血清SHBG蛋白作为肺结核病血清标志物及其应用转让专利
申请号 : CN201510653780.4
文献号 : CN105223364B
文献日 : 2018-02-23
发明人 : 何敏 , 李翠萍 , 何晓 , 李洪涛 , 臧宁
申请人 : 广西医科大学
摘要 :
一种血清SHBG(Sex hormone‑binding globulin)蛋白作为肺结核病人血清标志物及其应用，所述血清SHBG蛋白在涂阴、涂阳肺结核和耐多药肺结核病人血清中表达水平明显增高，可利用iTRAQ结合MALDI‑TOF/MS技术检测，质谱检测SHBG蛋白5条肽段在涂阴、涂阳肺结核和耐多药肺结核病人血清中表达水平明显高于肺炎病人和正常人的血清中表达水平，ELISA和免疫组织化学也验证SHBG蛋白在肺结核病人血清和组织中高表达。适用于肺结核病血清的辅助检测，发病机制研究和抗结核病药物开发。
权利要求 :
1.一种SHBG蛋白在制备用于肺结核患者血清标志物检测试剂中的应用，其特征在于，利用iTRAQ结合MALDI-TOF/MS技术检测涂阴肺结核患者，涂阳肺结核患者，耐多药肺结核患者，肺炎患者和正常人的血清，SHBG蛋白所含五个肽段IALGGLLFPASNLR、QAEISASAPTSLR、LPLVPALDGCLR、SCDVESNPGI FLPPGTQAEFNLR和WHQVEVK，在涂阴、涂阳和耐多药肺结核患者血清中表达水平明显高于肺炎患者和正常人的血清中表达水平，ELISA检测SHBG蛋白在涂阴、涂阳、耐多药肺结核患者血清中高表达，免疫组织化学检测SHBG蛋白在肺结核组织中高表达。
说明书 :
血清SHBG蛋白作为肺结核病血清标志物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种血清标志物的应用，具体为一种血清SHBG蛋白作为肺结核病人血清标志物及其应用。
背景技术
[0002] 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，潜伏期4～8周，其中80％发生在肺部。我国属于全球22个结核病高负担国家之一，患病人数仅次于印度，位居世界第二位，除了患病人数多，我国结核病耐药的严重程度在全球范围内仅次于俄罗斯，耐药性泛滥将会使结核病控制返回到无化疗时代，而当今世界约有三分之二的结核病人处于发生耐多药的危险之中。因此，结核病和耐药结核病已成为我国严重的公共卫生和社会问题。由于目前临床常规的痰涂片和痰培养检测结核杆菌的方法，存在检出率低和/或培养时间长等问题，远不能满足临床检测的需求；同时目前临床的抗结核病药物治疗存在耐药，肝功损害、胃肠道不适、过敏等副作用，以及抗痨药物修复病灶能力差，后遗症等问题，因此，开发新的疾病标志物，对结核病的防治具有重要意义。近年来，随着质谱技术的飞速发展和蛋白质组学研究的深入，产生了血清定量蛋白组学新技术，该技术旨在应用质谱技术筛选和鉴定不同疾病循环血清中的标志物，利用该技术已经发现和确定了许多新的疾病标志物，为进一步揭示疾病的致病机制，引导新的药物靶标的发现提供了重要的线索，本发明就是血清定量蛋白组学技术在结核病研究中的新发现。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种血清SHBG蛋白作为肺结核病人血清标志物及其应用，解决现有技术存在的检出率低和/或培养时间长的问题，同时解决目前临床的抗结核病药物治疗存在耐药，肝功损害、胃肠道不适、过敏等副作用，以及抗痨药物修复病灶能力差，后遗症的问题。适用于肺结核病血清辅助检测，发病机制研究和抗结核病药物开发。
[0004] 本发明的技术方案是：一种血清SHBG(Sex hormone-binding globulin)蛋白作为肺结核病人血清标志物，是利用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)结合MALDI-TOF/MS技术检测涂阴肺结核病病人、涂阳肺结核病人、耐药肺结核病人、肺炎病人和正常人的血清，SHBG蛋白在涂阴、涂阳肺结核和耐多药肺结核病人血清中表达水平明显高于肺炎病人和正常人的血清中表达水平，ELISA和免疫组织化学也验证SHBG蛋白在肺结核病人血清和组织中高表达。
[0005] 所述SHBG蛋白在肺结核病人血清和组织中高表达是指以下5个肽段表达水平增高：IALGGLLFPASNLR，QAEISASAPTSLR，LPLVPALDGCLR，SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR，WHQVEVK。
[0006] 本发明的显著效果在于：
[0007] 采用基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学对结核病的全面系统的研究，得到一种血清SHBG蛋白作为结核病人血清标志物，该标志物经过大样本的血清ELISA和免疫组织化学的验证，结果更为可靠，可为临床应用提供有价值的信息。
附图说明
[0008] 图1.SHBG的iTRAQ的相对定量分析图
[0009] SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR肽段的iTRAQ的相对定量分析图，与正常人和肺炎比，该肽段在肺结核病血清中明显高表达。
[0010] 图2.ELISA检测SHBG的表达水平图
[0011] Healthy control：正常对照，Pneumonia：肺炎，SNP-TB：涂阴肺结核病，DR-TB：耐药肺结核病，SPP-TB：涂阳肺结核病，ELISA检测血清SHBG的表达水平，与正常对照和肺炎相比，SHBG蛋白的表达水平在涂阴肺结核病病人，耐药肺结核病人、涂阳肺结核病人血清中明显高表达。
[0012] 图3.免疫组织化学实验检测SHBG蛋白的表达水平
[0013] 免疫组织化学检测SHBG蛋白在肺结核组织和对照组织中的表达水平。与对照组比，SHBG蛋白在肺结核病组织中明显高表达。
具体实施方式
[0014] 以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
[0015] 实施例1
[0016] 血清定量蛋白组技术检测SHBG蛋白五个肽段在结核病人血清中表达增高[0017] 1.检测样本：耐多药结核病、涂阴结核病、涂阳结核病、肺炎病人和正常对照血清各10例。清晨空腹采集2mL全血,4℃静置1-2h待血液凝固析出血清,3 000g离心10min,收集上清液,冰上分装后存至-80℃备用。
[0018] 2.检测方法：(1)去除高丰度蛋白:按照多重亲和去除系统human14色谱柱操作说明,去除血清高丰度蛋白,将收集到的馏分用冻干机浓缩。(2)脱盐和蛋白含量检测:除高丰度蛋白后的血清用3000MWCO超滤离心管,加入50mmol/L pH 8.5三乙胺碳酸氢缓冲液,反复3次,脱盐和收集蛋白片段；采用BCA法测定血清蛋白含量,每组低丰度蛋白取100μg/管,冻干。(3)蛋白酶解和标记iTRAQ:将干燥样品加入胰蛋白酶,37℃消化过夜；酶解样品真空干燥后,溶于iTRAQ溶液缓冲液中；iTRAQ试剂113、117、118、119、120分别标记健康对照组、耐多药组、涂阳组、涂阴组和肺炎组血清蛋白多肽,标记后的样品经过C18spin column除盐柱除盐,冻干。(4)离线二维液相色谱分离与点靶:干燥的标记样品用上样缓冲液A(10mmol/L KH2PO4,25％CAN,pH 2.7)复溶并稀释10倍,上样到SCX预装柱,经上样缓冲液A洗涤后,用含有KCl浓度分别为35、50、75、100、125、150、175、200、250和300mmol/L的缓冲液B分布洗脱,收集不同梯度浓度条件下洗脱的多肽。收集到的各组份样品稀释后进行反相C18柱梯度淋洗和点靶。(5)质谱分析与数据处理:标记肽段的串联质谱鉴定和相对定量分析采用ABI公司的5800MALDI-TOF/TOF蛋白分析仪，质谱分析数据用Protein Pilot 2.0对SWISSPROT数据库进行检索鉴定蛋白,报告置信度高于95％的蛋白,同时各组检测数据与113报告离子的峰面积积分进行相对定量分析,选择P≤0.05的结果进行报告。(6)统计学处理：应用SPSS14.0软件进行统计学分析，计量数据以mean±SD表示,两样本均数间的比较采用t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。
[0019] 3.检测结果：质谱共鉴定到SHBG蛋白5个唯一肽段IALGGLLFPASNLR，QAEISASAPTSLR，LPLVPALDGCLR，SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR，WHQVEVK，总体覆盖率22.4％，117/113＝5.706,118/113＝6.0681,119/113＝11.1686,P＜0.05；120/113＝1.0864，P＞
0.05。SHBG蛋白在耐药结核、涂阴结核和涂阳结核病人血清中表达水平明显增高。如图1所示。
0.05。SHBG蛋白在耐药结核、涂阴结核和涂阳结核病人血清中表达水平明显增高。如图1所示。
[0020] 实施例2
[0021] 制备含IALGGLLFPASNLR，QAEISASAPTSLR，LPLVPALDGCLR，SCDVESNPGIFLPPG TQAEFNLR，WHQVEVK等5个肽段SHBG蛋白抗体，利用该抗体进行ELISA检测，发现SHBG蛋白在结核病人血清表达水平增高。
[0022] 1.样本：收集24例健康对照，15例肺炎病人，160例结核病人血清，其中耐多药35例，涂阴结核病70例，涂阳结核病55例。
[0023] 2.检测方法：①加样：设定好空白孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上每个孔中先加100μl的样品稀释液RD1-75，然后往酶标板孔底部加50μl的空白对照，标准液和待测样品，样品最终稀释度为100倍。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。②温育：用封板膜封板后置室温温育3个小时。③配液：将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。④洗涤：揭去封板膜，弃去液体，甩干，每孔400μl洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干。⑤温育：每孔加入SHBG结合物200μl，用封板膜封板后置室温温育1个小时。⑥洗涤：操作同④。⑦显色：每孔先加入底物溶液200μl，置室温温育半个小时，轻轻震荡混匀，37℃避光显色。⑧终止：每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。⑨测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度，即OD值。测定应在加终止液后15分钟以内进行。结果：质控点空白孔呈现无色、OD值为0时，即可判定检测结果。
[0024] 3.结果：SHBG蛋白在耐多药结核病人、涂阳结核病人、涂阴结核病人、肺炎病人和正常对照血清中的浓度(nmol/L)分别为181.76±200.09,160.43±75.45,159.75±75.47,60.63±59.38，33.39±34.24，p<0.0001，在结核病人血清中表达水平明显增高，如图2所示。
[0025] 实施例3
[0026] 制备含IALGGLLFPASNLR，QAEISASAPTSLR，LPLVPALDGCLR，SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR，WHQVEVK等5个肽段的SHBG蛋白一抗，利用该一抗进行免疫组织化学检测，发现SHBG蛋白在肺结核组织中高表达。
[0027] 1.样本：利用US Biomax商业化组织芯片检测SHBG的表达水平，其中包含40例肺结核组织，10例对照组织，对照组织为正常肺组织和肺癌组织。
[0028] 2.实验步骤：①脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100％酒精-100％酒精-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精。在前面两个试剂中放10min，后面6个试剂为
5min。②抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3％H2O2浸泡10min，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中火中蒸煮3min，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温。③血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，然后放入室温或37℃温箱中半小时。④加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，对照实验就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4℃冰箱中保存过夜。⑤加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,，后置于室温或37℃温箱中半小时。⑥将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，滴加试剂C液,然后置于室温或37℃温箱中10-15min。⑦加显色剂：
将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀。⑧复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色。⑨封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
5min。②抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3％H2O2浸泡10min，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中火中蒸煮3min，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温。③血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，然后放入室温或37℃温箱中半小时。④加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，对照实验就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4℃冰箱中保存过夜。⑤加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,，后置于室温或37℃温箱中半小时。⑥将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，滴加试剂C液,然后置于室温或37℃温箱中10-15min。⑦加显色剂：
将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀。⑧复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色。⑨封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
[0029] 3.结果：40例肺结核组织中SHBG蛋白表达全部阳性，10例对照组织中SHBG表达全部阴性，如图3所示。