一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法

摘要

本发明公开了一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，属于遗传工程领域。本发明以BSGNK‑PxylA‑glmS‑P43‑GNA1作为出发菌株，通过同源重组敲除磷酸烯醇式羧化酶编码基因pckA，阻断了宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，促进了乙酰氨基葡萄糖积累。在使用复合培养基发酵过程中，敲除pckA的重组枯草芽孢杆菌的乙酰氨基葡萄糖的产量达到29.27g/L，比对照菌株提高了28.1％。本发明为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

权利要求

1.一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA；所述枯草芽孢杆菌BSGNK，以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并在此基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI上Gene ID:

937235的基因。

2.一种构建权利要求1所述乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述构建方法是先构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因敲除框，经同源重组，用敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌BSGNK基因组中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pckA，阻断了宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，促进了乙酰氨基葡萄糖积累；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI上Gene ID:937235的基因。

3.一种促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，是以重组枯草芽孢杆菌BSGNKA为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖；BSGNKA是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI上Gene ID:937235的基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基，按g/L计含有：初始葡萄糖20，蛋白胨6，酵母粉12，(NH4)SO46，K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素溶液10-15ml；其中微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.2，AlCl3·6H2O 0.1，CuCl2·H2O 0.1，H3BO40.05，1L微量元素溶液中含有5mol HCl。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵是将生产菌株活化后，以3％的接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖，于3L发酵罐、35-37℃、600-800rpm条件下培养52-72h。

说明书

一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

[0002] 乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

[0003] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。201510394205.7构建的重组枯草芽孢杆菌(BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNA1)可在合成培养基中较快生长、发酵生产乙酰氨基葡萄糖，但是存在乙酰氨基葡萄糖产量(3g/L)较低的缺点。因此，如何提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量以进一步提高GlcNAc产量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。

发明内容

[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种敲除pckA促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法。由于培养基中含有葡萄糖时，枯草芽孢杆菌主要采用磷酸转运途径转运葡萄糖，利用磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸根将培养基中葡萄糖磷酸化并转运至胞内，在该过程中会产生大量的丙酮酸，而且磷酸烯醇式丙酮酸还可以通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶转化为丙酮酸。所以本发明通过阻断宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，最终提高了乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量、提高GlcNAc产量。

[0005] 本发明的第一个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因(pckA)，命名为重组枯草芽孢杆菌BSGNKA。

[0006] 所述枯草芽孢杆菌BSGNK，以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并在此基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK(NCBI上Gene ID:938206)。

[0007] 在本发明的一种实施方式中，通过pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。

[0008] 在本发明的一种实施方式中，以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达的重组菌命名为BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1，具体构建方法可参见文献Liu,Y.et al.Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production.Metab.Eng.23:42-52,2014。

[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNK，是专利申请201510394205.7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI中gene ID：937235所示的基因。

[0011] 本发明第二个目的是提供一种所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是先构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因敲除框，经同源重组将敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌BSGNK基因组中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pckA，阻断了宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量，促进了乙酰氨基葡萄糖积累。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述敲除框的序列如SEQ ID NO.1所示。

[0013] 本发明的第三个目的是提供一种促进枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，是以所述重组枯草芽孢杆菌BSGNKA为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵，使用的发酵培养基按g/L计，含有：初始葡萄糖20，蛋白胨6，酵母粉12，(NH4)SO46,K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素溶液10-15ml；其中微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0，CoCl 2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.2，Alcl3·6H2O 0.1，Cucl2·H2O 0.1，H3BO40.05，含5M HCl(即1L微量元素溶液中含有5mol HCl)。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵，是将生产菌株活化后，以3％的接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖，于3L发酵罐、35-37℃、600-800rpm条件下培养52-72h。

[0016] 本发明的有益效果：

[0017] 本发明的重组枯草芽孢杆菌BSGNKA，是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因(pckA)得到的，与出发菌株BSGNK相比，其乙酰氨基葡萄糖胞外积累量提高了28.1％，浓度可达到29.27g/L。同时，本发明的BSGNKA菌株的乙酰氨基葡萄糖比合成速率比对照菌株BSGNK提高了46.5％，副产物乙偶姻的产量仅为对照菌株的68.5％。本发明通过敲除pckA基因，可以有效的减少副产物生成，提高GlcNAc的积累。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

具体实施方式

[0018] 乙酰氨基葡萄糖的测定方法：

[0019] 高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，RID检测器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。

[0020] 发酵液中葡萄糖浓度的检测：SBA生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)。

[0021] 种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

[0022] 发酵培养基(g/L)，为合成培养基：初始葡萄糖20，蛋白胨6，酵母粉12，(NH4)SO46,K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0，Cocl 2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.2，Alcl3·6H2O 
0.1，Cucl 2·H2O0.1，H3BO40.05，含5M HCl。

[0023] 培养条件：将37℃、220rpm下培养8h的种子以3％的接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖5g/L，于3L发酵罐、35-37℃、600-800rpm条件下培养。

[0024] 实施例1：敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA

[0025] 根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA的上下游序列，以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如SEQ ID NO.1所示的敲除框。

[0026] 将构建好的敲除框转化重组枯草芽孢杆菌BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNA1(即专利申请201510394205.7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK)，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pckA)敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKA。重组枯草芽孢杆菌BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNA1是在文献(Liu,Y.et al.Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production.Metab.Eng.23:42-52,2014)构建的BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1的基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK，pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。

[0027] 实施例2：发酵生产乙酰氨基葡萄糖

[0028] 将37℃、220rpm下培养8h的种子以3％的接种量转入发酵培养基，于3L发酵罐、35-37℃、600-800rpm条件下培养52-72h。发酵52h时，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到
29.27g/L，与对照菌BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNA1相比提高了28.1％(结果如表1所示)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。此外，本发明的BSGNKA菌株的乙酰氨基葡萄糖比合成速率达到0.085g/g DCW/h，与对照菌株BSGNK相比，提高了46.5％。同时本发明菌株副产物乙偶姻的产量为23.5g/L，是对照菌株的68.5％。因此通过敲除pckA基因，可以有效的减少副产物生成，提高GlcNAc的积累。

[0029] 表1GlcNAc的比合成速率、产量以及副产物产量的比较

[0030]

[0031] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。