PEG化亮丙瑞林

摘要

本发明提供了一种PEG‑亮丙瑞林偶联物及其制备方法，其特征在于，先将PEG与马来酸酐连接，再形成活泼酯，所述PEG修饰剂与带保护的亮丙瑞林通过Mal连接，然后去保护得到单一位点修饰的PEG‑亮丙瑞林偶联物；该化合物在保留亮丙瑞林原有活性的同时，并具有更长的半衰期和平均达峰时间。

权利要求

1.一种PEG-亮丙瑞林偶合物，其特征在于，PEG与亮丙瑞林的连接位点为亮丙瑞林的丝氨酸残基的侧链上的羟基基团，该偶合物的通式为D-L，其中D为PEG-Mal，其结构为：L为亮丙瑞林。

2.根据权利要求1所述的偶合物，其具有如下所示的连接形式：RO-(CH2CH2O)n-Mal-Leuprorelin或其分支型，其中，R为H或C1～C4烷基；

n为100到1000的整数值。

3.一种制备权利要求1所述偶合物的方法，包括以下步骤：先将PEG与马来酸酐连接，再与活化连接基团连接形成活泼酯，然后通过化学方法以共价键偶联到带保护的亮丙瑞林上，经三氟乙酸溶液去保护，形成通式为D-L的偶合物。

4.根据权利要求3所述的方法，偶合反应中，亮丙瑞林与Mal化单甲氧基聚乙二醇的摩尔比为1:1～1:10。

5.根据权利要求4所述的方法，偶合反应中，亮丙瑞林与Mal化单甲氧基聚乙二醇的摩尔比为1:5。

6.根据权利要求3所述的方法，偶合反应体系为磷酸盐缓冲液pH4.0～6.0。

7.根据权利要求3所述的方法，其中D的分子量为5～40KDa。

8.根据权利要求7所述的方法，其中D的分子量为20KDa。

9.根据权利要求3所述的方法，其中D的活化连接基团选自酰胺基、酰亚氨基、氨基甲酸酯基、羟基、羧基、醛基、环氧基、硝基苯基、氧羰基咪唑基、半胱氨酸基、组氨酸基或伯胺。

10.根据权利要求9所述的方法，其中D的活化连接基团为琥珀酰亚氨基。

11.根据权利要求9所述的方法，其中D的活化连接基团为N-羟基琥珀酰亚胺。

12.权利要求1-2任一项的PEG-亮丙瑞林偶合物在药用组合物中的应用。

说明书

PEG化亮丙瑞林

技术领域

[0001] 本发明涉及药物化学领域，具体涉及PEG修饰的亮丙瑞林药物偶合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 亮丙瑞林是人工合成的黄体生成激素释放激素(LHRH，亦名促性腺激素释放激素，GnRH)的高活性衍生物，是GnRH拮抗剂，为多肽类药物。它可以刺激垂体分泌促性腺激素，诱发生殖器官生成类固醇。长期大量使用会抑制垂体分泌促性腺激素及睾丸或卵巢甾类的生成，可治疗或缓解多种性激素依赖性疾病如前列腺癌、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、性早熟等。

[0003] 目前亮丙瑞林的缓控释微球注射液在临床上得以应用，其高分子载体材料为PLGA，属于混悬剂，最常用的制备方法是复乳法(w/o/w法)，其应用存在一些不足：微球粒径范围一般为1～500μm，小的可以是几纳米，大的可达800μm，所需注射针头较粗，注射部位会有疼痛、硬结或发红等刺激；微球的粒径不均一，药物释放受影响；若材料降解性不好易引起炎症反应，患者顺应性较差；只作为皮下给药，静脉注射可能会引起血栓形成。

[0004] 聚乙二醇(PEG)由多个重复的氧乙烯基组成，是一种两亲性良好的聚合物。其化学性质稳定，无抗原性，毒性小，且生物相容性已通过FDA认证。作为修饰剂与蛋白质或多肽类药物结合后，许多优良性能随之转移到PEG化后的药物中。与蛋白质或多肽结合时，可作为一种屏障遮挡住其分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生，或者阻止抗原与抗体的结合，抑制免疫反应的发生，即降低免疫原性和免疫反应性。PEG化后的药物分子增大，肾小球过滤减少，有助于蛋白质或多肽类药物循环半衰期的延长。蛋白质或多肽在经水溶性的PEG大分子修饰后，热稳定性、抗酸碱能力、抗变性剂能力及抗酶解能力均有明显提高，稳定性增强。经PEG修饰后的蛋白质或多肽，毒性比修饰之前低，不少修饰的蛋白质的药效还有明显提高。此外，蛋白质或多肽经PEG修饰后可以制备成各种剂型直接给药，既与微球一样达到缓释的目的，又减少了副作用，提高了患者的顺应性。

[0005] 目前已有多种通过FDA批准进入市场的PEG修饰的蛋白质和多肽药物，如PEG修饰的腺苷脱氢酶(PEG-ADA)、PEG修饰的天冬酰胺酶(PEG-asparaginase)、PEG修饰的干扰素α-2a(peginterferon alfa-2a)、PEG修饰的干扰素α-2b(peginterferon alfa-2b)、PEG修饰的重组人粒细胞集落刺激因子等。

[0006] PEG在与蛋白质或多肽结合之前需要进行活化。PEG功能基团为其末端的羟基，反应活性低，只能在较剧烈的条件下与其他基团结合，可能会使蛋白质或多肽失活，因此，必需将PEG进行活化，以便在温和的条件下，以较高的反应速率与蛋白质或多肽偶联。

[0007] 蛋白质或多肽分子中存在多个氨基，偶合后得到的产物通常是多种交联产物的混合物，而且PEG的分子大小及分子结构，对修饰后的蛋白质或多肽空间结构、稳定性及活性方面均有影响。亮丙瑞林的PEG偶合物目前还没有相关研究。

发明内容

[0008] 本发明涉及一种PEG-亮丙瑞林偶联物及其制备方法，目的在于保持亮丙瑞林活性的前提下，提高药物的稳定性，增加药物的缓释作用，减轻过敏反应，具有用药更安全、更长效的功能。

[0009] 具体地，本发明在于提供一种在亮丙瑞林Ser残基上的羟基进行PEG化的PEG-亮丙瑞林偶合物，所述偶合物具有如下通式：

[0010] RO-(CH2CH2O)n-Mal-Leuprorelin或其分支型

[0011] 式中，R为H或C1～C4烷基，优选为甲基；

[0012] n为100到1000整数值，优选为200～500之间的整数，聚乙二醇的分子量在5～40kDa之间，优选为20kDa。

[0013] 具体地，先将PEG与马来酸酐连接，再形成活泼酯，然后通过化学方法以共价键偶联到带保护的亮丙瑞林上，经TFA溶液去保护，形成通式为D-L的偶合物，其中D为PEG-Mal，L为亮丙瑞林。

[0014] 具体地，该偶合物为单一位点修饰的PEG-Mal偶合物。

[0015] 本发明中，所述与亮丙瑞林偶联的聚乙二醇为琥珀酰亚胺基活化的单甲氧基聚乙二醇。聚乙二醇分子根据偶联度不同，可以是分子量为5～40KDa的任一分子，其中优选分子量为20kDa的聚乙二醇分子。聚乙二醇分子可以是直链型或分支型，可以是单链、双链或多链。优选直链型单链聚乙二醇分子。

[0016] 本发明PEG-亮丙瑞林偶联物中，亮丙瑞林既包括亮丙瑞林，也包括醋酸亮丙瑞林。

[0017] 另外本发明还提供了该偶合物的制备方法，其工艺如下：

[0018]

附图说明

[0019] 图1为PEG化亮丙瑞林大鼠体内药代动力学试验结果图。

具体实施方式

[0020] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

[0021] 实施例1制备PEG-Mal-亮丙瑞林

[0022] 1.1 PEG-MAL样品(2)的制备

[0023] 将不同分子量的单甲氧基聚乙二醇PEG分别溶于适量的二氯甲烷中，加入2当量的吡啶为缚酸剂，加入5当量的马来酸酐，温控60℃，反应8h，浓缩，异丙醚析晶体得到不同分子量的一端为羧基的单甲氧基聚乙二醇。

[0024] 1.2 PEG-MAL-OSu样品(3)的制备

[0025] 将不同分子量的一端为羧基的单甲氧基聚乙二醇PEG-MAL分别溶于适量的THF，加入HOSu，DCC，搅拌，有大量白色固体析出，过滤，异丙醚析晶，过滤，用适量水、异丙醚洗涤，真空干燥得不同分子量的PEG-MAL-OSu。

[0026] 1.3 PEG-Mal-ProLeuprorelin样品(5)的制备

[0027] 用100mM pH5.5的NaH2PO4-H3PO4缓冲液溶液溶解带保护的亮丙瑞林以配置成3mg/mL的溶液，分别与不同分子量的聚乙二醇修饰剂PEG-MAL-OSu进行修饰，ProLeuprorelin：PEG-MAL-OSu为1:5的摩尔比进行反应，在4℃下反应24h后，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到产物。

[0028] 1.4 PEG-Mal-Leuprorelin样品(6)的制备

[0029] 不同分子量的聚乙二醇修饰剂PEG-MAL-ProLeuprorelin分别加入至TFA:Tis:H2O(95:2.5:2.5)的溶液中，室温搅拌3～5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到目标产物。

[0030] 实施例2 PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰条件

[0031] 1、反应pH值对修饰产物的影响

[0032] 取带保护的亮丙瑞林，分别用100mmol/L PB缓冲液(pH4.0、pH5.0、pH5.5和pH6.0)配成2mg/mL。按摩尔比1:3(ProLeuprorelin:PEG-MAL-OSu-20KD)称取PEG-MAL-OSu-20KD加入亮丙瑞林反应溶液中，4℃条件下100rpm搅拌反应24h，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，加入至TFA:Tis:H2O(95:2.5:2.5)的溶液中，室温搅拌3～5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥。分别取样采用酶联免疫吸附分析法，确定PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰率。

[0033] 实验结果表明：pH值在4.0、5.0、5.5、6.0的条件下，PEG-Mal-亮丙瑞林所占比例分别为19％，30％，60％，23％。说明pH4.0的修饰率最低，pH5.5的条件下修饰率最高。

[0034] 2、亮丙瑞林与PEG的修饰比例对修饰产物的影响

[0035] 取带保护的亮丙瑞林，分别用pH5.5，100mmol/L PB缓冲液配成2mg/mL。按ProLeuprorelin:PEG-MAL-OSu-20KD摩尔比A(1:1)、B(1:2)、C(1:3)、D(1:4)、E(1:5)、F(1:8)、G(1:10)分别称取PEG-MAL-OSu-20KD加入亮丙瑞林反应溶液中，4℃条件下100rpm搅拌反应24h，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，加入至TFA:Tis:H2O(95:2.5:2.5)的溶液中，室温搅拌3～5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥。分别取样采用酶联免疫吸附分析法，确定PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰率。

[0036] 实验结果表明：ProLeuprorelin:PEG-MAL-OSu-20KD摩尔比A(1:1)、B(1:2)、C(1:3)、D(1:4)、E(1:5)、F(1:8)、G(1:10)时，PEG-Mal-亮丙瑞林所占比例分别为17％，29％，
39％，45％，60％、62％，61％。当ProLeuprorelin:PEG-MAL-OSu-20KD摩尔比达到1:5后，不能进一步提高修饰率。

[0037] 3、反应温度和时间对修饰产物的影响

[0038] 取带保护的亮丙瑞林溶液，分别用pH5.5，100mmol/L PB缓冲液配成2mg/mL，按ProLeuprorelin:PEG-MAL-OSu-20KD摩尔比1:5称取PEG-MAL-OSu-20KD加入亮丙瑞林反应溶液中，分别在4℃反应24h，25℃反应12h不同时间点，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，加入至TFA:Tis:H2O(95:2.5:2.5)的溶液中，室温搅拌3～5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥。分别取样采用酶联免疫吸附分析法，确定PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰率。

[0039] 实验结果表明：4℃条件下通过延长反应时间，同样能达到25℃条件下反应的修饰率。但4℃条件修饰更利于亮丙瑞林的活性和结构稳定。

[0040] 4、ProLeuprorelin浓度对修饰产物的影响

[0041] 取带保护的亮丙瑞林溶液，分别用pH5.5，100mmol/L PB缓冲液配成1.0mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL，4.0mg/mL按ProLeuprorelin与PEG-MAL-OSu-20KD摩尔比1:5称取PEG-MAL-OSu-20KD加入到带保护的亮丙瑞林反应溶液中，在4℃反应24h，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，加入至TFA:TIS:H2O(95:2.5:2.5)的溶液中，室温搅拌3～5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥。采用酶联免疫吸附分析法，确定PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰率。

[0042] 实验结果表明，ProLeuprorelin浓度在1.0mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL，4.0mg/mL时，PEG-Mal-亮丙瑞林所占比例分别为25％，49％，62％，64％。随着多肽浓度提高时，PEG-Mal-亮丙瑞林的修饰有所增加，达到3.0～4.0mg/mL时为合适浓度。

[0043] 实施例3 HO-(CH2CH2O)1000-Mal-Leuprorelin的制备

[0044] 将HO-(CH2CH2O)1000-H溶于适量的二氯甲烷中，加入2当量的吡啶为缚酸剂，加入5当量的马来酸酐，温控60℃，反应8h，浓缩，异丙醚析晶，得一端为羧基的单甲氧基聚乙二醇，将其溶于适量的THF，加入HOSu，DCC，搅拌，有大量白色固体析出，过滤，异丙醚析晶，过滤，用适量水、异丙醚洗涤，真空干燥，得HO-(CH2CH2O)1000-MAL-OSu；用100mM pH5.5的NaH2PO4-H3PO4缓冲液溶液溶解带保护的亮丙瑞林以配置成3mg/mL的溶液，与HO-(CH2CH2O)1000-MAL-OSu以1:5的摩尔比进行反应，在4℃下反应24h后，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到产物，加入至TFA:TIS:H2O(95:2.5:2.5)的溶液中，室温搅拌3～5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex 
200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到目标产物。

[0045] 实施例4 H3CO-(CH2CH2O)500-Mal-Leuprorelin的制备

[0046] 将H3CO-(CH2CH2O)500-H溶于适量的二氯甲烷中，加入2当量的吡啶为缚酸剂，加入5当量的马来酸酐，温控60℃，反应8h，浓缩，异丙醚析晶，得一端为羧基的单甲氧基聚乙二醇，将其溶于适量的THF，加入HOSu，DCC，搅拌，有大量白色固体析出，过滤，异丙醚析晶，过滤，用适量水、异丙醚洗涤，真空干燥，得H3CO-(CH2CH2O)500-MAL-OSu；用100mM pH5.5的NaH2PO4-H3PO4缓冲液溶液溶解带保护的亮丙瑞林以配置成3mg/mL的溶液，与H3CO-(CH2CH2O)500-MAL-OSu以1:5的摩尔比进行反应，在4℃下反应24h后，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到产物，加入至TFA:TIS:H2O(95:2.5:2.5)的溶液中，室温搅拌3～5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到目标产物。

[0047] 实施例5 CH3CH2-O-(CH2CH2O)300-Mal-Leuprorelin的制备

[0048] 将CH3CH2-O-(CH2CH2O)300-H溶于适量的二氯甲烷中，加入2当量的吡啶为缚酸剂，加入5当量的马来酸酐，温控60℃，反应8h，浓缩，异丙醚析晶，得一端为羧基的单甲氧基聚乙二醇，将其溶于适量的THF，加入HOSu，DCC，搅拌，有大量白色固体析出，过滤，异丙醚析晶，过滤，用适量水、异丙醚洗涤，真空干燥，得CH3CH2-O-(CH2CH2O)300-MAL-OSu；用100mM pH5.5的NaH2PO4-H3PO4缓冲液溶液溶解带保护的亮丙瑞林以配置成3mg/mL的溶液，与CH3CH2-O-(CH2CH2O)300-MAL-OSu以1:5的摩尔比进行反应，在4℃下反应24h后，加入1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到产物，加入至TFA:TIS:H2O(95:2.5:2.5)的溶液中，室温搅拌3～5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到目标产物。

[0049] 实施例6 CH3CH2CH2CH3-O-(CH2CH2O)100-Mal-Leuprorelin的制备

[0050] 将CH3CH2CH2CH3-O-(CH2CH2O)100-H溶于适量的二氯甲烷中，加入2当量的吡啶为缚酸剂，加入5当量的马来酸酐，温控60℃，反应8h，浓缩，异丙醚析晶，得一端为羧基的单甲氧基聚乙二醇，将其溶于适量的THF，加入HOSu，DCC，搅拌，有大量白色固体析出，过滤，异丙醚析晶，过滤，用适量水、异丙醚洗涤，真空干燥，得CH3CH2CH2CH3-O-(CH2CH2O)100-MAL-OSu；用100mM pH5.5的NaH2PO4-H3PO4缓冲液溶液溶解带保护的亮丙瑞林以配置成3mg/mL的溶液，与CH3CH2CH2CH3-O-(CH2CH2O)100-MAL-OSu以1:5的摩尔比进行反应，在4℃下反应24h后，加入
1M的甘氨酸终止反应，经葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到产物，加入至TFA:TIS:H2O(95:2.5:2.5)的溶液中，室温搅拌3～5h，经异丙醚沉降，过滤，用葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析纯化，浓缩，冷冻干燥得到目标产物。

[0051] 实施例7纯化PEG-Mal-亮丙瑞林

[0052] 经脱保护、葡聚糖凝胶Superdex 200柱层析第二次纯化得到的修饰产物，溶于醋酸水溶液中，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：20～26(V/V)乙腈-水流动相，流速：150mL/min梯度洗脱，检测波长280nm，收集目的馏分，浓缩，冷冻干燥。得纯化PEG-Mal-亮丙瑞林。

[0053] 实施例8 PEG-Mal-亮丙瑞林大鼠体内药代动力学研究

[0054] PEG-Mal-亮丙瑞林样品按照实施例3～7中的方法进行制备。

[0055] 36只大鼠禁食过夜，分为6组，每组6只，一组皮下注射醋酸亮丙瑞林溶液(110μg/kg)作为阳性对照；一组皮下注射生理盐水作为空白对照组；其余4组皮下注射PEG-Mal-亮丙瑞林溶液(相当于醋酸亮丙瑞林剂量/kg)；于不同时间0，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，16，24h眼底静脉丛取血0.5mL，离心取血清，应用放射免疫法测定血药浓度。经时曲线，见图1。

[0056] 本发明PEG-Mal-亮丙瑞林注射给药后，在2h内达到血药浓度峰值9.22±0.34ng/mL，2h后血药浓度降至5.82±0.14ng/mL，但持续该血药浓度4h后才下降，显示出较平稳和缓释的血药浓度经时变化。与醋酸亮丙瑞林组相比，PEG-Mal-亮丙瑞林能明显地延长药物的缓释时间(P<0.05)。

[0057] 实施例9一种PEG-Mal-亮丙瑞林注射剂的制备

[0058] 将PEG-Mal-亮丙瑞林溶解于含15％甘露醇的生理盐水中，灭菌，制得相应的缓释注射剂。

[0059] 实施例10一种PEG-Mal-亮丙瑞林片剂的制备

[0060] 称取PEG-Mal-亮丙瑞林4g和1g乳糖，过筛混匀，用适量95％乙醇做润湿剂，制软材，挤压制粒，干燥后，加入硬脂酸镁，整粒，混匀，调节压片机下冲使填充量为0.6g，调节上冲至适当压力，压片，制得相应的片剂。

[0061] 实施例11一种PEG-Mal-亮丙瑞林胶囊剂的制备

[0062] 按明胶：水：甘油：尼泊金乙酯＝1:1:0.4:0.001的比例称量好胶皮原料，80℃条件下搅拌化胶，减压脱气泡，60℃保温，将3gPEG-Mal-亮丙瑞林溶解于水中，使含水量为3％，通过压制，揩丸去油、烘干、整理、包装得10000粒胶囊产品。