促进植物根伸长的小分子激动剂及其应用

摘要

本发明公开了一种小分子激动剂在植物根伸长调节中的应用，所述小分子激动剂的化学结构式为：本发明提供的促进植物根伸长的小分子激动剂及其应用，解决了现有技术中植物生根困难的技术问题，特别是对于移植的植物在新的环境下无法生根，植物发育和生长所需要的营养物质和水分得不到保证，而造成植物很快萎蔫，最后导致死亡的问题。

权利要求

1.一种小分子激动剂在植物根伸长调节中的应用，所述小分子激动剂的化学结构式为：所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子激动剂通过高通量筛选方法获得。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：(1)准备野生型拟南芥Col-0、拟南芥突变体eto1-2和拟南芥突变体ctr1-1的种子；

(2)将步骤(1)准备的野生型和突变体的种子消毒后培养，并向种子中加入小分子文库中的小分子；

(3)根据拟南芥黄化苗根长变化筛选出使根伸长的小分子。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述拟南芥突变体eto1-2是乙烯合成过量的突变体，所述拟南芥突变体ctr1-1是乙烯信号组成型激活的突变体。

5.一种促进植物根伸长的方法，其特征在于，包括向培育的植物施加小分子激动剂，施加小分子激动剂的浓度为大于0且小于等于10μM，所述小分子激动剂的化学结构式为：所述植物为拟南芥。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述施加小分子激动剂的浓度为5μM。

说明书

促进植物根伸长的小分子激动剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种促进植物根伸长的小分子激动剂及其应用。

背景技术

[0002] 根是植物适应陆地上生活而在进化中逐渐形成的营养器官。根的主要作用是帮助植物附着，并且从土壤里吸收植物生长发育所需的水分和无机盐。此外，土壤中的根还负责与周围的土壤微生物“互动”，形成土壤微环境。因此，对根生长发育的调控在农业生产中显得至关重要。与动物最大的不同是植物不能通过移动来躲避外界环境的刺激，因此当受到环境中生物或者非生物刺激时,植物多通过各种激素如生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯等来调控自身形态建成以及抗逆反应来抵抗刺激。

[0003] 之前的研究多采用经典的正向遗传学来筛选对根生长发育具有调控作用的基因对应的突变体，随着筛选难度的增加，经典的正向遗传学在多基因功能冗余和单基因突变致死的情况中暴露出其弱点。近些年来，化学遗传学在植物学研究中得到了广泛的应用(Toth and van der Hoorn,2010)，通过化学遗传学筛选美国加州大学河滨分校的Sean R.Cutler教授课题组以种子萌发作为表型输出，筛选到了种子萌发的抑制剂pyrabactin，通过对pyrabactin具体作用分子机制的探究，寻找到了植物激素脱落酸ABA的受体，属于START家族的PYR/PYLs蛋白,解决了脱落酸信号转导通路在感知部分的难题，这无疑是化学遗传学在植物激素研究领域的成功事例，这部分工作发表在2009年的《science》杂志上。化学遗传学在植物生长发育上的应用越来越多，基于以上事例，我们希望通过化学遗传学筛选，寻找能够调节拟南芥根生长发育的小分子。之前有过以拟南芥的根长作为表型输出进行化学遗传学的事例(Armstrong et al.,2004)，筛选到的小分子大部分都是以某种方式激活生长素信号，从而抑制拟南芥根的伸长。在农业生产和实践中，植物生根一直是很难解决的问题。根是植物吸收营养和水分的器官，对于整个植物的建成起到了至关重要的作用。在农业生产中，我们更需要一种对农作物的根器官有促进作用的激动剂。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种促进植物根伸长的小分子激动剂及其应用，解决了现有技术中植物生根困难的技术问题，特别是对于移植的植物在新的环境下无法生根，植物发育和生长所需要的营养物质和水分得不到保证，而造成植物很快萎蔫，最后导致死亡的问题。

[0005] 为了解决上述问题，本发明公开了一种小分子激动剂在植物根伸长调节中的应用，所述小分子激动剂的化学结构式为：

[0006]

[0007] 优选地，所述植物为拟南芥。

[0008] 优选地，所述小分子激动剂通过高通量筛选方法获得。

[0009] 优选地，所述筛选方法包括如下步骤：

[0010] (1)准备野生型拟南芥Col-0、拟南芥突变体eto1-2和拟南芥突变体ctr1-1的种子；

[0011] (2)将步骤(1)准备的野生型和突变体的种子消毒后培养，并向种子中加入小分子文库中的小分子；

[0012] (3)根据拟南芥黄化苗根长变化筛选出使根伸长的小分子。

[0013] 优选地，所述拟南芥突变体eto1-2是乙烯合成过量的突变体，所述拟南芥突变体ctr1-1是乙烯信号组成型激活的突变体。

[0014] 本发明还公开了一种促进植物根伸长的方法，包括向培育的植物施加小分子激动剂，施加小分子激动剂的浓度为大于0且小于等于10μM，所述小分子激动剂的化学结构式为：

[0015]

[0016] 优选地，所述施加小分子激动剂的浓度为5μM。

[0017] 优选地，所述植物为拟南芥。

[0018] 本发明具有如下有益效果：

[0019] 本发明通过高通量筛选得到促进植物根伸长的小分子激动剂，该小分子激动剂在合适的浓度条件下能够显著的促进拟南芥根的伸长，对植物生根起到了促进作用。此外，该小分子激动剂仅对拟南芥的根存在促进作用，对下胚轴和子叶的发育都没有毒副影响。对该小分子激动剂进行剂量效应评估，发现小分子对根伸长的促进作用是浓度依赖型，在一定浓度范围内，随着小分子激动剂浓度的升高，其对根伸长的促进作用越来越明显，当浓度达到5μM时，小分子激动剂对根长的促进作用达到最大值；当高于这一浓度时，随着小分子激动剂浓度的升高，反而对根长产生一种抑制效应，这种抑制效应很有可能是由于小分子浓度过高产生的毒副作用。此外，这种小分子激动剂的结构简单，可以在体外完成其化学合成和修饰。便捷的合成步骤也为该小分子激动剂应用到农业生产中奠定了基础。

附图说明

[0020] 图1为为本发明小分子激动剂Ponalrestat(PRT)的筛选流程图；

[0021] 图2为本发明小分子激动剂Ponalrestat(PRT)促进拟南芥黄化苗根的伸长；

[0022] 图3为小分子激动剂Ponalrestat(PRT)干扰根内生长素的稳态；

[0023] 图4为外源施加生长素IAA能够恢复小分子激动剂Ponalrestat(PRT)对根伸长的促进作用。

具体实施方式

[0024] 下文中将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。以下实施例中使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂和材料如无特殊说明，均为市售商品。其中小分子文库为美国加州大学河滨分校杨贞标教授惠赠。

[0025] 实施例1特异性的促进拟南芥根伸长的小分子激动剂的获得

[0026] 利用化学遗传学手段即高通量小分子筛选，对含有2000种小分子的文库进行筛选，获得了特异性的促进拟南芥根伸长的小分子激动剂Ponalrestat，化学式为BrC17FH11N2O3，分子量为391.20，小分子的CAS号码为72702-95-5，小分子文库中的编号为01502078，结构式为

[0027]

[0028] 其中，如图1所示，高通量筛选方法包括如下步骤：

[0029] (1)准备野生型拟南芥Col-0、拟南芥突变体eto1-2和拟南芥突变体ctr1-1的种子；

[0030] (2)将步骤(1)准备的野生型和突变体的种子消毒后培养，并向种子中加入小分子文库中的小分子；

[0031] (3)根据拟南芥黄化苗根长变化筛选出使根伸长的小分子。

[0032] 其中，野生型和突变体的种子消毒后铺在96孔板中，每个孔中控制种子的个数为5-10颗，将铺有种子的96孔板在4℃中放置3天后拿出，用机器人手臂向其中加入小分子文库中的2000种小分子。将加完小分子的96孔板放到黑暗培养箱中避光生长3天，观察并记录在小分子处理后黄化苗根长的变化。

[0033] 本实施例中拟南芥突变体eto1-2是乙烯合成过量的突变体，ctr1-1是乙烯信号组成型激活的突变体，这两个突变体共同的表型是短根。利用突变体的短根表型，能够放大小分子的作用，更容易直观的筛选到能够促进根长的小分子。

[0034] 如图2所示，将小分子按照既定的浓度加入到植物培养基中，用小分子浓度梯度处理3天大小的黄化苗，包括野生型拟南芥Col-0、转基因拟南芥EIN3ox、拟南芥突变体eto1-2和拟南芥突变体ctr1-1，小分子浓度分别为1μM、2μM、5μM、8μM和10μM。图2A结果显示，小分子浓度为5μM的时候，对根伸长的促进作用最为明显。图2B结果显示，小分子对拟南芥黄化苗的下胚轴没有明显的影响。由此推测小分子对下胚轴没有作用可能是因为小分子特异的对根长起到调控作用，也有可能是小分子在植物体内存在运输问题，难以从根逆向运输到下胚轴。图2C显示的是与图2A和图2B统计数据对应的黄花苗根伸长情况的图片。以根长作为表型输出，筛选得到了一个小分子激动剂Ponalrestat，能够特异的促进拟南芥黄化苗根的伸长，但是对下胚轴没有显著影响。

[0035] 实施例2小分子激动剂Ponalrestat对根伸长的促进作用

[0036] 如图3所示，本实施例将筛选得到的小分子激动剂按照既定的浓度加入到植物培养基中，在小分子浓度梯度培养基生长3天大小的黄化苗，小分子浓度分别为1μM、5μM、8μM、10μM、15μM、30μM和50μM。图3A结果显示，小分子能够抑制拟南芥根毛的发生。图3B显示，生长在添加了小分子培养基上的拟南芥幼苗出现了向重力性缺失的表型。根据之前的研究，根的向重力性与植物内源生长素信号有很强的正相关，所以进一步检测植物内源生长素信号，DR5：VENUS报告系统株系能够用VENUS荧光的强弱来指示植物体内生长素信号的强弱。
图3C显示，小分子处理显著减弱了根尖生长素的信号，并且生长在添加了小分子培养基中的幼苗根的生长方向偏离了重力方向，表现出向重力性缺失的表型。

[0037] 如图4所示，在植物生长培养基中添加对应浓度的小分子和植物激素生长素IAA，记录在培养基中暗条件下生长了3天的黄化苗根长，并进行统计分析。植物包括野生型拟南芥Col-0、转基因拟南芥EIN3ox、拟南芥突变体eto1-2和拟南芥突变体ctr1-1，IAA的浓度梯度为10nM、20nM、50nM和100nM。结果可知，当外源施加生长素IAA时，外源施加的IAA能够恢复小分子对根长的促进作用，由此说明，小分子激动剂是通过减少植物内源IAA的含量来达到促进根伸长的目的。

[0038] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。