本发明公开了一种固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒的方法，属于白酒酿造领域。本发明方法所用的固定化酒曲以马尾松果作为固定的载体，通过米根霉的菌丝将酒曲包裹使其固定在马尾松果的鳞片之间。通过将固定化酒曲加到高粱糖化液中进行第一轮发酵，再回收固定化酒曲加入到高粱糖化液和上轮发酵蒸馏后液体中进行后续多轮发酵，将各轮发酵蒸馏所得的酒进行调配得到酱香型原酒液。本发明通过利用马尾松果来固定酒曲达到增香的目的，用米根霉的菌丝包裹酒曲达到固定酒曲和糖化第一轮发酵原料、减少液化酶和糖化酶用量的目的。
1.一种固定化酒曲的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以鳞片张开充分的马尾松果作为固定载体，将酒曲研磨成粉末喷雾到马尾松果上，然后再喷雾水；
(2)往高粱糖化液中加入蛋白胨和酵母浸膏，接种地衣芽孢杆菌进行培养得到地衣芽孢杆菌扩培菌液；
(3)将米根霉孢子和葡萄糖加到地衣芽孢杆菌扩培菌液，将其喷雾到马尾松果上培养得到固定化酒曲。
2.根据权利要求1所述的固定化酒曲的制备方法，其特征在于：步骤(1)中酒曲粉末和水的喷雾量为每个马尾松果2.5～3.5g酒曲粉末和1.5～2.5mL水。
3.根据权利要求1所述的固定化酒曲的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的蛋白胨和酵母浸膏的加入量为高粱糖化液质量的0.1～2％和0.1～1％；所述的培养条件为30～
4.根据权利要求1所述的固定化酒曲的制备方法，其特征在于：步骤(3)为：将米根霉孢子和葡萄糖加到地衣芽孢杆菌扩培菌液中，调整孢子的浓度为1.5-2.5×108个/mL、葡萄糖的浓度为0.05-0.2g/mL；将含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液喷雾到马尾松果上，喷液量为每个松果2.5-3.5mL；28-32℃培养20-30h后再喷雾含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液，喷液量为每个松果1.5-2.5mL，28-32℃培养30-35h得到固定化酒曲。
5.根据权利要求1所述的固定化酒曲的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以鳞片张开充分的马尾松果作为固定载体，将酒曲研磨成粉末喷雾到马尾松果上，然后再喷雾水，酒曲粉末和水的喷雾量为每个马尾松果3g酒曲粉末和2mL水；
(2)往高粱糖化液中加入其质量1％的蛋白胨和0.5％的酵母浸膏，接种地衣芽孢杆菌于37℃培养28h得到地衣芽孢杆菌扩培菌液；所述的高粱糖化液通过包括如下步骤的方法制备：高粱先用72℃的水浸泡24h再蒸煮12h；然后摊凉至高粱表面的水分完全被吹干，高粱粒与高粱粒之间无粘度，粒粒分散开来；将蒸煮摊凉的高粱与其质量3倍的水混合后用粉浆机粉浆，得到高粱粉浆液；往高粱粉浆液中先后加入液化酶、糖化酶进行液化和糖化，得到高粱糖化液；
(3)将米根霉孢子和葡萄糖加到地衣芽孢杆菌扩培菌液中，调整孢子的浓度为2×108个/mL、葡萄糖的浓度为0.1g/mL；将含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液喷雾到马尾松果上，喷液量为每个松果3mL；30℃培养24h后再喷雾含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液，喷液量为每个松果2mL，30℃培养32h得到固定化酒曲。
6.一种固定化酒曲，其特征在于：通过权利要求1-5任一项所述的方法制备得到。
7.权利要求6所述的固定化酒曲在固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒中的应用。
8.一种固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)第一轮发酵：将高粱糖化液和权利要求6所述的固定化酒曲加到发酵罐中进行发酵，发酵结束后回收固定化酒曲留用于第二轮发酵，发酵醪液进行蒸馏，蒸馏所得酒用于最后的调配，蒸馏后的液体为蒸馏后液体；
(2)第二轮发酵：往高粱粉浆液中加入液化酶，液化后再加入糖化酶，与第一轮发酵的蒸馏后液体和回收的固定化酒曲一起加到发酵罐内进行第二轮发酵，发酵结束后的操作同步骤(1)；
(3)按照第二轮发酵的方法再继续发酵多轮，将各轮发酵蒸馏所得的酒进行调配。
9.根据权利要求8所述的固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的固定化酒曲的加入量为每100mL高粱糖化液4～6个；所述的蒸馏为：在酒度为30度时停止蒸馏，馏酒温度为38-40℃；
步骤(2)中的高粱糖化液与蒸馏后液体的体积比为1～2:2～3。
10.根据权利要求8所述的固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)第一轮发酵：将高粱糖化液和通过权利要求6所述的方法得到的固定化酒曲加入到发酵罐中，固定化酒曲的加入量为每100mL高粱糖化液5个，发酵罐内的高粱糖化液为400L，发酵罐总体积为500L；控制发酵温度为35℃，发酵2d；控制发酵温度为38℃，发酵4h；控制发酵温度为39℃，发酵10h；控制发酵温度为32℃，发酵2d；发酵结束后回收固定化酒曲用于第二轮发酵；发酵醪液进行蒸馏，在酒度为30度时停止蒸馏，馏酒温度为40℃，蒸馏后的液体为蒸馏后液体；
(2)第二轮发酵：往高粱粉浆液中加入液化酶，液化后再加入糖化酶；将150L加入液化酶和糖化酶的高粱粉浆液、250L第一轮发酵的蒸馏后液体和回收的固定化酒曲加入到发酵罐内；控制发酵温度为35℃，发酵1d；控制发酵温度为38℃，发酵8h；控制发酵温度为39℃，发酵2d；控制发酵温度为32℃，发酵2d；发酵结束后回收固定化酒曲用于第三轮发酵；发酵醪液的蒸馏同步骤(1)；
(3)第三轮发酵：将100L加入液化酶和糖化酶的高粱粉浆液、300L第二轮发酵的蒸馏后液体和回收的固定化酒曲加入到发酵罐内；控制发酵温度为35℃，发酵1d，控制发酵温度为
38℃，发酵8h，控制发酵温度为39℃，发酵2d，控制发酵温度为32℃，发酵2d；发酵结束后回收固定化酒曲用于第四轮发酵；发酵醪液的蒸馏同步骤(1)；
(4)第四轮发酵：将100L加入液化酶和糖化酶的高粱粉浆液、300L第三轮发酵的蒸馏后液体和回收的固定化酒曲加入到发酵罐内；控制发酵温度为35℃，发酵1d，控制发酵温度为
38℃，发酵8h，控制发酵温度为39℃，发酵2d，控制发酵温度为42℃，发酵5d；发酵醪液的蒸馏同步骤(1)；
(5)将第一、二、三、四轮发酵蒸馏的酒混合均匀，混合比例按体积比为1:1:3:5，得到酱香型原酒液；
所述的高粱粉浆液通过包括如下步骤的方法制备得到：高粱先用72℃的水浸泡24h再蒸煮12h；然后摊凉至高粱表面的水分完全被吹干，高粱粒与高粱粒之间无粘度，粒粒分散开来；将蒸煮摊凉的高粱与其质量3倍的水混合后用粉浆机粉浆，得到高粱粉浆液；
所述的高粱糖化液通过包括如下步骤的方法制备得到：往高粱粉浆液中先后加入液化酶、糖化酶进行液化和糖化，得到高粱糖化液。
一种固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒的方法
技术领域
[0001] 本发明属于白酒酿造领域，具体涉及一种固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒的方法。
背景技术
[0002] 酱香型白酒以其独特的口感深受广大白酒消费者的喜爱。在酱香型白酒生产过程中，酱香型小曲白酒的品质和出酒率成为衡量生产工艺好坏的主要指标。
[0003] 液态法酿造工艺改变了传统的固态法、半固态半液态法生产工艺，改变了白酒醇、酯、酸比例失调而必须经过串香或调香的定论。全液态法生产工艺不需要任何辅料和添加剂，并且减少了传统酿造的一些繁琐工艺。与传统白酒生产工艺相比，全液态法生产工艺操作简单，占地面积少，劳动强度低，投资少，节约了蒸煮燃料，减少了劳动力，提高出酒率。
[0004] 然而与固体发酵相比，液体发酵的产香物质的种类少，香味物质的浓度含量低，为促进产生香气，必须考虑液体发酵的增香工艺。固体发酵香味物质产生多的原因之一是有较大的固液界面和气液界面，液体发酵反应的界面少，因此酯类物质和醛类物质含量低。同时由于液体蒸馏时挥发酸蒸馏出的少，这就需要增加液体发酵产生酸的量。而香味物质如酸类、酯类等物质的形成与界面效应密切相关，微生物吸附在固体物质表面对其生长和代谢有影响，固液界面对酯类物质的形成等有一定的促进作用。在液体发酵时，需要提供较大的固体吸附界面，从而促进香味物质的形成。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种固定化酒曲及其制备方法，该固定化酒曲以马尾松果作为固定的载体，通过米根霉的菌丝将酒曲包裹使其固定在马尾松果的鳞片之间。本发明的目的还在于提供一种固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒的方法。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] 一种固定化酒曲的制备方法，包括如下步骤：
[0008] （1）以鳞片张开充分的马尾松果作为固定载体，将酒曲研磨成粉末喷雾到马尾松果上，然后再喷雾水。
[0009] （2）往高粱糖化液中加入蛋白胨和酵母浸膏，接种地衣芽孢杆菌进行培养得到地衣芽孢杆菌扩培菌液。
[0010] （3）将米根霉孢子和葡萄糖加到地衣芽孢杆菌扩培菌液，将其喷雾到马尾松果上培养得到固定化酒曲。
[0011] 步骤（1）中酒曲粉末和水的喷雾量优选为每个马尾松果2.5～3.5g酒曲粉末和1.5～2.5mL水；更优选的，每个马尾松果3g酒曲粉末和2mL水。
[0012] 步骤（2）中所述的蛋白胨和酵母的加入量优选为高粱糖化液质量的0.1～2%和0.1～1%；更优选的，蛋白胨和酵母的加入量为高粱糖化液质量的1%和0.5%。
[0013] 步骤（2）中所述的培养条件优选为30～37℃培养20～28h；更优选的，培养条件为37℃培养28h。
[0014] 步骤（3）优选为：将米根霉孢子和葡萄糖加到地衣芽孢杆菌扩培菌液中，调整孢子的浓度为1.5-2.5×108个/mL、葡萄糖的浓度为0.05-0.2g/mL。将含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液喷雾到马尾松果上，喷液量为每个松果2.5-3.5mL。28-32℃培养20-30h后再喷雾含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液，喷液量为每个松果
1.5-2.5mL，28-32℃培养30-35h得到固定化酒曲。更优选的，步骤（3）为：将米根霉孢子和葡萄糖加到地衣芽孢杆菌扩培菌液中，调整孢子的浓度为2×108个/mL、葡萄糖的浓度为
0.1g/mL。将含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液喷雾到马尾松果上，喷液量为每个松果3mL。30℃培养24h后再喷雾含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液，喷液量为每个松果2mL，30℃培养32h得到固定化酒曲。
[0015] 一种固定化酒曲，通过上述方法制备得到。
[0016] 所述的固定化酒曲在固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒中的应用。
[0017] 一种固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒的方法，包括如下步骤：
[0018] （1）第一轮发酵：将高粱糖化液和上述固定化酒曲加到发酵罐中进行发酵，发酵结束后回收固定化酒曲留用于第二轮发酵，发酵缪液进行蒸馏，蒸馏所得酒用于最后的调配，蒸馏后的液体为蒸馏后液体。
[0019] （2）第二轮发酵：往高粱粉浆液中加入液化酶，液化后再加入糖化酶，与第一轮发酵的蒸馏后液体和回收的固定化酒曲一起加到发酵罐内进行第二轮发酵，发酵结束后的操作同步骤（1）。
[0020] （3）按照第二轮发酵的方法再继续发酵多轮，将各轮发酵蒸馏所得的酒进行调配。
[0021] 步骤（1）中所述的固定化酒曲的加入量优选为每100mL高粱糖化液4～6个；更优选的，每100mL高粱糖化液5个。
[0022] 步骤（1）中所述的蒸馏优选为：在酒度为30度时停止蒸馏，馏酒温度为38-40℃。
[0023] 步骤（2）中的高粱糖化液与蒸馏后液体的体积比优选为1～2:2～3。
[0024] 所述的固定化液体发酵生产具有酱香风味白酒的方法发酵的总轮数优选为四轮。
[0025] 上述高粱粉浆液或高粱糖化液通过包括如下步骤的方法制备得到：将蒸煮摊凉的高粱与水混合后用粉浆机粉浆，得到高粱粉浆液。往高粱粉浆液中先后加入液化酶、糖化酶进行液化和糖化，得到高粱糖化液。更优选的，通过包括如下步骤的方法制备得到：高粱先用72℃的水浸泡24h再蒸煮12h；然后摊凉至高粱表面的水分完全被吹干，高粱粒与高粱粒之间无粘度，粒粒分散开来。将蒸煮摊凉的高粱与其质量3倍的水混合后用粉浆机粉浆，得到高粱粉浆液。往高粱粉浆液中加入液化酶，煮沸30min，冷却到60℃后再加入糖化酶，于60℃保温1h，得到高粱糖化液。
[0026] 本发明具有如下优点和有益效果：本发明通过利用新型的天然固定介质马尾松果来固定酒曲，达到增香的目的，生产具有酱香风味特点的白酒。用天然的马尾松果作为固定的载体，用米根霉的菌丝包裹酒曲达到固定酒曲和糖化第一轮发酵原料、减少液化酶和糖化酶用量的目的；后面发酵能重复利用固定的酒曲，通过工艺控制增加风味的产出，并形成一定的宜人焦糊味，有利于形成新的产品特色。
具体实施方式
[0027] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0028] 实施例1
[0029] 1、原料和设备
[0030] 高粱为东北高粱。蒸煮锅、摊凉机等设备购自良荣机械。酱香型高温大曲购自梁山长久生物制曲有限公司。粉浆机购自曲阜市圣鲁机械厂。壶式蒸馏器购自新乡市圣达轻工机械有限公司。液化酶（4万U/mL）、糖化酶（10万U/mL）购自山东龙元生物工程有限公司。地衣芽孢杆菌和米根霉购自中国典型培养物保藏中心。马尾松果为湖北十堰地区收购的当地马尾松果。粉末喷雾器喷洒机购自青岛欧菲科贸易有限公司。液体喷雾器购自台州市欧德尔进出口有限公司。
[0031] 2、发酵
[0032] 2.1 高粱的蒸煮和摊凉
[0033] 高粱先用72℃的水浸泡24h，再在蒸煮锅内蒸煮12h。蒸煮的高粱用摊凉机摊凉至室温，并且让摊凉的粮食再返回到摊凉机反复摊凉6次，直到高粱表面的水分完全被吹干，高粱粒与高粱粒之间无粘度，粒粒分散开来。
[0034] 2.2 粉浆和糖化液制备
[0035] 将蒸煮摊凉的高粱与其质量3倍的自来水混合后用粉浆机粉浆，得到高粱粉浆液。
[0036] 往500kg高粱粉浆液中加入0.8L液化酶，煮沸30min，冷却到60℃后再加入0.9L糖化酶，于60℃保温1h，用30目筛网过滤，得到高粱糖化液。
[0037] 2.3 载体制备和固定化酒曲
[0038] 鳞片张开充分的马尾松果作为固定载体。将酱香型高温大曲研磨成粉末，过20目筛，过筛的大曲粉末加入到粉末喷雾器喷洒机中。马尾松果的鳞片张开方向向上在空隙直径为3cm、空隙间隔为7cm的铁丝网上排列，排列好后，开始喷雾，喷雾的剂量为每个马尾松果约3g大曲粉末。喷雾大曲粉末后，再用液体喷雾器喷雾自来水，喷雾量为每个马尾松果约2mL自来水。
[0039] 地衣芽孢杆菌的培养：往高粱糖化液加入其质量1%的蛋白胨和其质量0.5%的酵母浸膏，然后接种地衣芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌的接种量为每100mL接入3接种环（接种环直径约0.3cm）的菌体，37 ℃培养28h得到地衣芽孢杆菌扩培菌液。
[0040] 米根霉接种到PDA培养基上30℃培养3d。将米根霉的孢子和葡萄糖加到地衣芽孢杆菌扩培菌液中，调整孢子的浓度为2×108个/mL、葡萄糖的浓度为0.1g/mL。用液体喷雾器喷雾含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液到马尾松果上，喷液量为每个松果约3mL。把马尾松果转移到培养室内，30℃培养24h后再喷雾含有米根霉孢子和葡萄糖的地衣芽孢杆菌扩培菌液，喷液量为每个松果约2mL，30℃再培养32h得到固定化球体（固定化酒曲）。此时，米根霉的菌丝网已经完全包裹马尾松果，酒曲被固定在马尾松果实的鳞片之间。
[0041] 2.4 第一轮发酵
[0042] 将高粱糖化液和固定化球体加入到发酵罐中，固定化球体的加入量为每100mL高粱糖化液5个马尾松果，发酵罐内的高粱糖化液为400L，发酵罐总体积为500L，在发酵罐的管口有筛网，网孔为直径为2cm的圆形孔。控制发酵温度为35℃，发酵2d；控制发酵温度为38℃，发酵4h；控制发酵温度为39℃，发酵10h；控制发酵温度为32℃，发酵2d。从发酵罐底部放出醪液，固定化球体仍然在发酵罐内。通过温度变化，首先35℃发酵利于菌体增殖并且各个菌体达到一定比例，控制发酵温度为39℃在高温之下发酵利于增加酱香成分，控制发酵温度为32℃让芽孢杆菌再次增殖，形成优势菌，促进产香。
[0043] 发酵醪液进行下一步蒸馏，固定化球体留在发酵罐内继续进行第二轮发酵（第一至四轮发酵均在同一发酵罐内）。往壶式蒸馏器内加入2500mL发酵醪液进行蒸馏，在酒度为30度时停止蒸馏，馏酒温度为40℃，蒸馏后的液体为蒸馏后液体。
[0044] 2.5 后三轮发酵
[0045] 往高粱粉浆液中加入液化酶，80℃液化20min后冷却到30℃，加入糖化酶。液化酶和糖化酶的加入量为每100L高粱粉浆液加0.3L液化酶和0.2L糖化酶。将150L加入液化酶和糖化酶的高粱粉浆液和250L第一轮发酵的蒸馏后液体加入到发酵罐内。控制发酵温度为35℃，发酵1d；控制发酵温度为38℃，发酵8h；控制发酵温度为39℃，发酵2d；控制发酵温度为32℃，发酵2d。从发酵罐底部放出醪液，固定化球体留在发酵罐内，此为第二轮发酵。发酵醪液蒸馏同2.4。
[0046] 往高粱粉浆液中加入液化酶，80℃液化20min后冷却到30℃，加入糖化酶。液化酶和糖化酶的加入量为每100L高粱粉浆液加0.3L液化酶和0.2L糖化酶。将100L加入液化酶和糖化酶的高粱粉浆液和300L第二轮发酵的蒸馏后液体加入到发酵罐内。控制发酵温度为35℃，发酵1d，控制发酵温度为38℃，发酵8h，控制发酵温度为39℃，发酵2d，控制发酵温度为32℃，发酵2d。从发酵罐底部放出醪液，固定化球体留在发酵罐内，此为第三轮发酵。发酵醪液蒸馏同2.4。
[0047] 往高粱粉浆液中加入液化酶，80℃液化20min后冷却到30℃，加入糖化酶。液化酶和糖化酶的加入量为每100L高粱粉浆液加0.3L液化酶和0.2L糖化酶。将100L加入液化酶和糖化酶的高粱粉浆液和300L第三轮发酵的蒸馏后液体加入到发酵罐内。控制发酵温度为35℃，发酵1d，控制发酵温度为38℃，发酵8h，控制发酵温度为39℃，发酵2d，控制发酵温度为42℃，发酵5d。从底部放出醪液，此为第四轮发酵。发酵醪液蒸馏同2.4。
[0048] 2.6 调配
[0049] 将第一、二、三、四轮发酵蒸馏的酒混合均匀，混合比例（体积比）为1:1:3:5，得到酱香型的原酒液，酱香型原酒液的酒质评价、各轮发酵蒸馏所得酒的酒质评价及四甲基吡嗪含量见表1-5。四甲基吡嗪含量测定的方法见文献：任学坤, 殷微微, 徐文平, 李小为, 高凤文。气相色谱法测定白酒功能性成分四甲基吡嗪，酿酒科技，2011年10期。
[0050] 表1 酱香型原酒液的酒质评价
[0051]颜色 挂杯性 香味 口感
清澈 明显可见挂杯 有酱香味，略有宜人焦香味 醇厚绵长
[0052] 表2 第一轮发酵的酒质评价及四甲基吡嗪含量
[0053]颜色 挂杯性 香味 口感 四甲基吡嗪
清澈 明显可见挂杯 酱香味不明显 略微生涩 0.16g/L
[0054] 表3 第二轮发酵的酒质评价及四甲基吡嗪含量
[0055]颜色 挂杯性 香味 口感 四甲基吡嗪
清澈 明显可见挂杯 略有酱香味，呈现焦糊味，苦味不足 醇净 0.18g/L
[0056] 表4 第三轮发酵的酒质评价及四甲基吡嗪含量
[0057]颜色 挂杯性 香味 口感 四甲基吡嗪
清澈 明显可见挂杯 酱香味明显，焦糊味明显，苦味增加 醇香 0.20g/L
[0058] 表5 第四轮发酵的酒质评价及四甲基吡嗪含量
[0059]颜色 挂杯性 香味 口感 四甲基吡嗪
清澈 明显可见挂杯 苦味大，焦糊大 绵长 0.21g/L
[0060] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
