两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物的应用转让专利
申请号 : CN201510664797.X
文献号 : CN105232539B
文献日 : 2017-09-05
发明人 : 英锡相 , 张文洁 , 孟一晗 , 英哲铭
申请人 : 辽宁中医药大学
摘要 :
两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物或保健品的应用，所述两种马齿苋来源生物碱为oleracimine和oleracone。所述抗炎是指抑制由巨噬细胞释放过量炎症细胞因子或炎症介质而导致的炎症。本发明通过对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应的抑制试验，表明马齿苋来源oleracimine和oleracone具有抑制炎症因子IL‑6、TNF‑α和抑制炎症介质NO、PGE2的作用，蛋白免疫印迹法及实时荧光定量PCR显示oleracimine对iNOS、COX‑2蛋白和基因表达具有抑制作用，有效证明了两种马齿苋来源生物碱具有抗炎的功效。综上，马齿苋来源生物碱oleracimine和oleracone具有良好的抗炎活性，可作为先导化合物用于制备抗炎活性药物，来预防或治疗由NO、IL‑6、TNF‑α和PGE2过量而导致的炎症。
权利要求 :
1.马齿苋来源生物碱或其盐作为制备抗炎药物的应用，其特征在于，所述马齿苋来源生物碱为oleracimine或oleracone；
所述oleracimine的结构式为：
；
所述oleracone的结构式为：
。
2.如权利要求1所述的马齿苋来源生物碱或其盐作为制备抗炎药物的应用，其特征在于，所述抗炎药物中含有oleracimine的化合物或其盐。
3.如权利要求1所述的马齿苋来源生物碱或其盐作为制备抗炎药物的应用，其特征在于，所述抗炎药物中含有oleracone的化合物或其盐。
4.如权利要求1所述的马齿苋来源生物碱或其盐作为制备抗炎药物的应用，其特征在于，所述抗炎为抑制由巨噬细胞释放过量炎症细胞因子或炎症介质而导致的炎症。
5.如权利要求4所述的马齿苋来源生物碱或其盐作为制备抗炎药物的应用，其特征在于，所述炎症细胞因子为IL-6或TNF-α，所述炎症介质为NO或PGE2。
6.如权利要求5所述的马齿苋来源生物碱或其盐作为制备抗炎药物的应用，其特征在于，所述抗炎药物为炎症细胞因子过度表达抑制剂或巨噬细胞产生过量NO的抑制剂。
说明书 :
两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及马齿苋来源生物碱应用于制备抗炎药物的应用。
背景技术
[0002] 马齿苋又名长命菜、马苋菜，属马齿苋科一年生肉质草本植物马齿苋的全草。马齿苋耐光耐阴，喜暖且耐旱耐涝，适宜生长在空气干燥而土壤潮湿的地方。马齿苋生长力、抗病能力强，分布广泛，资源丰富，作为药食同源野生植物之一，既是一种保健功能食品，又具有重要的药用价值。2015版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，可用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血及崩漏下血。研究表明马齿苋中所含多种化学成分与其多样的药理作用息息相关，其主要化学成分包括：有机酸类、黄酮类、萜类、香豆素类、生物碱类、挥发油及多糖等。现代药理学研究表明，马齿苋具有降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、松弛或兴奋平滑肌及增强免疫力等功效。
[0003] 近年来，马齿苋因其丰富的营养、多样的药理作用以及药食两用的特性备受学者关注。到目前为止，关于马齿苋抗炎活性的研究集中在马齿苋不同溶剂提取物的报道，本组研究发现，马齿苋来源生物碱具有抗炎功效，可能为其抗炎作用的主要化合物。
[0004] 炎症是机体对于刺激的一种防御反应，常表现为红、肿、热、痛及其他功能障碍。当机体受到外来病原体刺激时，常引起各种炎症介质过量释放以及炎症细胞过度激活。巨噬细胞作为机体抗击外来物侵袭的重要一关，可调节机体防御功能，会分泌炎症因子及炎症介质，包括转化生长因子（Transforming growth factor，TGF）、白细胞介素（Interleukin，IL）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、前列腺素2（Prostaglandin E2，PGE2）以及一氧化氮（Nitric oxide，NO）等，这些生物活性物质也会影响炎症反应过程中酶的表达，如诱导性一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）和环氧化酶（Cyclooxygenase 2，COX-2）。
[0005] 细菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁中一种成分，其作为病原体入侵巨噬细胞后形成体外炎症模型，可使巨噬细胞大量分泌上述生物活性物质。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物的应用。
[0007] 为实现本发明的上述目的，本发明提供两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物的应用，所述两种马齿苋来源生物碱为oleracimine和oleracone。
[0008] 所述oleracimine的分子式为C18H26N2O，结构式为。
[0009]
[0010] 所述oleracone的分子式为C14H17NO2，结构式为。
[0011]
[0012] 所述抗炎药物中含有oleracimine的化合物及其盐或衍生物；所述抗炎药物中含有oleracone的化合物及其盐或衍生物。
[0013] 所述抗炎是指抑制由巨噬细胞释放过量炎症细胞因子或炎症介质而导致的炎症；所述炎症细胞因子包括IL-6、TNF-α，所述炎症介质为NO、PGE2。
[0014] 所述抗炎药物为炎症细胞因子过度表达抑制剂、巨噬细胞产生过量NO的抑制剂等。
[0015] 与现有技术相比本发明的有益效果。
[0016] 本发明提供的两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物的应用，通过对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应的抑制试验，表明马齿苋来源oleracimine和oleracone具有抑制炎症因子IL-6、TNF-α和抑制炎症介质NO、PGE2的作用，蛋白免疫印迹法及实时荧光定量PCR显示oleracimine对iNOS、COX-2蛋白和基因表达具有抑制作用，有效证明了两种马齿苋来源生物碱具有抗炎的功效。综上，马齿苋来源生物碱oleracimine和oleracone均具有良好的抗炎活性，可作为先导化合物用于制备抗炎活性药物，来预防或治疗由NO、IL-6、TNF-α和PGE2过量而导致的炎症。
附图说明
[0017] 图1A为oleracimine对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的存活率的影响示意图。
[0018] 图1B为oleracone对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的存活率的影响示意图。
[0019] 图2A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞产生NO的抑制作用示意图。
[0020] 图2B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞产生NO的抑制作用示意图。
[0021] 图3A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响示意图。
[0022] 图3B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响示意图。
[0023] 图4A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响示意图。
[0024] 图4B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响示意图。
[0025] 图5A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞分泌PGE2的影响示意图。
[0026] 图5B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞分泌PGE2的影响示意图。
[0027] 图6A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的iNOS蛋白的影响示意图。
[0028] 图6B为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的COX-2蛋白的影响示意图。
[0029] 图6C为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的蛋白条带图。
[0030] 图7A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的iNOS基因影响示意图。
[0031] 图7B为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的COX-2基因影响示意图。
具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。
[0033] 本实施例提供两种马齿苋来源生物碱作为制备抗炎药物的应用，所述两种马齿苋来源生物碱为oleracimine和oleracone。
[0034] 为进一步验证本发明的有益效果，提供以下实验例。
[0035] 1、实验原料及相关试剂、分组。
[0036] DMEM高糖培养基、胎牛血清购于美国Hyclone公司；青霉素、链霉素购于杭州四季青公司；LPS购于美国Sigma公司；IL-6、TNF-α、PGE2的ELISA试剂盒购于美国Cayman公司；细胞裂解液、PMSF及Griess试剂购于碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白质浓度测定试剂盒、引物购于上海生工公司；iNOS单克隆抗体、COX-2单克隆抗体、内参单克隆抗体购于美国CST公司；辣根过氧化酶标记的二抗抗体购于北京中杉金桥生物公司；PVDF膜购于美国TMMillipore公司；化学发光底物（ECL）购于美国Pierce公司；Eastep 总RNA提取试剂盒、GoScriptTM反转录试剂盒购于Promega公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购于TaKaRa公司。
[0037] 分组：共分为三组，即对照组、LPS组和实验组。
[0038] 2、两种马齿苋来源生物碱为oleracimine和oleracone的制备方法。
[0039] （1）马齿苋来源生物碱为oleracimine的制备方法，包括以下步骤。
[0040] 步骤1、称取马齿苋干燥药材50kg，采用水煎煮提取，水的用量为药材用量的8-16倍，煎煮提取两次，每次2h，水提液过滤，合并滤液直接浓缩，得药液备用。
[0041] 步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的AB-8或D101大孔吸附树脂吸附除杂，分别以水和50%乙醇洗脱，对50%乙醇洗脱液进行减压浓缩，得到浓缩液备用。所述水的洗脱除杂用量为2-3个柱体积，所述50%乙醇的洗脱用量为冲至颜色变浅为止。所述大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过24小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。
[0042] 步骤3、将步骤2中浓缩液用乙酸乙酯反复3次萃取，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。所述乙酸乙酯与浓缩液的用量比为1:1（v:v）。
[0043] 步骤4：将步骤3中乙酸乙酯萃取物干法上样，经硅胶柱层析分离，其中硅胶以200-400目，依次用石油醚-丙酮（1:1、1:2、1:3、1:5，v:v）梯度洗脱，每个比例洗脱得40个部位（即每个比例洗脱得40个瓶，每瓶200mL），共得到160个部位（即共得到160个瓶），经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的90-130洗脱部位（即合并显色的90-130瓶，弃去1-89瓶与
131-160瓶），将合并后的90-130部位经40℃以下减压浓缩至干，备用。
131-160瓶），将合并后的90-130部位经40℃以下减压浓缩至干，备用。
[0044] 步骤5：将步骤4中所得物再经ODS中压柱层析分离（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料粒度为20-40μm），用甲醇-水（50/50，v/v）等度洗脱（加压，使流速为1ml/min，温度为室温），得到10个部位（即等度洗脱得10个瓶，每瓶100mL，依次标记），经薄层色谱进行检测，显色，合并6-7部位，50℃以下减压浓缩至干，备用。
[0045] 步骤6：将步骤5中所得物经Sephadex LH-20，以甲醇-水（70/30，v/v）等度洗脱，即得新骨架生物碱化合物oleracimine。经超高效液相色谱，归一法测定纯度均为90-99%。
[0046] （2）马齿苋来源生物碱为oleracone的制备方法，包括以下步骤。
[0047] 重复上述oleracimine制备方法中的步骤1-3，接着将步骤3中乙酸乙酯萃取物干法上样，经硅胶柱层析分离，所述硅胶为200-400目，依次用石油醚-丙酮（1:1，1:2，1:3，1:5，v:v）梯度洗脱得到130个洗脱部位，按顺序记为洗脱部位1-130，经薄层色谱进行检测，显色，合并90-130洗脱部位，将合并后的洗脱部位经40℃以下减压浓缩至干，备用。将步骤4中所得物再经ODS中压柱层析分离，用甲醇-水（70/30，v/v）等度洗脱，得到10个洗脱部位，按顺序记为部位1-10，经薄层色谱进行检测，显色，将洗脱部位3在50℃以下减压浓缩至干，得浓缩物备用。将步骤5中所得浓缩物经Sephadex LH-20，以甲醇-水（50/50，v/v）等度洗脱，根据颜色紫红色带接，即得马齿苋来源生物碱oleracone。经超高效液相色谱，归一法测定纯度均为90-99%。
[0048] 3、MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的马齿苋来源生物碱oleracimine（1-20μM）或oleracone（1-100μM），孵育1h后向LPS组和实验组分别加入终浓度为1μg/mL的LPS，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入5 mg/mL MTT 20μL，温度37℃，5%CO2条件下继续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光值，细胞相对存活率结果如图1A、1B所示，其中“+”表示有LPS，“-”表示没有LPS或生物碱，图1A为oleracimine对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的存活率的影响示意图，图1B为oleracone对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的存活率的影响示意图。
[0049] 4、利用格里斯（Griess）法测定NO的含量，考察两种马齿苋来源生物碱对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的NO产生量的抑制作用。小鼠巨噬细胞RAW264.7传代后在含10%胎牛血清的高糖细胞培养基DMEM中培养，实验组加入不同浓度的马齿苋来源oleracimine（1-20μM）或oleracone（1-50μM），在37℃，5%CO2条件下孵育1h后用LPS（终浓度为1μg/mL）诱导炎症反应，24h后收集上清液。Griess法测定细胞上清液中NO的含量，根据不同浓度马齿苋来源生物碱对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响，用以反映NO水平，如图2A、2B所示，其中“+”表示有LPS，“-”表示没有LPS或生物碱。图2A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞产生NO的抑制作用示意图，图2B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞产生NO的抑制作用示意图。由图2A、2B可知，两种马齿苋来源生物碱oleracimine和oleracone能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞产生过量NO。
[0050] 5、ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-α和炎症介质PGE2：将对数生长期RAW264.7巨5
噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×10个/mL，每孔1 mL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜，实验组加入马齿苋来源oleracimine（1-20μM）或oleracone（1-50μM）培育1h后，在每孔加入LPS（终浓度为1μg/mL），共孵育24h，每组处理重复3孔。ELISA法测定两种马齿苋来源生物碱处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2的含量如图3A、3B、4A、4B、
5A、5B所示，其中“+”表示有LPS，“-”表示没有LPS或生物碱。图3A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响示意图，图3B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响示意图，图4A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响示意图，图4B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响示意图，图5A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞分泌PGE2的影响示意图，图5B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞分泌PGE2的影响示意图。由图3A、3B、4A、4B、5A、5B可知，应用ELISA方法发现，两种马齿苋来源生物碱可以抑制细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2等相关炎症细胞因子的表达。
噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×10个/mL，每孔1 mL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜，实验组加入马齿苋来源oleracimine（1-20μM）或oleracone（1-50μM）培育1h后，在每孔加入LPS（终浓度为1μg/mL），共孵育24h，每组处理重复3孔。ELISA法测定两种马齿苋来源生物碱处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2的含量如图3A、3B、4A、4B、
5A、5B所示，其中“+”表示有LPS，“-”表示没有LPS或生物碱。图3A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响示意图，图3B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响示意图，图4A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响示意图，图4B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响示意图，图5A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞分泌PGE2的影响示意图，图5B为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞分泌PGE2的影响示意图。由图3A、3B、4A、4B、5A、5B可知，应用ELISA方法发现，两种马齿苋来源生物碱可以抑制细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2等相关炎症细胞因子的表达。
[0051] 6、应用蛋白免疫印迹法（Western bloting），将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/mL，每孔1 mL，温度37℃，5%CO2条件下培养，实验组加入oleracimine（终浓度为1-20μM）后培育1h，再加入LPS（终浓度为1μg/mL），共培育24h，每组处理重复3孔，收集诱导后的RAW264.7巨噬细胞，加入含有PMSF（终浓度为1 mM）的
4℃预冷细胞裂解液反复吹打，冰上孵育30min后，4℃，10000g离心5min，取上清进行BCA蛋白定量，加入适量上样缓冲液后100℃加热10min使蛋白变性，取30μg蛋白样本于点样孔中，用10%SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜上，脱脂奶粉室温封闭2h；TBST洗涤三次，每次10min；分别于相应一抗和内参中4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，在37℃条件下，用1:2500稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育45min；TBST洗涤3次，每次10min；最后用化学发光底物（ECL）显影。相对蛋白水平结果如图6A、6B、6C所示，其中“+”表示有LPS，“-”表示没有LPS或生物碱。
图6A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的iNOS蛋白的影响示意图，图6B为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的COX-2蛋白的影响示意图，图6C为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的蛋白条带图。由图6A、6B、6C可知，应用蛋白免疫印迹法发现，马齿苋来源生物碱oleracimine可抑制iNOS和COX-2蛋白的过量表达。
4℃预冷细胞裂解液反复吹打，冰上孵育30min后，4℃，10000g离心5min，取上清进行BCA蛋白定量，加入适量上样缓冲液后100℃加热10min使蛋白变性，取30μg蛋白样本于点样孔中，用10%SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜上，脱脂奶粉室温封闭2h；TBST洗涤三次，每次10min；分别于相应一抗和内参中4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，在37℃条件下，用1:2500稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育45min；TBST洗涤3次，每次10min；最后用化学发光底物（ECL）显影。相对蛋白水平结果如图6A、6B、6C所示，其中“+”表示有LPS，“-”表示没有LPS或生物碱。
图6A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的iNOS蛋白的影响示意图，图6B为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的COX-2蛋白的影响示意图，图6C为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的蛋白条带图。由图6A、6B、6C可知，应用蛋白免疫印迹法发现，马齿苋来源生物碱oleracimine可抑制iNOS和COX-2蛋白的过量表达。
[0052] 7、应用实时荧光定量PCR法（Real-time qPCR），收集LPS诱导后的各组巨噬细胞RAW264.7，利用总RNA提取试剂盒提取总RNA，使用NanoDrop 2000c微量分光光度计对RNA的浓度和纯度进行检测；取等量的RNA进行反转录，采用反转录试剂盒合成cDNA，于Applied Biosystems Real-time PCR上，以目的基因及内参基因为样本，取等量cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应（终体积为20μL），反应条件为：95℃，30s；95℃，5s，60℃，31s反应40个循环。实验结束后，用2-ΔΔCt法处理数据。相对mRNA水平如图7A、7B所示，其中“+”表示有LPS，“-”表示没有LPS或生物碱。图7A为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的iNOS基因影响示意图，图7B为oleracimine对LPS刺激RAW264.7细胞表达的COX-2基因影响示意图。由图7A、7B可知，应用实时荧光定量PCR法，发现随着马齿苋来源生物碱oleracimine浓度的增加，RAW264.7细胞中过量表达的iNOS和COX-2的mRNA减少，且呈浓度依赖性。
[0053] 实验引物序列如下：
[0054] iNOS（forward）5’-GGTGAAGGGACTGAGCTGTT-3’
[0055] （reverse）5’-ACGTTCTCCGTTCTCTTGCAG-3’；
[0056] COX-2（forward）5’-TGGTGCCCTGGTCTGATGATG-3’；
[0057] （reverse）5’-GTGGTAACCGCTCAGGTGTTG-3’；
[0058] β-actin（forward）5’-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3’；
[0059] （reverse）5’-ATGCCACAGGATTCCATACC-3’。
[0060] 综上所述，所述两种马齿苋来源生物碱oleracimine和oleracone对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；所述马齿苋来源生物碱oleracimine可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-6、TNF-α和炎症介质NO、PGE2。所述马齿苋来源生物碱oleracone在高浓度下可抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生的过量炎症细胞因子IL-6、TNF-α和炎症介质NO、PGE2。所述马齿苋来源生物碱oleracimine在蛋白和基因水平，可有效抑制LPS诱导的RAW264.7中两个合成酶（iNOS和COX-2）的过量表达，且呈浓度依赖。
[0061] 以上结果证明：所述两种马齿苋来源生物碱oleracimine和oleracone具有良好的抗炎活性，可作为先导化合物制备抗炎药物，用于预防或治疗由IL-6、TNF-α、NO或PGE2过量而导致的炎症。