MicroRNA-155拮抗剂在制备治疗硬皮病的药物中的应用

摘要

本发明提供了MicroRNA‑155拮抗剂在制备治疗硬皮病的药物中的应用。进一步的，所述的MicroRNA‑155拮抗剂的药物剂型为搽剂。通过实验证明，局部或全身抑制miR‑155，可以减少对CK‑1和SHIP‑1抑制，从而导致促纤维化通路Wnt/β‑catenin及Akt信号减弱，采用MicroRNA‑155拮抗剂局部涂抹给药，有效减轻和治愈硬皮病。

权利要求

1.MicroRNA-155拮抗剂在制备治疗硬皮病的药物中的应用，其特征在于：所述的MicroRNA-155拮抗剂的药物剂型为搽剂。

说明书

MicroRNA-155拮抗剂在制备治疗硬皮病的药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及一种硬皮病，具体来说是MicroRNA-155拮抗剂在制备治疗硬皮病的药物中的应用。

背景技术

[0002] 硬皮病是一组以皮肤局部或弥漫性纤维化为特征的自身免疫疾病，部分类型可合并多脏器纤维化，导致患者死亡，其发病起因尚不明确。其中局灶型通常称为硬斑病，系统型一般指系统性硬化症。纤维化是临床难题，目前尚缺乏有效治疗手段。MicroRNA为22碱基左右的非编码小分子RNA，可与mRNA 3’UTR互补结合干扰其翻译，是一种广泛存在的基因转录后调控机制。既往研究已发现多种microRNA在硬皮病患者皮肤成纤维细胞中表达异常，其中包括miR-155的异常上调。但目前对此异常在硬皮病发病中的价值尚无深入研究；更重要的是，目前没有报道证明直接干扰microRNA表达在体内对硬皮病有治疗作用。

[0003] 另一方面，对于局限性硬皮病患者来说，全身治疗可能造成副作用过大而病损局部获益有限的问题，而局部治疗可有效解决此问题。目前microRNA局部给药已在急性冠脉缺血、肌肉损伤、脑损伤等多个疾病模型中获得成功，特别是曾有报道证明皮内注射miR-21可有效治疗银屑病。但皮内注射较之皮外涂抹给药仍可能造成病损皮肤较大损伤。目前国际上尚无皮外涂抹给药干扰microRNA表达治疗皮肤病变的报道，本发明有效的填补了这一空白。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供MicroRNA-155拮抗剂在制备治疗硬皮病的药物中的应用，所述的这种应用解决了现有技术中的药物治疗硬皮病的效果不佳或副作用过大的技术问题。

[0005] 本发明提供了MicroRNA-155拮抗剂在制备治疗硬皮病的药物中的应用。

[0006] 进一步的，所述的MicroRNA-155拮抗剂的药物剂型为搽剂。

[0007] 进一步的，将MicroRNA-155拮抗剂溶解在丙酮中使用。

[0008] 具体的，所述的MicroRNA-155拮抗剂为商业产品，购买自广州锐博生物科技有限公司，产品名称为micrOFF™ mmu-miR-155-5p antagomir, Standard，为3’-胆固醇及2’-OMe修饰。

[0009] 通过实验证明，局部或全身抑制miR-155，可以减少对CK-1和SHIP-1抑制，从而导致促纤维化通路Wnt/β-catenin及Akt信号减弱，采用MicroRNA-155拮抗剂局部涂抹给药，可以有效减轻和治愈硬皮病。

附图说明

[0010] 图1显示了系统性硬化症（SSc，n=12）、硬斑症（morphea，n=7）及健康对照（HD，n=9）皮肤中miR-155表达量。

[0011] 图2（A）显示了SSc患者中miR-155表达量与其皮肤纤维化评分正相关。

[0012] 图2（B）显示了皮下注射博来霉素后C57/BL6小鼠皮肤miR-155表达量。

[0013] 图3 显示了Mir-155沉默可抑制小鼠原代成纤维细胞胶原生成。

[0014] 图4显示了MiR-155在原代皮肤成纤维细胞中通过作用靶点CK1α和SHIP-1调节β-catenin和Akt通路。

[0015] 图 5显示了局部涂抹antagomiR-155可有效治疗博来霉素诱导的皮肤纤维化。

[0016] 图 6显示了AntagomiR-155局部涂抹可调节皮肤Wnt/β-catenin以及Akt通路。

[0017] 图 7显示了 MiR-155基因剔除可减轻博来霉素诱导的皮肤纤维化。

具体实施方式

[0018] 实施例1

[0019] 本发明用Taqman real-time PCR方法检测了局灶或系统性硬皮病患者皮肤中miR-155表达量，同时成功采用博来霉素皮下注射的方法诱导雄性C57/BL6小鼠皮肤纤维化，并检测了造模小鼠皮肤中miR-155表达量。

[0020] 本发明在系统性硬化症患者皮肤中发现，miR-155表达水平显著高于正常对照（图1），与皮肤累及评分mRSS具有正相关性（图2A）。同时本发明检测硬斑症患者皮肤miR-155水平，发现也显著高于正常对照，甚至高于SSc患者（图2A）。这些发现在临床上证实了miR-155在纤维化疾病中的意义。

[0021] 图1显示了系统性硬化症（SSc，n=12）、硬斑症（morphea，n=7）及健康对照（HD，n=9）皮肤中miR-155表达量。*P<0.05, **P<0.01, ANOVA。图2（A）显示了SSc患者中miR-155表达量与其皮肤纤维化评分正相关（线性回归法）。图2（B）显示了皮下注射博来霉素（两组浓度分别为1 mg/ml和5 mg/ml, 每组n=3）后C57/BL6小鼠皮肤miR-155表达量。*P<0.05, **P<0.01, ANOVA。

[0022] 实施例2

[0023] 本发明建立了体外小鼠皮肤原代成纤维细胞培养体系，利用miRNA mimic/inhibitor（广州锐博生物科技有限公司micrON® miRNA mimic及micrOFF® miRNA inhibitor）人为干扰成纤维细胞中miR-155表达后，观察细胞在TGF-β刺激下I型胶原mRNA表达及胶原蛋白合成；采用western blot筛选并验证miR-155对促纤维化通路的影响；采用荧光素酶报告基因系统验证miR-155对靶mRNA的直接作用。

[0024] 在小鼠原代皮肤成纤维细胞体外实验中，本发明证实体外研究发现，抑制miR-155表达可显著抑制小鼠原代皮肤成纤维细胞胶原的合成与分泌，同时造成成纤维细胞表面活化标记表达下降（图3）。进而本发明利用wetern blot，在小鼠皮肤原代成纤维细胞中筛选了主要已知参与系统性硬化症的促纤维化通路，包括Smad、Wnt/β-catenin、Erk、JNK、Akt及p38，发现Wnt/β-catenin及Akt通路可被miR-155调节（图4A）。miR-155 mimic可抑制Akt磷酸化、增加β-catenin降解，而miR-155 inhibitor具有相反作用。生物信息学数据库预测及查阅文献提示Wnt/β-catenin及Akt通路中各自的抑制因子，CK-1和SHIP-1可能是miR-155的直接作用靶点（图4C）。抑制小鼠原代皮肤成纤维细胞miR-155表达后，CK-1和SHIP-1蛋白水平出现上升（图4B、E）。因此可知，抑制miR-155可能减少了其对CK-1及SHIP-1的抑制作用，进而加强了Wnt/β-catenin和Akt通路的负调控，从而导致小鼠纤维化下降。荧光素酶报告基因系统进一步证实了miR-155与CK-1、SHIP-1的mRNA 3’UTR存在直接作用（图4D、F）。

[0025] 图3（A）显示了miR-155可调节I型胶原及α-SMA基因表达。*P<0.05, ANOVA。图3（B）显示了细胞上清液中胶原浓度，Sircol法检测。* P<0.05** P<0.01，t检验。

[0026] 图4（A）显示了miR-155 mimic/inhibitor转染并TGF-β刺激24小时后，促纤维化通路的活化情况。图4（B）显示了miR-155 inhibitor可同时增加CK1α及β-catenin的降解。图4（C）显示了CK1α和SHIP-1的mRNA 3’端非编码区与miR-155结合位点，灰度部分标出了点突变区域。图4（D）显示了荧光素酶报告基因显示CK1α mRNA 3’端非编码区是miR-155的直接作用靶点。***P<0.001, ANOVA。图4（E）显示了miR-155可同时调节SHIP-1蛋白水平和Akt磷酸化；图4（F）显示了SHIP-1 mRNA 3’端非编码区是miR-155的直接作用靶点。

[0027] 实施例3

[0028] 本发明对雄性C57/BL6小鼠皮下注射博来霉素以造成皮肤纤维化模型，并在造模开始2周后于注射处皮肤隔天涂抹miR-155拮抗剂（angtomiR-155）。其中angtomiR-155及随机对照核酸购买自广州锐博生物科技有限公司（micrOFF™ mmu-miR-155-5p antagomir, Standard及micrOFF™ miRNA control#22），均为3’-胆固醇及2’-OMe修饰。涂抹前以先双蒸水后丙酮的顺序将核酸溶于95%的丙酮中，终浓度为0.67nmol/ml。每只小鼠每次涂抹400μL，总量为2.6nmol。

[0029] 在antagomiR-155经皮给药的治疗模型中，Cy3标记证实丙酮溶解的antagomir及随机对照核酸可被透皮吸收（图5A），antagomir可下调皮肤中miR-155表达（图5B、C），而对大部分内脏器官的miR-155表达影响较少。与对随机对照组相比，皮外涂抹antagomiR-155可显著抑制博来霉素诱导的皮肤纤维化（图5D、E），并减少小鼠皮肤中α-SMA阳性的肌成纤维细胞数量（图5E），并能有效抑制皮肤中Akt磷酸化及β-catenin降解（图6）。

[0030] 图5（A）显示了Cy3标记证明antagomiR-155可被C57/BL6小鼠经皮吸收。标尺为100μm。图5（B）显示了C57/BL6小鼠（每组7只）隔天1mg/mL博来霉素（blm）或生理盐水（n.s.）皮下注射造模。造模第15天开始，小鼠予以局部涂抹antagomiR-155（ant155）或随机对照（sc），至28天处死。图5（C）显示了治疗后小鼠皮肤miR-155表达。**P<0.01, ANOVA。图5（D）显示了小鼠皮肤厚度。**P<0.01, ***P<0.001, ANOVA。图4（E）显示了小鼠皮肤天狼星红胶原染色。红色部分为胶原蛋白，绿色为总蛋白，标尺为100μm。图5（F）显示了皮肤α-SMA+肌成纤维细胞数量。***P<0.001, ANOVA。

[0031] 图 6（A）显示了β-catenin、pAkt以及α-SMA的代表性染色。箭头所指为β-catenin或pAkt上调的成纤维细胞。放大部分以星号标出。标尺为20μm。图 6（B）显示了β-catenin和pAkt染色的平均光密度（AOD）统计。*P<0.05，非参数检验。图 6（C）显示了CK1α和SHIP-1的代表性染色，标尺为20μm。

[0032] 实施例4

[0033] 对miR-155基因剔除（miR-155−/−，B6.Cg-Mir155tm1.1Rsky/J，美国Jackson实验室购买）小鼠皮下注射博来霉素，制造皮肤纤维化模型。miR-155−/−以及C57/BL6小鼠（每组n=5）隔日皮下注射博来霉素（blm）或生理盐水（n.s.）。造模21天后处死小鼠。

[0034] 本发明用Sirius Red染色皮肤胶原沉积情况，测量了所有造模小鼠的皮肤厚度，计算其中α-SMA阳性的肌成纤维细胞数量，并采用Western blot评估了小鼠皮肤组织中β-catenin和pAkt蛋白水平。

[0035] 在基因剔除模型中，miR-155−/−小鼠的真皮层厚度及肺纤维化程度显著低于对照小鼠（图7A，B）。并减少小鼠皮肤中α-SMA阳性的肌成纤维细胞数量（图7C）。miR-155基因剔除小鼠皮肤中β-catenin和pAkt蛋白水平低于野生型C57/BL6小鼠（图7D,E）。

[0036] 图7（A）显示了小鼠皮肤和肺部H&E或天狼星红染色。天狼星红染色中，红色为胶原蛋白，绿色为总蛋白。皮肤组织中标尺为100μm，肺部为50μm。图7（B）显示了小鼠皮肤厚度测量。**P<0.01, ANOVA。图7（C）显示了皮肤α-SMA+肌成纤维细胞数量。*P<0.05, ANOVA。图7（D）显示了代表性小鼠皮肤组织中β-catenin和pAkt蛋白western blot。图7（E）显示了β-catenin和pAkt western blot的平均光密度统计。**P<0.01，非参数检验。