力的差别，开发出一种适合葡萄酒中农残检测的分析方法：先调节酒样pH值，用乙腈对酒样进行液液萃取，加入氯化钠盐析分层后，取乙腈层通过固相萃取柱净化，旋转蒸发、氮吹后富集目标物，通过乙腈水溶液回溶后，用液相色谱-四极杆串联质谱联用仪(LC-MS)对目标化合物进行检测。

[0021] 相对于现有技术方案，本发明的优点是：

[0022] 1.本发明技术方案建立了适合葡萄酒中农残项目甲霜灵、多菌灵检测的萃取技术程序，即由液相色谱-四极杆串联质谱联用仪进行目标化合物的定性定量分析，可适用于葡萄酒样品中目标化合物的含量测定。

[0023] 2.该方法具有高灵敏性、有机溶剂用量少、萃取速度快、杂质干扰少、样品回收率高等突出优点，可作为葡萄酒建立有效的农药安全限量的控制及风险管理提供技术支撑。

[0024] 3.该方法能有效克服葡萄酒检测中成分复杂、基质干扰大等因素，同时待测物净化充分、回收率高，能够满足高通量、高灵敏的快速检测需求。附图说明：

[0025] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

[0026] 图1A为甲霜灵色谱峰面积对浓度的标准曲线y＝2.05e+006x+1.77e+005，相关系数γ＝0.9992(0.0～5.0μg/L)；

[0027] 图1B为多菌灵色谱峰面积对浓度的标准曲线y＝2.68e+006x+6.56e+004，相关系数γ＝0.9993(0.0～5.0μg/L)；

[0028] 图2为正离子模式下采集标样的组分图；2A为甲霜灵、多菌灵标样谱图，2B为甲霜灵标样谱图，2C为多菌灵标样谱图。

[0029] 图3为待测液总离子流图。3A为待测酒样中甲霜灵、多菌灵谱图，3B为待测酒样中甲霜灵谱图，3C为待测酒样中多菌灵谱图。具体实施方式：

[0030] 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

[0031] 实施例：固相萃取液相色谱-四极杆串联质谱联用仪测定干红葡萄酒中多菌灵、甲霜灵含量的方法研究。

[0032] 1材料和方法

[0033] 1.1仪器与试剂：

[0034] API TripleQuad 4500超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪(AB SCIEX公司)，XS105天平(Mettler Toledo)，NH2固相萃取柱(1g/6ml，美国waters公司)。

[0035] 多菌灵(carbendazim，CAS No.10605-21-7，标准品)，甲霜灵(Metalaxyl，CAS No.57837-19-1，标准品)，乙腈(Acetonitrile，HPLC级)，氯化钠(Sodium chloride，GR级)，甲苯(Methylbenzene，HPLC级)，蒸馏水实验室自制。

[0036] 1.2仪器条件

[0037] 超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪测定条件为：色谱柱：Inertsil C8，5μm，150mm*2.1(内径)；流动相为0.3％乙酸水溶液(A)和0.3％乙酸的乙腈溶液(B)梯度洗脱：
0.00min，A:B＝95:5；2.00min，A:B＝50:50；5.00min，A:B＝10:90；13.00min，A:B＝10:90；
13.01min，A:B＝95:5；15.00min，A:B＝95:5；柱温：30℃。

[0038] 表1色谱梯度洗脱条件

[0039]时间/min 流速/(mL/min) 0.3％乙酸水溶液/(％) 0.3％乙酸的乙腈溶液/(％)
00:00:01 0.25 95 5
00:02:00 0.25 50 50
00:05:00 0.25 10 90
00:13:00 0.25 10 90
00:13:01 0.25 95 5
00:15:00 0.25 95 5

[0040] 1.3分析测定

[0041] 1.3.1样品提取

[0042] 准确称取2.0000g样品(精确至1mg)于10mL具塞比色管中，用0.5mol/L氢氧化钠调节待测样品pH至7.5，加入8mL乙腈漩涡1min混匀，加3g氯化钠，漩涡1min混匀，于4500r/min，离心5min，分层后，吸取上清液4mL待净化。

[0043] 1.3.2样品净化

[0044] 加入2.5g无水硫酸钠于NH2固相萃取柱中，先用5mL甲苯+乙腈(3+1)进行预洗柱，当液面达到硫酸钠顶部时，将1.3.1中待净化液进行固相萃取，并用15mL具塞管接收，然后分别用5mL甲苯+乙腈(3+1)洗涤样瓶3次，再将洗涤液移入固相萃取柱中，合并具塞管中样液，并于45℃水浴条件下，旋转蒸发浓缩至约0.5ml。将浓缩液置于氮吹仪上，45℃水浴条件下氮吹至近干，迅速加入80％乙腈水溶液回溶，超声混匀，经0.22μm有机滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱测定。

[0045] 1.3.3校准曲线的建立

[0046] 校准曲线的绘制：通过基质配标，由多菌灵、甲霜灵标准储备液按照7点校正配制0.000～5.0μg/L，得到目标化合物的浓度对应响应值(峰面积)的线性关系。

[0047] 标准曲线以待测目标化合物的浓度(μg/L)为横坐标，测定值(峰面积)为纵坐标制作标准曲线，图1A为甲霜灵色谱峰面积对浓度的标准曲线(y＝2.05e+006x+1.77e+005，r＝0.9992)，(0.0～5.0μg/L)；图1B为多菌灵色谱峰面积对浓度的标准曲线(y＝2.68e+006x+
6.56e+004，r＝0.9993)，(0.0～5.0μg/L)。

[0048] 1.3.4质谱条件

[0049] 离子源：EI源；

[0050] 扫描模式：多反应监测；

[0051] 优化的去簇电压和碰撞能量参数如下表所示：

[0052] 表2质谱采集参数

[0053]

[0054] 1.3.5样品加标回收率的测定

[0055] 实验过程中采用基质加标进行配制标准曲线，以控制整个实验过程中是否有人为或环境因素带来的污染，验证实验过程的准确性。以浓度0.2μg/L，0.4μg/L，2.0μg/L的目标化合物制备标准小样，进行回收率实验，另以相同基质样品做空白实验，测定结果为：多菌灵空白加标回收率在60～90％，RSD为2.2～12.6％，甲霜灵空白加标回收率在80～105％，RSD为2.0～8.2％。

[0056] 2结果与讨论

[0057] 如图2是正离子模式下采集标样的组分，图3是待测液总离子流图。

[0058] 2.1待测样品pH条件的确定

[0059] 表3干红葡萄酒中不同pH条件下多菌灵、甲霜灵空白加标回收率测定结果[0060]

[0061] 本实施例考察了不同pH条件下对多菌灵、甲霜灵的萃取效果，由表3所示，在pH＝8.0时，所测样品中多菌灵回收率达80.2％，甲霜灵的回收率达94.1％，且回收率稳定，能够满足葡萄酒中多菌灵、甲霜灵的检测需求。因此，本实施例选用pH＝8.0作为葡萄酒中甲霜灵、多菌灵检测的前处理酸碱度调节。

[0062] 2.2萃取溶剂的选定

[0063] 本实施例先调节酒样pH＝8.0，然后考察正己烷、乙酸乙酯、乙腈三种萃取溶剂对葡萄酒中多菌灵、甲霜灵的萃取效果的影响。

[0064] 表4不同固相萃取剂的测试结果

[0065]

[0066] 由表4可见，选用乙腈萃取，目标成分平均回收率均优于乙酸乙酯、正己烷。因此，本实施例选用乙腈作为萃取溶剂。

[0067] 2.3固相萃取柱比较

[0068] 分别考察了氨基固相萃取柱与石墨化碳/氨基复合固相萃取柱两种固相萃取柱对甲霜灵、多菌灵、甲霜灵的萃取效果。

[0069] 表5不同固相萃取柱的测试结果

[0070]

[0071] 石墨化碳黑在去除色素等杂质上优于氨基固相萃取柱，但对目标物有一定的吸附作用；样品经过乙腈萃取后，用氨基固相萃取柱足以去除待测酒样的色素等杂质，由表5可见，氨基固相萃取柱萃取效果优于石墨化碳/氨基复合固相萃取柱。因此，本实施例选用氨基固相萃取柱。

[0072] 3结论

[0073] 3.1样品提取

[0074] 本实施例以多菌灵、甲霜灵为目标化合物，取2.0000g酒样(精确至1mg)，用0.5mol/L氢氧化钠调节pH至8.0，加入8mL乙腈漩涡1min混匀后，加2.0g氯化钠，漩涡混匀，于4500r/min，离心5min，待溶液分层后，吸取上清液4mL待净化。

[0075] 3.2样品净化

[0076] 加入2.5g无水硫酸钠于NH2固相萃取柱中，先用5mL甲苯+乙腈(3+1)进行预洗柱，当液面达到无水硫酸钠顶部时，将3.1中待净化液进行固相萃取，并用15mL具塞管接收，然后分别用5mL甲苯+乙腈(3+1)洗涤样瓶3次，再将洗涤液移入固相萃取柱中，合并收集在具塞管中的样液，并于45℃水浴条件下，旋转蒸发浓缩至约0.5ml。将浓缩液置于氮吹仪上，45℃水浴条件下氮吹至近干，迅速加入80％乙腈水溶液回溶，超声混匀，经0.22μm有机滤膜过滤后，取20μL待测液注入液相色谱-串联质谱仪测定。该方法对多菌灵空白加标回收率在60～90％，RSD为2.2～12.6％，甲霜灵空白加标回收率在80～105％，RSD为2.0～8.2％。可针对葡萄酒中农残多菌灵、甲霜灵实验安全限量与产品安全进行评价。

[0077] 上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。