一种尿激酶分离纯化方法

摘要

本发明涉及一种尿激酶分离纯化方法，其特征在于，其包含如下步骤，1）尿激酶的分离2）尿激酶的分离纯化所述的步骤1）具体包括以下步骤：a）男性尿液，在10℃以下，调节pH8.5，静置2小时，弃去沉淀，得上清液；b）取上清液，调pH5.0?5.5酸化，得酸化尿，通过硅藻土柱进行吸附；c）5℃冷水洗柱，以1%氨水和氯化钠进行洗脱，得洗脱液；d）洗脱液用饱和硫酸铵和4%氨水盐析，得尿激酶粗品；e）向沉淀中加入一定量的氨水，使沉淀中的尿激酶充分解离，得尿激酶溶液。

权利要求

1.一种尿激酶分离纯化方法，其特征在于，其包含如下步骤，

1）尿激酶的分离

2）尿激酶的纯化

所述的步骤1）具体包括以下步骤：

a）男性尿液，在10℃以下，调节pH8.5，静置2 小时，弃去沉淀，得上清液；

b）取上清液，调pH5.0-5.5酸化，得酸化尿，通过硅藻土柱进行吸附；

c）5℃冷水洗柱，以1% 氨水和氯化钠进行洗脱，得洗脱液；

d）洗脱液用饱和硫酸铵和4% 氨水盐析，得尿激酶粗品；

e）向沉淀中加入一定量的氨水，使沉淀中的尿激酶充分解离，得尿激酶溶液；

所述的步骤2 包括以下步骤：

A1）再生介质，用6倍柱体积的1% 脱氧胆酸钠洗涤凝胶介质，然后用8倍柱体积水洗涤凝胶介质；

A2）凝胶介质预处理，称凝胶介质，混悬于蒸馏水，1 小时后倾去上层细粒，按每克凝胶介质加0.5N NaOH 溶液 15ml 的比例，将凝胶介质浸泡于0.5N NaOH溶液中，搅匀，静置30分钟，抽滤，蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5N HCl溶液同上操作过程处理，最后以

0.5NNaOH 溶液再处理一次，处理完后，将凝胶介质浸泡于0.1M pH 7.4 磷酸盐缓冲液中过夜；

A3) 装柱，将凝胶介质混悬，取适量的凝胶装填于层析柱中，用3~5 倍柱体积的水或缓冲液洗涤凝胶；装柱；

B）平衡介质，用5~10 倍柱体积的pH 为8 的0.02M 磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱，平衡时流速为1BV/h；

C）上样，将尿激酶溶液通过凝胶柱；

D）收集样品流出液，收集洗脱液与流出液合并，即为去内毒素的尿激酶；

E）样品保存，尿激酶立即冻干或是加50% 丙三醇保存于-10℃以下；

F）样品检测，样品进行内毒素检测试验，内毒素应小于1 EU/ 万尿激酶单位。

2.根据权利要求1 所述的尿激酶分离纯化方法，其特征在于，C）上样，将尿激酶溶液通过凝胶柱；所述的尿激酶浓度不大于8.1 万IU/ml。

3.根据权利要求1 所述的尿激酶分离纯化方法，其特征在于，所述步骤C）上样中的上样量与柱体积的比为1-3:1，上样步骤中流速小于1BV/h。

4.根据权利要求1 所述的尿激酶分离纯化方法，其特征在于，所述步骤C）尿激酶溶液pH 为 7~8.5。

5.根据权利要求4所述的尿激酶分离纯化方法，其特征在于，所述步骤C）尿激酶溶液pH 为7.5-8。

6.根据权利要求1 所述的尿激酶分离纯化方法，其特征在于，所述的凝胶填料为Polymyxin B-Agarose 即多粘菌素B 亲和介质；阴离子交换剂：DEAE-Sephadex A-25、DEAE-Sephadex A-50、QAE-Sephadex A-25、QAE-Sephadex A-50、DEAE-纤维素，TEAE-纤维素；离子交换树脂：Amberlit IRC-938、Amberlit IRA-911。

说明书

一种尿激酶分离纯化方法

技术领域

[0001] 本发明属于天然产物分离提取领域，具体涉及一种尿激酶的尿激酶分离方法。

背景技术

[0002] 尿激酶为从健康人尿中分离的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白。尿激酶是溶血栓药物，但它并不直接用于血块本身，而是首先激活体内的纤溶酶脘，成为有活性的纤溶酶，纤溶酶作用于纤维蛋白酶凝块，使其分解成可溶性多碳。 尿激酶在冻干状态下可稳定数年，1mg/ml的无菌溶液可以在冰箱中保存数月，在盐浓度低于0.03MNaCl时稳定性下降，在极低的盐浓度时，随着酶的失活产生沉淀，人血蛋白或明胶可防止酶的表面变性作用。

[0003] 尿激酶通常以两种分子形式存在，即分子量36000和54000，尿激酶作为一种活性物质，在纯化过程中要注意防止失活。大分子量的尿激酶活性较小分子量尿激酶活性强得多，提高比活，一是要去除杂蛋白，二是要除去小分子量尿激酶。尿激酶精品中不能含有热原物质，若检验出热原物质，要作除热原处理。中国药典2005年以前测定注射剂中的热原。内毒素是热源的一种，其是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖。脂多糖对宿主有毒性。自
2005年之后药典规定，尿激酶注射剂中内毒素不得超过1EU/万尿激酶单位。内毒素不是蛋白质，其非常耐热，其分子量在10万左右，膜过滤方式无法将内毒素与尿激酶分离。采用活性炭吸附，尿激酶也会被吸附，是产率大大降低。在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2到4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性，而上述条件下，尿激酶必然导致失活，在尿激酶的纯化中上述方法均不可行。

发明内容

[0004] 为了解决分离尿激酶中内毒素的问题，保证尿激酶用于注射制剂时，所含有的内毒素能达到国家标准，本发明提供一种温和的，低污染纯化尿激酶的方法，本发明提供一种尿激酶分离纯化方法，其特征在于，其包含如下步骤

[0005] 1）尿激酶的分离

[0006] 2）尿激酶的纯化

[0007] 所述的步骤1）具体包括以下步骤：

[0008] a）男性尿液，在10℃以下，调节pH8.5，静置2小时，弃去沉淀，得上清液；

[0009] b）取上清液，调pH5.0-5.5酸化，得酸化尿，通过硅藻土柱进行吸附；

[0010] c）5℃冷水洗柱，以1%氨水和氯化钠进行洗脱，得洗脱液；

[0011] d）洗脱液用饱和硫酸铵和4%氨水盐析，得尿激酶粗品；

[0012] e）向沉淀中加入一定量的氨水，使沉淀中的尿激酶充分解离，得尿激酶溶液；

[0013] 所述的步骤2包括以下步骤：

[0014] A) 装柱，将凝胶介质混悬，取适量的凝胶装填于层析柱中，用3~5倍柱体积的水或缓冲液洗涤凝胶；装柱；

[0015] B）平衡介质，用5~10倍柱体积的样品缓冲液平衡凝胶柱；

[0016] C）上样，将尿激酶溶液通过凝胶柱；

[0017] D）收集样品流出液，收集洗脱液与流出液合并，即为去内毒素的尿激酶。

[0018] 优选地，

[0019] 在步骤A）前还包括以下步骤，

[0020] A1）再生介质，用6倍柱体积的1%脱氧胆酸钠洗涤凝胶介质，然后用8倍柱体积水洗涤凝胶介质；

[0021] A2）凝胶介质预处理，称凝胶介质，混悬于蒸馏水，1小时后倾去上层细粒，按每克凝胶介质加0.5N NaOH溶液 15ml的比例，将凝胶介质浸泡于0.5N NaOH溶液中，搅匀，静置30分钟，抽滤，蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5N HCl溶液同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH溶液再处理一次，处理完后，将凝胶介质浸泡于0.1M pH 7.4 磷酸盐缓冲液中过夜。

[0022] 进一步优选地，

[0023] D）步骤后还包括以下步骤：

[0024] F）样品保存，尿激酶立即冻干或是加50%丙三醇保存于-10℃以下；

[0025] G）样品检测，样品进行内毒素检测试验，内毒素应小于1 EU/万尿激酶单位。

[0026] 优选地，

[0027] 平衡介质步骤中使用pH为8的0.02M磷酸盐缓冲液，平衡时流速为1BV/h。

[0028] 优选地，

[0029] C）上样，将尿激酶溶液通过凝胶柱；所述的尿激酶浓度地不大于8.1万IU/ml。

[0030] 优选地，

[0031] 所述步骤C）上样中的上样量与柱体积的比为1-3:1，上样步骤中流速小于1BV/h。

[0032] 所述步骤C）尿激酶溶液pH为 7~8.5，优选为7.5-8。

[0033] 所述的B）平衡介质中所述缓冲液为pH=8.0的0.02M磷酸盐缓冲液，平衡时流速为1BV/h。

[0034] 更进一步优选地，

[0035] 所述的凝胶填料为Polymyxin B-Agarose即多粘菌素B亲和介质、阴离子交换剂：DEAE-Sephadex A-25、DEAE-Sephadex A-50、QAE- Sephadex A-25、QAE- Sephadex A-50、DEAE-纤维素，TEAE-纤维素，离子交换树脂：Amberlit IRC-938，Amberlit IRA-911。

[0036] 本发明的尿激酶分离纯化方法避免使用强酸强碱，能有效分离内毒素，同时保证尿激酶不被破坏，分离效果能达到药典标准要求，收率在97%以上。

具体实施方式

[0037] 实施例1 尿激酶粗品的制备

[0038] a）男性尿液，在10℃以下，调节pH8.5，静置2 小时，弃去沉淀，得上清液；

[0039] b）取上清液，调pH5.0-5.5酸化，得酸化尿，通过硅藻土柱进行吸附；

[0040] c）5℃冷水洗柱，以1%氨水和氯化钠进行洗脱，得洗脱液；

[0041] d）洗脱液用饱和硫酸铵和4%氨水盐析，得尿激酶粗品；

[0042] e）向沉淀中加入一定量的氨水，使沉淀中的尿激酶充分解离，得尿激酶溶液；

[0043] 实施例2

[0044] 1）再生介质，用6倍柱体积的1%脱氧胆酸钠洗涤QAE- Sephadex凝胶介质，然后用8倍柱体积水洗涤凝胶介质；

[0045] 2）凝胶介质预处理，称凝胶介质，混悬于蒸馏水，1小时后倾去上层细粒，按每克凝胶介质加0.5N NaOH溶液 15ml的比例，将凝胶介质浸泡于0.5N NaOH溶液中，搅匀，静置30分钟，抽滤，蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5N HCl溶液同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH溶液再处理一次，处理完后，将凝胶介质浸泡于0.1M pH 7.4 磷酸盐缓冲液中过夜；

[0046] 3）装柱，将凝胶介质混悬，取适量的凝胶装填于层析柱中，用3~5倍柱体积的水或缓冲液洗涤凝胶；装柱；

[0047] 4）平衡介质，用5~10倍柱体积的样品pH为8的0.02M磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱，平衡时流速为1BV/h；

[0048] 5）上样，将步骤e）得到的尿激酶溶液通过凝胶柱，所述的尿激酶溶液配置成浓度为6.1万IU/ml， pH为7.5的溶液，上样量与柱体积的比为1:1，流速小于1BV/h，[0049] 6）收集样品流出液，收集洗脱液与流出液合并，即为去内毒素的尿激酶；

[0050] 7）样品保存，尿激酶立即冻干或是加50%丙三醇保存于-10℃以下；

[0051] 8）样品检测，尿激酶样品进行内毒素检测试验，内毒素应小于1 EU/万尿激酶单位。

[0052] 实施例3

[0053] 1）再生介质，用6倍柱体积的1%脱氧胆酸钠洗涤DEAE-Sephadex凝胶介质，然后用8倍柱体积水洗涤凝胶介质；

[0054] 2）凝胶介质预处理，称凝胶介质，混悬于蒸馏水，1小时后倾去上层细粒，按每克凝胶介质加0.5N NaOH溶液 15ml的比例，将凝胶介质浸泡于0.5N NaOH溶液中，搅匀，静置30分钟，抽滤，蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5N HCl溶液同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH溶液再处理一次，处理完后，将凝胶介质浸泡于0.1M pH 7.4 磷酸盐缓冲液中过夜。

[0055] 3）装柱，将凝胶介质混悬，取适量的凝胶装填于层析柱中，用3~5倍柱体积的水或缓冲液洗涤凝胶；装柱；

[0056] 4）平衡介质，用5~10倍柱体积的样品缓冲液平衡凝胶柱

[0057] 5）上样，将尿激酶溶液通过凝胶柱，所述的尿激酶浓度为7.1万IU/ml，尿激酶溶液pH为8，上样量与柱体积的比为1:2，流速小于1BV/h；

[0058] 6）收集样品流出液，收集洗脱液与流出液合并，即为去内毒素的尿激酶；

[0059] 7）样品保存，尿激酶样品立即冻干或是加50%丙三醇保存于-10℃以下；

[0060] 8）样品检测，样品进行内毒素检测试验，内毒素应小于1 EU/万尿激酶单位。

[0061] 实施例4

[0062] 1）再生介质，用6倍柱体积的1%脱氧胆酸钠洗涤DEAE-Sephadex凝胶介质，然后用8倍柱体积水洗涤凝胶介质；

[0063] 2）凝胶介质预处理，称凝胶介质，混悬于蒸馏水，1小时后倾去上层细粒，按每克凝胶介质加0.5N NaOH溶液 15ml的比例，将凝胶介质浸泡于0.5N NaOH溶液中，搅匀，静置30分钟，抽滤，蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5N HCl溶液同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH溶液再处理一次，处理完后，将凝胶介质浸泡于0.1M pH 7.4 磷酸盐缓冲液中过夜。

[0064] 3）装柱，将凝胶介质混悬，取适量的凝胶装填于层析柱中，用3~5倍柱体积的水或缓冲液洗涤凝胶；装柱；

[0065] 4）平衡介质，用5~10倍柱体积的样品缓冲液平衡凝胶柱

[0066] 5）上样，将尿激酶溶液通过凝胶柱，所述的尿激酶浓度为6.1万IU/ml，尿激酶溶液pH为8.0，上样量与柱体积的比为1:1，流速小于1BV/h；

[0067] 6）收集样品流出液，收集洗脱液与流出液合并，即为去内毒素的尿激酶；

[0068] 7）样品保存，尿激酶立即冻干或是加50%丙三醇保存于-10℃以下；

[0069] 8）样品检测，尿激酶样品进行内毒素检测试验，内毒素应小于1 EU/万尿激酶单位。

[0070] 实施例5

[0071] 1）再生介质，用6倍柱体积的1%脱氧胆酸钠洗涤DEAE-Sephadex凝胶介质，然后用8倍柱体积水洗涤凝胶介质；

[0072] 2）凝胶介质预处理，称凝胶介质，混悬于蒸馏水，1小时后倾去上层细粒，按每克凝胶介质加0.5N NaOH溶液 15ml的比例，将凝胶介质浸泡于0.5N NaOH溶液中，搅匀，静置30分钟，抽滤，蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5N HCl溶液同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH溶液再处理一次，处理完后，将凝胶介质浸泡于0.1M pH 7.4 磷酸盐缓冲液中过夜。

[0073] 3）装柱，将凝胶介质混悬，取适量的凝胶装填于层析柱中，用3~5倍柱体积的水或缓冲液洗涤凝胶；装柱；

[0074] 4）平衡介质，用5~10倍柱体积的样品缓冲液平衡凝胶柱

[0075] 5）上样，将尿激酶溶液通过凝胶柱，所述的尿激酶浓度为8.1万IU/ml，尿激酶溶液pH为8.5，上样量与柱体积的比为1:3，流速小于1BV/h；

[0076] 6）收集样品流出液，收集洗脱液与流出液合并，即为去内毒素的尿激酶；

[0077] 7）样品保存，尿激酶立即冻干或是加50%丙三醇保存于-10℃以下；

[0078] 8）样品检测，样品进行内毒素检测试验，内毒素应小于1 EU/万尿激酶单位。

[0079] 试验例1、考察上样液pH值对尿激酶的吸附情况和对内毒素的去除情况。

[0080] 柱平衡液pH为8.0的0.02M磷酸盐缓冲液，平衡时流速为1BV/h。量取尿激酶粗品，测得酶活性为611320IU/ml的样液，5份，每份2ml分别电导调节为8-11ms范围，调节pH为6.51，7.00，7.5，8.0，8.5，体积为20ml，过平衡好的装有DEAE-Sephadex柱子，固定流速为
1BV/h，收集流出液体约0.5BV以后的流出液，测定流出液的酶活性和细菌内毒素。

[0081] DEAE上样条件的数据

[0082]

[0083] 综合实验结果表明上样液pH值条件为7.5-8.0范围时尿激酶活性的损耗最小，且去除内毒素的效果很好。

[0084] 2、上样尿激酶浓度考察

[0085] 取酶活性为611320IU/ml尿激酶粗品溶液等分后，每份注射用水配置成不同酶浓度的样液，总效价是一致的，其含有的内毒素也是相同的，取样液4份，每份2ml，依次稀释5倍、7.5倍、10倍、20倍，同时电导调节在8-11ms范围，调节pH为8，过处理好的装有DEAE-Sephadex的柱子，固定流速为1BV/h，收集开始加入上样液体后流出液体约0.5BV后的流出液，测定流出液的酶活性和细菌内毒素。

[0086] DEAE上样尿激酶浓度的考察数据

[0087]

[0088] 上面数据表明，在流速为1BV/h时，当尿激酶的浓度达到12万IU/ml时，20mlDEAE Bio-sep FF填料对内毒素的吸附能力明显降低，未达到药典规定的标准，而尿激酶的浓度在8.1万IU/ml以下时，尿激酶的内毒素含量都能达到要求。

[0089] 3、上样量考察

[0090] 量取酶活性为611320IU/ml的样液30ml，电导调节在8-11ms范围，同时调节pH值到8.0，量取20、40、60、80、100ml稀释后的溶液，分别通过5根处理好平衡好的柱体积为20ml的