一种铁皮石斛干细胞的培养方法及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种铁皮石斛干细胞的培养方法及其应用。本发明铁皮石斛干细胞的培养方法具有分化明显、增殖快并且周期短的优点。制备的铁皮石斛干细胞具有明显的抗氧化和抗衰老活性，可以广泛的应用于药品、化妆品以及保健品领域。

权利要求

1.一种铁皮石斛干细胞的培养方法，具体步骤如下：

1)取切除根冠的铁皮石斛根尖，清洗，灭菌消毒；

2)将步骤1得到的铁皮石斛根尖切成5mm小块，接种至筛选培养基上，培养温度为25-29℃，避光培养5-10天，获得形成层来源的铁皮石斛干细胞；所述筛选培养基为含有0.01-

0.5mg/L的6-BA、0.01-0.8mg/L的TDZ和0.01-0.8mg/L的三十烷醇的B5培养基，

3)将形成层来源的铁皮石斛干细胞转移至液态培养基中培养增殖；所述液态培养基为含有0.01-0.5mg/L的6-BA、5-20mg/L的蔗糖、0.01-0.8mg/L的甲基茉莉酮酸酯和0.01-

0.8mg/L的三十烷醇的B5培养基；

4)将步骤3) 培养收集的形成层来源的铁皮石斛干细胞移入气升式生物反应器内扩大培养，培养液使用步骤3) 的液态培养液，在常温下不断搅拌；培养5天后过滤收获铁皮石斛干细胞。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述筛选培养基为含有0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的TDZ和0.05mg/L的三十烷醇的B5培养基，pH值为6.7。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述液态培养基为含有0.1mg/L的6-BA、15mg/L的蔗糖、0.5mg/L的甲基茉莉酮酸酯和0.1mg/L的三十烷醇的B5培养基，pH值为

6.2。

说明书

一种铁皮石斛干细胞的培养方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种铁皮石斛干细胞的培养方法及其应用。

背景技术

[0002] 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科(Orchidaceae)石斛属多年生附生草本植物，又名黑节草。铁皮石斛经烘干加工而成的螺旋状体，称为“铁皮枫斗”。铁皮石斛分布于我国西南和江南各省，多附生于阴湿的树干或岩石缝隙中。由于铁皮石斛自然条件下繁殖率及成活率极低，生长周期长，野生的铁皮石斛已濒临灭绝。

[0003] 植物干细胞又称为分生组织，是植物生长发育的源泉和信号调控中心。由于植物干细胞是未分化的细胞，因此具有很强的自我更新和持续分裂能力，是拥有永久生存能力的“不朽细胞”；此外，植物干细胞还可以通过自我凋亡防止遗传性损伤，避免将有缺陷的DNA遗传下去，从而保护植物不受恶劣环境的影响。

[0004] 由植物细胞培养活性物质的生产与从植物直接提取的方法相比具有多种优点，前者不受外部环境的影响，可持续性地生产，因此被认为是可解决生态系统破坏的较佳方法。铁皮石斛干细胞含有较多的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等高活性酶；因此，铁皮石斛干细胞具有较强的抗氧化的作用，是一种纯天然、环保、无污染的抗衰老植物干细胞。

[0005] 然而，由于植物细胞培养技术在培养期间无法维持稳定的，较快的细胞增殖与高的代谢产物的问题，限制了铁皮石斛抗衰老植物干细胞的应用。为了解决该问题，中国专利申请CN201410486185.1公开了一种铁皮石斛干细胞及其分离培养方法，该方法是从铁皮石斛根尖静止中心的细胞系开始培养，获得稳定遗传的植物干细胞进行培养，该培养方法解决了铁皮石斛离体材料易褐化的问题，由于其干细胞系的细胞尚未分化，具有细胞活性强的优点；但是，静止中心的干细胞具有较长的细胞周期，细胞培养需要较长的时间，不能维持稳定的，较快的细胞增殖，无法满足植物细胞培养技术的产业化生产。因此，研究一种细胞培养周期短，细胞增殖速度快的铁皮石斛细胞培养技术推动植物干细胞的应用是亟需解决的难题。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供一种铁皮石斛干细胞的培养方法，具体步骤如下：

[0007] 1)取切除根冠的铁皮石斛根尖，清洗，灭菌消毒；

[0008] 2)将步骤1得到的铁皮石斛根尖切成5mm小块，接种至筛选培养基上，培养温度为25-29℃，避光培养5-10天，获得形成层来源的铁皮石斛干细胞；

[0009] 3)将形成层来源的铁皮石斛干细胞转移至液态培养基中培养增殖；

[0010] 4)将步骤3培养收集的形成层来源的铁皮石斛干细胞移入气升式生物反应器内扩大培养，培养液使用步骤3的液态培养液，在常温下不断搅拌；培养5天后过滤收获铁皮石斛干细胞。

[0011] 在本发明又一个实施方案中，步骤2)中的筛选培养基中包含以下物质中的一种或多种，所述物质选自，包括但不限于，甲基茉莉酮酸酯、真菌提取物、细菌提取物、酵母提取物、壳聚糖、葡甘露聚糖、葡聚糖、苯丙氨酸、苯甲酸、水杨酸、花生四烯酸、马尿酸、硝酸铯铵、硫酸锌、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、柠檬酸、甘氨酸、α-萘乙酸、蔗糖、活性炭、AgNO3、硫酸氧钒、p-氨基苯甲酸、N-苯基–N’-1,2,3-噻二唑-5-脲(TDZ)、油菜素、类固醇、三十烷醇、藻酸钠和/或醋酸钠。在优选的实施方案中，所述筛选培养基为含有0.01-0.5mg/L的6-BA、0.01-0.8mg/L的TDZ和0.01-0.8mg/L的三十烷醇的B5培养基。在更进一步地实施方案中，所述筛选培养基为含有0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的TDZ和0.05mg/L的三十烷醇的B5培养基，pH值为6.7。

[0012] 在本发明另一个实施方案中，步骤3)中所述液态培养基为含有0.01-0.5mg/L的6-BA、5-20mg/L的蔗糖、0.01-0.8mg/L的甲基茉莉酮酸酯和0.01-0.8mg/L的三十烷醇的B5培养基。在更进一步地实施方案中，所述液态培养基为含有0.1mg/L的6-BA、15mg/L的蔗糖、0.5mg/L的甲基茉莉酮酸酯和0.1mg/L的三十烷醇的B5培养基，pH值为6.2。

[0013] 本发明的另一个目的是提供上述培养方法制备的铁皮石斛干细胞。经本发明培养方法制备的铁皮石斛干细胞可以通过破碎、过滤、干燥得到铁皮石斛干细胞干粉；并且其具有极佳的抗氧化和抗衰老的作用，可以广泛的应用于药品、化妆品以及保健品领域。

[0014] 本发明的另一个目的是提供所述铁皮石斛干细胞在制备抗衰老药品、化妆品或保健品中的应用。

[0015] 本发明的优势：

[0016] 本发明铁皮石斛干细胞的培养方法具有分化明显、增殖快并且周期短的优点。制备的铁皮石斛干细胞具有明显的抗氧化和抗衰老活性，可以广泛的应用于药品、化妆品以及保健品领域。

具体实施方式

[0017] 下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1铁皮石斛干细胞的培养

[0018] 1)取切除根冠的铁皮石斛根尖，用水清洗3h后用浓度为75％酒精表面消毒15s，无菌水冲洗4次；再用浓度1％苯菌灵溶液消毒10min，无菌水冲洗4次，备用；

[0019] 2)将步骤1得到的铁皮石斛根尖切成5mm小块，接种至筛选培养基上，培养温度为25-29℃，避光培养5-10天，获得形成层来源的铁皮石斛干细胞；筛选培养基为含有0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的TDZ和0.05mg/L的三十烷醇的B5培养基，pH值为6.7。

[0020] 3)将形成层来源的铁皮石斛干细胞转移至液态培养基中培养；液态培养基为含有0.1mg/L的6-BA、15mg/L的蔗糖、0.5mg/L的甲基茉莉酮酸酯和0.1mg/L的三十烷醇的B5培养基，pH值为6.2，培养3天。

[0021] 4)将步骤3培养收集的形成层来源的铁皮石斛干细胞移入10L气升式生物反应器内扩大培养，培养液使用步骤3的液态培养液，在25℃下不断搅拌；培养5天后，通过1μm过滤器过滤，将截留的细胞系培养物取出，收获铁皮石斛干细胞。

[0022] 实施例2不同培养基条件下铁皮石斛干细胞得率考察

[0023] 按照实施例1的方法，取等量的铁皮石斛根尖进行干细胞培养，区别仅在于采用不同的筛选培养基和液态培养基，具体如下：

[0024]

[0025] 对培养得到的铁皮石斛干细胞低温冷冻3小时后进行超声破碎、冻干得铁皮石斛干细胞干粉，称取每次获得干粉重量，每组平行实验5次，取平均值，具体结果如下：

[0026]

[0027] 实施例3不同培养基条件下铁皮石斛干细胞抗氧化活性考察

[0028] 取人真皮成纤维细胞(HDF)进行培养，当人真皮成纤维细胞生长至80％融合时，其中对照组用锡纸包住细胞培养瓶，将细胞培养瓶用UVA紫外线照射HDF细胞，每天照射2h，照射4天。在显微镜下观察HDF细胞的形态，发现HDF细胞开始出现皱缩，个别细胞漂浮在培养基中；第五天，给药组加入不同组别制备的铁皮石斛干细胞干粉终浓度为10μg/ml，模型组给予等量的培养基，继续培养48h，收集HDF细胞；裂解液裂解，4℃条件下离心10min，取上清采用SOD检测试剂盒测定SOD活性，具体结果如下：

[0029]  SOD(U/ml)
对照组 97.6±6.1
模型组 48.7±3.2
实施例1 92.4±5.9
对比例1 76.8±5.5
对比例2 71.8±5.2
对比例3 75.4±4.8
对比例4 77.3±5.3
对比例5 76.9±5.7

[0030] 其中，对比例5为专利CN201510298690说明书实施例2制备的铁皮石斛干细胞干粉。

[0031] 实施例4不同培养基条件下铁皮石斛干细胞抗衰老活性考察

[0032] 取快速老化模型小鼠SAM-P/8，雌雄各半，随机分组，每组15只，各给药组给予添加铁皮石斛干细胞干粉的普通饲料(干粉含量为10g/kg)，对照组给予普通饲料，常规条件饲养，在饲养3个月时进行眼眶取血，离心取血清，测定血清中SOD和GSH-Px活性，再饲养3个月后统计各组小鼠寿命及死亡率。

[0033] 具体结果如下：

[0034] 1、饲养3个月后各组小鼠血清中SOD和GSH-Px活性

[0035]  SOD(U/ml) GSH-Px(U/ml)
对照组 19.3±2.3 394.2±21.8

[0036]实施例1 26.7±2.5 578.6±33.4
对比例1 21.4±1.9 447.8±23.7
对比例2 21.9±2.1 459.2±25.1
对比例3 22.4±3.2 455.7±32.3
对比例4 21.6±2.4 481.9±24.2
对比例5 22.9±2.6 513.2±30.9

[0037] 2、饲养6个月后各组小鼠平均寿命及死亡率

[0038]  死亡率(％) 平均寿命(天)
对照组 41.8 101.6
实施例1 0 180
对比例1 15.7 127.4
对比例2 16.2 124.8
对比例3 13.3 133.7
对比例4 14.1 130.9
对比例5 10.4 141.4

[0039] 本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。